周天碩，趙家圓,2，孟彩云，李艷青，李 鶴*，韓 齊,*

（1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 大慶 163319；2.黑龍江省安心食品集團(tuán)有限責(zé)任公司，黑龍江 大慶 163319；3.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江 大慶 163319）

發(fā)酵肉制品是指原料肉經(jīng)微生物發(fā)酵（主要是乳酸菌及酵母菌等）和酶共同作用下發(fā)生一系列物理、化學(xué)及生物變化，最終形成具有特殊風(fēng)味、色澤和質(zhì)地的一類(lèi)肉制品[1]，具有高營(yíng)養(yǎng)、高品質(zhì)、風(fēng)味獨(dú)特及貯存期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)。肉制品發(fā)酵過(guò)程中蛋白質(zhì)發(fā)生變性和降解，生成醇類(lèi)、酸類(lèi)、氨基酸、短肽、肽段等大量生物活性成分，有助于提高蛋白質(zhì)的吸收率，加快人體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用[2-3]。本文主要闡述發(fā)酵肉制品中的生物活性肽及其制備方法。

1 生物活性肽

生物活性肽是一類(lèi)對(duì)人體有益或具有特定生理功能的肽類(lèi)化合物[4]，分子質(zhì)量一般小于6 000 Da，由20 種天然氨基酸按照不同的排列方式組成，一般長(zhǎng)度為2～30 個(gè)氨基酸[5]，易消化吸收，是對(duì)人機(jī)體具有積極影響的特定蛋白質(zhì)片段[6]，對(duì)人體的生理代謝活動(dòng)具有多種生物學(xué)功能，如免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗氧化、降血壓、降血脂等[7-8]。

生物活性肽的功能活性取決于其結(jié)構(gòu)，如氨基酸的組成、N端和C端氨基酸的類(lèi)型、肽鏈的長(zhǎng)度、氨基酸的電荷特性、疏水和親水性及空間結(jié)構(gòu)等。例如，C端氨基酸的結(jié)構(gòu)可影響對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（angiotensin converting enzyme，ACE）的抑制活性，當(dāng)C端氨基酸為芳香族氨基酸時(shí)，其抑制活性最高。N端為疏水性氨基酸或堿性氨基酸時(shí)的抑制活性較高，脯氨酸除外。根據(jù)氨基酸序列的不同，這些肽可能在體內(nèi)發(fā)揮多種不同的活性作用，從而影響心血管、內(nèi)分泌、消化、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)等[9]。迄今為止，具有免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗血栓、阿片類(lèi)、礦物質(zhì)結(jié)合、抗氧化、抗高血壓及降膽固醇等功能的生物活性肽已在一系列食品中發(fā)現(xiàn)。

2 發(fā)酵肉制品中多肽的生物活性

2.1 抗氧化活性

肉類(lèi)蛋白一直以來(lái)都被認(rèn)為是獲得抗氧化肽的良好來(lái)源，因?yàn)槿忸?lèi)蛋白中含有大量必需氨基酸，可滿(mǎn)足人體生長(zhǎng)所需。大量研究表明，從肌肉蛋白源中得到的生物活性肽具有抗氧化活性。此外，還有大量研究發(fā)現(xiàn)大部分肉類(lèi)副產(chǎn)物，如皮、骨頭、血液等也具有一定的生理活性。谷胱甘肽是一種含γ-酰胺鍵和巰基，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸通過(guò)肽鍵縮合而成的三肽化合物，具有抗氧化作用，廣泛分布于動(dòng)植物中[10]。谷胱甘肽在未加工的肉中含量為50～200 mg/kg[11]。Chen Wei等[12]發(fā)現(xiàn)，磷脂過(guò)氧化氫谷胱甘肽過(guò)氧化物酶是肌肉組織中重要的抗氧化酶，對(duì)肉類(lèi)品質(zhì)性狀和抗氧化離子機(jī)制起著重要作用。天然肌肽一般大量存在于動(dòng)物的肌肉和腦組織中。Bellia等[13]研究證實(shí)，肌肽具有較好的抗氧化能力，發(fā)現(xiàn)在畜類(lèi)肉源中以豬、牛、羊?yàn)榇淼募∪庵泻^高含量的肌肽。葉春等[14]以酸肉為原材料，提取酸肉中的活性肽并對(duì)其抗氧化能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，提取的活性肽對(duì)1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基有良好的清除能力，半抑制質(zhì)量濃度（IC50）為247.96 μg/mL，是抗氧化劑二丁基羥基甲苯（butylated hydroxytoluene，BHT）的4.97 倍，對(duì)羥自由基也具有較好的清除能力，IC50為33.60 μg/mL，是BHT的1.52 倍。吳寶森等[15]從諾鄧火腿中分離得到具有抗氧化活性的肽，通過(guò)體外抗氧化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離得到的組分C3體外抗氧化活性最強(qiáng)，質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，羥自由基清除率、DPPH自由基清除率和Fe2+螯合能力分別可以達(dá)到73.01%、51.21%和65.23%。通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，游離氨基酸及氨基酸序列對(duì)肽的抗氧化活性起著至關(guān)重要的作用[16]。

2.2 ACE抑制活性

ACE抑制肽是一種存在于蛋白質(zhì)中的生物活性肽，根據(jù)作用機(jī)理可將ACE抑制肽分為3 類(lèi)[17]：1）底物型肽，是一種能被ACE水解成活性或非活性肽的肽段，只具有少量的抑制活性；2）真抑制型肽，是一種具有抑制能力的肽，不受其他因素的影響，即真正能夠抑制酶的反應(yīng)；3）藥物前抑制劑，這種肽是ACE或消化酶的底物，水解后釋放抑制劑，從而起到抑制作用。Arihara等[18]從家畜肌肉蛋白（豬骨骼肌蛋白的熱裂解酶）中提取并鑒定出2 種ACE抑制肽（肌肽A和肌肽B），2 種ACE抑制肽在肌球蛋白重鏈的一級(jí)結(jié)構(gòu)中存在。研究結(jié)果表明，肌肉蛋白經(jīng)酶解可產(chǎn)生ACE抑制活性。Dellafiora等[17]通過(guò)將成熟18、24 個(gè)月的帕爾馬干腌火腿體外消化，從中得到部分生物活性肽，經(jīng)檢測(cè)已確認(rèn)為ACE抑制肽。韓冬雪[19]從牛里脊肉中分離出具有ACE抑制活性的多肽，同時(shí)具有抗高血壓生物活性。李星云等[20]的研究表明，酶解法水解豬骨骼肌蛋白可產(chǎn)生ACE抑制肽，發(fā)酵豬肉制品中也可以產(chǎn)生具有ACE抑制活性和抗高血壓功效的肽。丁苗[21]從發(fā)酵20 d的酸肉中提取得到粗肽并分離純化，得到具有較高活性的ACE抑制劑，ACE抑制率為59.18%，肽含量為86.54%，同時(shí)發(fā)現(xiàn)酸肉ACE抑制肽具有很強(qiáng)的吸濕性和較強(qiáng)的pH值穩(wěn)定性，但高溫處理后，ACE抑制肽活性下降。

2.3 抗菌活性

抗菌肽是生物體內(nèi)經(jīng)外源物質(zhì)誘導(dǎo)而產(chǎn)生的具有生物活性的小分子多肽，由12～60 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，大多數(shù)抗菌肽具有分子質(zhì)量小、熱穩(wěn)定性和廣譜抗菌等特點(diǎn)[22-23]，是一類(lèi)普遍存在于生物體內(nèi)的小分子多肽，可從肌肉、肝臟及血液中分離出來(lái)[24]。天然生物抗菌肽具有抑菌效果好、不易產(chǎn)生耐藥性、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)?？咕淖鳛樘烊槐ｕr劑對(duì)人體健康無(wú)害，是繼冷藏保鮮和氣調(diào)保鮮后的第3代保鮮技術(shù)。劉輝[25]利用抑耐冷菌乳酸菌抗菌肽對(duì)肉制品的保鮮進(jìn)行研究，從乳酸菌發(fā)酵液中分離純化得到2 種抗菌肽，均可以有效抑制熒光假單胞菌，并且抗菌肽活力越高，保鮮效果越好。清酒乳桿菌清酒亞種2a[26]是從巴西豬肉香腸中分離得到的一種具有抗菌功能的乳酸菌，其產(chǎn)生的抗菌肽（細(xì)菌素）能夠抑制重要食源性致病菌的生長(zhǎng)，研究發(fā)現(xiàn)，將提取出的抗菌肽在室溫（30 ℃）和冷藏條件（7 ℃）下培養(yǎng)24 h后，能有效抑制單核細(xì)胞增生李斯特菌的生長(zhǎng)，在冷藏條件下，病源性微生物經(jīng)抗菌肽處理5 d后失活。

2.4 神經(jīng)活性

目前，在發(fā)酵肉制品中對(duì)于神經(jīng)活性肽的研究還比較少。因?yàn)樯窠?jīng)活性肽，如阿片樣肽（內(nèi)啡肽和腦啡肽等）、舒緩激肽等一般存在于動(dòng)物的胰腺及大腦中。Ianzer等[27]從動(dòng)物大腦中分離出阿片樣肽類(lèi)似物，通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)這類(lèi)肽具有一定的神經(jīng)活性，還能夠加強(qiáng)血管舒緩激肽活性。因此猜測(cè)這是由于阿片樣肽序列存在于肌肉蛋白質(zhì)氨基酸序列上，所以肌肉中也可能產(chǎn)生阿片樣肽，目前有待研究。

3 發(fā)酵肉制品中生物活性肽的制備方法

目前關(guān)于生物活性肽的制備方法主要分為3 類(lèi)[28]：提取法、合成法和降解法。提取法可分為化學(xué)提取和物理提取。合成法又可分為化學(xué)合成法和基因重組法。降解法分為酶解法和發(fā)酵法。發(fā)酵肉制品一般采用降解法來(lái)制備生物活性肽，即酶法混合微生物發(fā)酵法制備生物活性肽。一些研究嘗試?yán)没蛑亟M技術(shù)獲得特定表達(dá)的活性肽，但目前該方法尚在實(shí)驗(yàn)中。

3.1 酶解法

蛋白水解酶的分類(lèi)方法有多種，根據(jù)蛋白酶活性部位的性質(zhì)可分為4 類(lèi)[29]：絲氨酸蛋白酶、巰基蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶。根據(jù)生理功能又可分為非限制性水解蛋白酶和限制性水解蛋白酶。根據(jù)國(guó)際酶學(xué)委員會(huì)分類(lèi)，蛋白水解酶屬于3.4亞類(lèi)，可分為肽段內(nèi)切酶和外肽酶[30]。

Koohmaraie[31]將蛋白質(zhì)水解系統(tǒng)概括為4 種，分別為鈣激活中性蛋白酶水解、組織蛋白酶水解、蛋白酶體水解和半胱天冬酶水解。卜冬冬等[32]以薩拉米為原料進(jìn)行酶法水解，發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶的酶解效果最佳，水解度為11.0%；木瓜蛋白酶的酶解效果次之，水解度為9.7%；復(fù)合酶的酶解效果優(yōu)于單個(gè)酶的酶解效果，水解度為12.9%。并且溫度對(duì)蛋白酶的活性具有較大影響，隨著酶解溫度的增加，水解度先升高后降低，這是因?yàn)楫?dāng)溫度較高時(shí)，部分酶失活，導(dǎo)致水解不完全。

3.2 微生物發(fā)酵法

微生物發(fā)酵法是利用微生物在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的蛋白酶將底物蛋白水解成不同的生物活性肽。目前，常采用的微生物有側(cè)孢短芽孢桿菌、植物乳桿菌、清酒乳桿菌和彎曲乳桿菌等[33-36]，底物蛋白主要為豬肉的肌漿蛋白和肌原纖維蛋白等[36]。Castellano等[36]對(duì)豬肉中的蛋白質(zhì)進(jìn)行發(fā)酵降解，結(jié)果表明，乳桿菌能夠降解肌肉蛋白質(zhì)產(chǎn)生具有ACE抑制活性的活性肽，通過(guò)釋放ACE抑制肽，可產(chǎn)生降壓效果；清酒乳桿菌CRL1862和彎曲乳桿菌CRL705產(chǎn)生的生物活性肽均可用于開(kāi)發(fā)生理功能食品。

3.3 酶解法-微生物發(fā)酵法復(fù)合

蛋白質(zhì)是肉制品的重要組成成分，其在加工和貯藏中發(fā)生的生物化學(xué)變化對(duì)肉制品品質(zhì)有關(guān)鍵性影響，酶法水解和微生物發(fā)酵法是發(fā)酵肉制品中制備生物活性肽的主要方法。利用蛋白酶制劑水解蛋白質(zhì)并分離純化得到生物活性肽，其產(chǎn)品安全性高、生產(chǎn)條件溫和、水解過(guò)程易控制、可定位生產(chǎn)特定的肽、成本低，同時(shí)還具有良好的溶解性、耐酸、耐熱及較高的速溶性等優(yōu)點(diǎn)[37]。利用微生物發(fā)酵降解蛋白得到的生物活性肽，具有菌體蛋白互相利用提供能量、合成小肽、修飾某些功能基團(tuán)等優(yōu)點(diǎn)[38]。除此之外，微生物代謝是一個(gè)復(fù)雜的降解體系，可以合成多種復(fù)雜的初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物[39]，制備得到的生物活性肽水解度更高[40]。2 種降解方式共同作用，可彌補(bǔ)單一方法存在的不足。

發(fā)酵肉制品蛋白質(zhì)的降解是內(nèi)源蛋白酶和微生物共同作用的結(jié)果。微生物發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸導(dǎo)致內(nèi)源酸性蛋白酶活性增加，促使微生物胞外酶、蛋白酶等降解蛋白質(zhì)[41-42]，生成一些多肽、小肽、氨基酸、醛、有機(jī)酸和胺類(lèi)等物質(zhì)，這些都是發(fā)酵肉制品特殊風(fēng)味和質(zhì)地形成的主要因素[43-44]。除此之外，陳倩等[45]在肉制品發(fā)酵過(guò)程中發(fā)現(xiàn)乳酸菌代謝產(chǎn)物可促進(jìn)蛋白質(zhì)的降解，植物乳桿菌能降解肌漿蛋白和肌原纖維蛋白，清酒乳桿菌可分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生游離氨基酸，賦予產(chǎn)品特有的鮮酸味[46]。

4 生物活性肽的純化方法

蛋白質(zhì)降解后的產(chǎn)物是多肽混合物，因此對(duì)混合物進(jìn)行分離提純至關(guān)重要。最常見(jiàn)的肽類(lèi)純化方法有超濾、反相高效液相色譜、凝膠過(guò)濾層析及離子交換色譜等。

超濾是一種膜分離技術(shù)，通過(guò)壓力作用使混合肽按照分子質(zhì)量通過(guò)一定孔徑的薄膜，小分子肽通過(guò)薄膜[47]，而大分子肽遺留在薄膜上，從而分離出所需要分子質(zhì)量的肽。超濾方法簡(jiǎn)單、成本低、常溫下即可操作，但如混合物中雜質(zhì)過(guò)多會(huì)導(dǎo)致超濾薄膜堵塞，需要經(jīng)常清洗，且不適用于分離分子質(zhì)量大小相近的混合肽。反相高效液相色譜常用于多肽類(lèi)和其他代謝產(chǎn)物的特性分析中，它是利用極性介質(zhì)作為固定相進(jìn)行離子交換的一種方法，不同規(guī)格色譜適應(yīng)不同肽類(lèi)，且柱容量較大，分離效果強(qiáng)，但分離過(guò)程中色譜柱容易被堵塞，因此會(huì)導(dǎo)致分離結(jié)果出現(xiàn)誤差[48-49]。凝膠過(guò)濾層析法是根據(jù)凝膠網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)進(jìn)行的一種分離方法，多用于分離純化水溶性大分子物質(zhì)，不需要有機(jī)溶劑，具有較好的分離效果和較高的回收率[50]。離子交換色譜是利用溶質(zhì)分子攜帶不同性質(zhì)的電荷和不同的電荷量從而實(shí)現(xiàn)分離的一種色譜技術(shù)[51]，它具有可控性、多選擇性、可濃縮性、高載量和高回收率，通過(guò)相反電荷之間的相互作用實(shí)現(xiàn)離子交換，因此可通過(guò)調(diào)節(jié)pH值來(lái)控制選擇性。

都榮強(qiáng)等[52]采用膜超濾法分離由胰蛋白酶、風(fēng)味酶、混合酶酶解肌肉蛋白所得酶解液，發(fā)現(xiàn)酶解液中各組分的呈味強(qiáng)度均隨肽分子質(zhì)量的減小而增強(qiáng)，當(dāng)肽分子質(zhì)量小于3 kDa時(shí)，味鮮醇厚，特別是小于1 kDa的肽鮮味最強(qiáng)；同時(shí)利用Sephadex G-15凝膠色譜分離，通過(guò)高效凝膠液相色譜、基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜分析，確定從胰蛋白酶酶解液中分離得到的鮮味肽組分。

Kang等[53]采用反相高效液相色譜法對(duì)牛肉酶解物進(jìn)行分離純化，得到多種風(fēng)味肽。胡亞亞[54]采用凝膠層析法對(duì)火腿粗肽液進(jìn)行簡(jiǎn)單分離，并對(duì)各組分清除自由基的能力進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，當(dāng)火腿粗肽液質(zhì)量濃度為1 mg/mL時(shí)，超氧陰離子自由基清除率為49%，DPPH自由基清除率為38%。戴璐瑤等[55]利用反相高效液相色譜紫外檢測(cè)與離子交換色譜電導(dǎo)檢測(cè)2 種方法對(duì)牛肉中肌肽進(jìn)行一致程度檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，反相高效液相色譜法與離子交換色譜方法均能較好地對(duì)樣品中的肌肽進(jìn)行定性和定量分析。郭鑫杰[56]、姚婷婷[57]等均通過(guò)離子交換層析法對(duì)抗菌肽進(jìn)行純化，從而得到高純度的抗菌肽。

5 結(jié) 語(yǔ)

肉及肉制品中的蛋白質(zhì)含有多種有利于人體健康的生物活性肽，其功能特性包括抗氧化、降血壓、降血脂、抗血栓、抑菌、神經(jīng)調(diào)節(jié)等多方面。由于其具有多種優(yōu)勢(shì)而受到越來(lái)越多國(guó)內(nèi)外研究人員的關(guān)注，國(guó)外研究人員對(duì)生物活性肽在醫(yī)療方面的應(yīng)用給予極高的肯定，特別是對(duì)過(guò)敏反應(yīng)，因?yàn)槠淇赡鼙Ａ舨糠智绑w蛋白過(guò)敏活性，并且生物活性肽還具備成為治療非傳染性疾?。ㄈ绺哐獕汉兔庖咝约膊。┑臐撛谒幬颷58]。

我國(guó)對(duì)生物活性肽的研究，尤其是肉制品中生物活性肽的研究相對(duì)較少，因此肉源生物活性肽的發(fā)展還有很大空間。且現(xiàn)階段多數(shù)國(guó)內(nèi)研究都僅限于活性肽功能特性的體外評(píng)估，不足以評(píng)估其消化后在人體中的活性。在作為功能性成分使用之前，有必要對(duì)其在體內(nèi)的療效、劑量反應(yīng)和安全性進(jìn)行評(píng)估。所以，在未來(lái)，我國(guó)研究人員應(yīng)加強(qiáng)生物活性肽在應(yīng)用方面的研究，深入研究以益生菌為發(fā)酵劑發(fā)酵的肉制品中可能產(chǎn)生的生物活性肽。