崔雅溦，劉 軍，董桂芝，雷勝明，孟憲水，劉云國

（1.新疆大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，新疆 烏魯木齊 830046；2.臨沂大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 臨沂 276000；3.平陰玫瑰研究所，山東 平陰 250407；4.濟(jì)南紫金玫瑰股份有限公司，山東 平陰 250400）

玫瑰果（Rosa caninaL.）是薔薇屬植物的果實，在許多地區(qū)被用作藥物或者藥物補(bǔ)充劑。例如，羅馬尼亞人將其當(dāng)作是維生素A和維生素C的輔助食品[1]；土耳其人也將其當(dāng)作是主要的草本植物[2]；我國關(guān)于玫瑰果藥效的記載最早出現(xiàn)在距今兩千多年的《神農(nóng)本草經(jīng)》中[3]。玫瑰果的顏色呈鮮紅色，是玫瑰花凋謝之后由花托發(fā)育而成的肉質(zhì)漿果[4]，是公認(rèn)的富含維生素C的植物[5]。不僅如此，玫瑰果中的酚類化合物和礦物質(zhì)含量都很高，這也使得玫瑰果成為了良好的保健品原料。

格瓦斯（Kvass）是東歐的一種傳統(tǒng)飲料，通常由黑麥或者黑麥面包通過自然發(fā)酵而成[6]。該飲料通過未完成酒精和乳酸混合發(fā)酵獲得。它是一種無酒精或低酒精的飲料，其酒精度一般不超過1.5%vol[7]，但大部分文獻(xiàn)報道說不能超1.2%vol[8]。格瓦斯富含人體所需的多種營養(yǎng)成分[9-10]，格瓦斯中含有鈣、磷、鎂、鐵、鋅、高鉀、低鈉、和硒等礦物質(zhì)。作為發(fā)酵產(chǎn)品，格瓦斯還富含大量酚類化合物，這些酚類和黃酮類化合物具有抗氧化劑和自由基清除劑的作用，也被認(rèn)為能夠預(yù)防癌癥、腫瘤、糖尿病、衰老和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[11]。同時，格瓦斯也是生物活性肽的來源，通過蛋白水解培養(yǎng)物發(fā)酵釋放。因此格瓦斯也是潛在的保健食品，它能改善消化、內(nèi)分泌、心血管、免疫和神經(jīng)系統(tǒng)疾病[12]。最近有研究表明，格瓦斯對于脾胃虛寒型胃潰瘍導(dǎo)致的胃粘膜損傷有一定的拮抗作用，能有效修復(fù)胃部損傷，緩解胃潰瘍現(xiàn)象[13]。此外，作為一種乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)物，格瓦斯也具有調(diào)節(jié)腸道，防止病原菌繁殖和改善新陳代謝的作用[14]。

近年來，由于消費(fèi)者口味的變化和對新品發(fā)酵飲料感官的尋求，越來越多的人喜歡飲用低醇飲料。研究表明，低醇飲料不僅不會造成酒精的攝入過量，還可以促進(jìn)營養(yǎng)成分（B族維生素、礦物質(zhì)和酚類物質(zhì)）的吸收[15]。因此國內(nèi)外開始對混菌發(fā)酵低醇飲料進(jìn)行了大量的研究，尤其是酵母行業(yè)。一些研究表明，使用非釀酒酵母混合釀酒酵母發(fā)酵不僅有助于降低乙醇含量，而且它能產(chǎn)生更佳復(fù)雜的“風(fēng)味表型”，據(jù)報道，非釀酒酵母能夠產(chǎn)生超過1 300種揮發(fā)性化合物[16-17]。因此非釀酒酵母對產(chǎn)品來說非常重要，這些獨特感官就是每種產(chǎn)品的典型特征[18-19]。目前，使用單一釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）接種發(fā)酵已經(jīng)成為現(xiàn)代釀造業(yè)的普遍做法，這樣做雖然保證了快速可靠的發(fā)酵過程，但是這也導(dǎo)致了發(fā)酵產(chǎn)品風(fēng)味單一缺點[20]。研究表明，如果在釀造過程中引入非釀酒酵母可能會對格瓦斯的風(fēng)味產(chǎn)生一些積極的影響[21]。

本試驗以玫瑰果和兩種麥芽為主要原料，接入庫德里阿茲威畢赤酵母、釀酒酵母和植物乳桿菌進(jìn)行發(fā)酵。采用單因素及響應(yīng)面試驗設(shè)計，以酒精度和總酸含量為評價指標(biāo)，進(jìn)行發(fā)酵工藝優(yōu)化。為玫瑰果格瓦斯產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大麥芽、焦香麥芽：淄博塔斯曼釀酒原料有限公司；玫瑰果：濟(jì)南紫金玫瑰有限公司；α-淀粉酶（3 700 U/g）、正丁醇標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）：北京索萊寶科技有限公司；糖化酶（10萬U/g）：阿拉丁生物試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蔗糖：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）（SC）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）（LP）、庫德里阿茲威畢赤酵母（Pichia kudriavzevii）（PK）：臨沂大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品實驗室菌種庫。

1.2 儀器與設(shè)備

LC-1L拍打式無菌均質(zhì)機(jī)：青島英瑞斯特實驗儀器有限公司；Therom TSQ 8000EVO氣質(zhì)聯(lián)用儀：賽默飛世爾科技公司；固相微萃取手柄、固相微萃取裝置、65 μm PDMS/DVB手動固相微萃取頭、7890B氣相色譜儀配有氫火焰離子化檢測器（flame ionization detector，F(xiàn)ID）：安捷倫科技有限公司；HWS-24電熱恒溫水浴鍋：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；LDZX-50KBS高壓蒸汽滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；WAY（2WAJ）阿貝折光儀：上海儀電物光有限公司；PHS-3CINESApH計：上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；LC-LX-H185C 臺式高速離心：上海力辰邦西儀器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰果格瓦斯加工工藝流程與操作要點

麥汁的制備：將研磨過篩的大麥芽粉和焦香麥芽粉按7∶3的質(zhì)量比混合并加入適量的水，然后加入α-淀粉酶進(jìn)行60 ℃液化30 min，之后加入糖化酶60 ℃糖化30 min。過濾后采用121 ℃，15 min高壓滅菌處理。這樣不僅能夠殺滅其中的細(xì)菌還能使麥汁中的部分蛋白發(fā)生變性，從而有利于麥汁蛋白以可溶性的形式保留在麥汁中[22]。

玫瑰果果汁的制備：將清洗干凈的玫瑰果去蒂去籽，與水按1∶5（g∶mL）的比例，放入均質(zhì)機(jī)均質(zhì)10 min。

玫瑰果格瓦斯的制備：取150 mL麥汁，加入20%的玫瑰果果汁和3%的蔗糖。62 ℃巴氏殺菌30 min，制作成發(fā)酵原液。冷卻后將菌株按比例和用量接入發(fā)酵原液，放入26 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行發(fā)酵20 h，得到玫瑰果格瓦斯。

1.3.2 理化指標(biāo)的測定

可溶性固形物：采用阿貝折光儀進(jìn)行測定。

總酸：參考GB/T 12456—2008《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中總酸的測定》中pH電位滴定法測定[23]。

酒精度：參考GB5009.225—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)酒中乙醇濃度的測定》中氣相色譜法測定[24]。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

采用單因素試驗，初步探究原料液初始可溶性固形物含量（5°Bx、7°Bx、9°Bx、11°Bx、13°Bx），發(fā)酵溫度（20 ℃、24 ℃、28 ℃、32 ℃、36 ℃），發(fā)酵時間（16 h、18 h、20 h、22 h、24 h），接種量（2%、4%、6%、8%、10%）和菌株LP∶SC∶PK的接種比（1∶1∶1、1.50∶0.75∶0.75、0.75∶1.50∶0.75、0.75∶0.75∶1.50、1.2∶1.2∶0.6、0.6∶1.2∶1.2、1.2∶0.6∶1.2）對玫瑰果格瓦斯酒精度和總酸含量的影響。

1.3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面法

（1）Plackett-Burman試驗設(shè)計

基于單因素試驗確定5個影響因素（初始可溶性固形物含量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、接種量、接種比）的Plackett-Burman試驗的最高水平和最低水平。設(shè)計N=12的Plackett-Burman試驗設(shè)計，響應(yīng)值為酒精度和總酸含量。此外還包括6個虛擬變量（F、G、H、J、K、L），主要用于計算隨機(jī)測量誤差。通過使用Design-Expert 11.1.0.1軟件計算P值，使用隨機(jī)測量誤差來確定實際值的顯著性。添加兩個連續(xù)因子作為中心點，以評估系數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)誤差。Plackett-Burman試驗因素與水平見表1。

表1 玫瑰果格瓦斯發(fā)酵工藝優(yōu)化Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果Table 1 Results of Plackett-Burman experimental design for rosehip Kvass fermentation technology optimization

（2）Box-Behnken試驗設(shè)計

在Plackett-Burman試驗的基礎(chǔ)上，以初始可溶性固形物含量、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間為考察因素，根據(jù)Box-Behnken試驗設(shè)計原理，進(jìn)行3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗。自變量取值及其編碼見表2。

表2 玫瑰果格瓦斯工藝優(yōu)化Box-Benhnken試驗設(shè)計因素與水平Table 2 Factors and levels of Box-Benhnken experiments design for rosehip Kvass fermentation process optimization

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

所有試驗做三次平行，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；使用Microsoft Excel 2019和SPSS Statistics 26.0進(jìn)行單因素試驗的方差分析和差異性分析；使用Design-ExpertVersion 11.1.0.1軟件進(jìn)行Plackett-Burman和Box-Behnken試驗結(jié)果的分析；使用Graph Pad Prism 8.4.3制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗結(jié)果

2.1.1 初始可溶性固形物含量對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響

初始可溶性固形物含量會影響格瓦斯的總酸含量和酒精度[25]。因此，固定發(fā)酵溫度28 ℃，發(fā)酵時間24 h，接種量2%和接種比（LP∶SC∶PK）1∶1∶1，觀察不同初始可溶性固形物含量對發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖1。由圖1可知，酒精度隨初始可溶性固形物含量的增加呈現(xiàn)先增加后下降到趨勢。當(dāng)初始可溶性固形物含量達(dá)到11°Bx時，酒精度達(dá)到最大，此時酒精度為1.28%vol。這說明初始可溶性固形物含量過大會抑制酵母的生長，這與前人得出的結(jié)論一致[6]?？偹岷繘]有明顯的變化趨勢，所有試驗組的總酸在5.84～6.29 g/L的范圍內(nèi)。格瓦斯酒精度一般小于1.5%vol，但由于酒精度低于1%vol造成了發(fā)酵不充分，產(chǎn)生了濃烈的不良麥汁氣味。因此，選取7°Bx和11°Bx為Plackett-Burman試驗的高低水平。

圖1 初始可溶性固形物含量對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響Fig.1 Effects of initial soluble solid contents on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass

2.1.2 發(fā)酵溫度對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響

溫度是影響發(fā)酵制品感官評價的重要指標(biāo)，一般情況，發(fā)酵溫度控制在25～35 ℃。溫度過低，發(fā)酵時間會延長；溫度過高會縮短發(fā)酵時間，但是會降低發(fā)酵酒品質(zhì)，影響其口感[26]?；诔跏伎扇苄怨绦挝锖?°Bx，其他條件不變進(jìn)行發(fā)酵，考察不同發(fā)酵溫度對發(fā)酵的影響，結(jié)果見圖2。由圖2可知，總酸含量和酒精含量隨溫度的增加而繼續(xù)增加。當(dāng)溫度超過28 ℃之后，酒精度會超過1.5%vol，引起格瓦斯變質(zhì)。因此，選擇20 ℃和28 ℃為Plackett-Burman試驗的高低水平。

圖2 發(fā)酵溫度對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響Fig.2 Effects of fermentation temperature on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass

2.1.3 發(fā)酵時間對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響

確定初始可溶性固形物含量9°Bx，發(fā)酵溫度28 ℃，考察不同發(fā)酵時間對發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖3。由圖3可知，總酸含量和酒精度都呈上升趨勢，從16 h到24 h，總酸含量和酒精度分別增加39.4%和11.1%。整體上看溫度對這兩個影響因素影響較大。因此，選取16 h和24 h為Plackett-Burman試驗的高低水平。

圖3 發(fā)酵時間對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響Fig.3 Effects of fermentation time on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass

2.1.4 接種量對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響

其他條件不變，固定發(fā)酵時間為24 h，分別按不同的接種量進(jìn)行接種，考察接種量對試驗結(jié)果的影響，結(jié)果見圖4。由圖4可知，隨著接種量增加，總酸含量和酒精度變化不大，并且沒有明顯的變化趨勢。綜合總酸含量和酒精度，選取接種量為2%和8%為Plackett-Burman試驗的高低水平。

圖4 發(fā)酵時間對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響Fig.4 Effects of inoculum on total acid contents and alcohol contents of rosehip Kvass

2.1.5 接種比對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響

按照LP∶SC∶PK不同的接種比例進(jìn)行發(fā)酵，確定接種量為6%，其他條件不變，考察接種比對發(fā)酵結(jié)果的影響，結(jié)果見圖5。由圖5可知，當(dāng)接種比為1∶1∶1時，總酸含量達(dá)到最大，為6.12 g/L。此時酒精度較低為1.19%vol；當(dāng)接種比為0.75∶1.50∶0.75時，總酸含量最小，為4.76 g/L。此時，酒精度大于1.5%vol，格瓦斯變質(zhì)。接種比為0.6∶1.2∶1.2的組的酒精度僅次于0.75∶1.50∶0.75，此比例時總酸含量較低為4.777 g/L，僅次于接種比0.75∶1.50∶0.75的組。因此，最終選取1∶1∶1和1.2∶0.6∶1.2為Plackett-Burman試驗的高低水平。

圖5 接種比對玫瑰果格瓦斯總酸含量和酒精度的影響Fig.5 Effects of inoculation ratio on total acid content and alcohol content of rosehip Kvass

2.2 發(fā)酵工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.2.1 Plackett-Burman試驗結(jié)果分析

Plackett-Burman試驗結(jié)果見表3。利用Design-Expert 11.1.0.1軟件分別對酒精度和總酸含量進(jìn)行響應(yīng)面回歸模型方差分析，結(jié)果見表4。

表3 Plackett-Burman試驗設(shè)計結(jié)果Table 3 Results of Plackett-Burman experimental design

由表4可知，以酒精度為評價指標(biāo)，該模型極顯著（P值=0.000 1＜0.001），失擬項不顯著（P值=0.187 0＞0.05），該模型決定系數(shù)R2=97.22%，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=94.90%，說明該模型的的擬合度較好。根據(jù)F值和P值可知，初始可溶性固形物含量、發(fā)酵溫度和時間為影響格瓦斯酒精度的顯著因素。以總酸為評價指標(biāo)，該模型極非常顯著（P值=0.003 1＜0.01），失擬項不顯著（P值=0.078 9＞0.05），該模型決定系數(shù)R2=91.97%，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=85.28%?？芍四Ｐ陀幸饬x，可以用此模型對格瓦斯發(fā)酵條件進(jìn)行分析。根據(jù)F值和P值可知，影響格瓦斯總酸含量的主因素為發(fā)酵溫度和時間。綜上所述，初始可溶性固形物含量，發(fā)酵溫度和時間為此次試驗研究的主要影響因素，為下一步Box-Behnken試驗優(yōu)化建立了基礎(chǔ)。

表4 Plackett-Burman試驗結(jié)果方差分析Table 4 Analysis of variance of Plackett-Burman experiments results

2.2.2 Box-Behnken試驗結(jié)果分析

格瓦斯發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗結(jié)果見表5，回歸模型方差分析結(jié)果見表6。

表5 Ben-Behnken試驗設(shè)計結(jié)果Table 5 Results of Ben-Behnken experiments design

酒精度是格瓦斯發(fā)酵的一個關(guān)鍵因素，根據(jù)表6可知，酒精度的二次模型的F值為63.42（P＜0.001），對結(jié)果影響極顯著。失擬值的P值為0.187，表明失擬項不顯著，說明該模型合理。其次，決定系數(shù)R2=99.13%，調(diào)整決定系數(shù)R2adj=97.57%，說明此模型可以解釋97.57%的變化，擬合度非常好，可以用此模型對玫瑰果格瓦斯發(fā)酵條件進(jìn)行分析。對表5中結(jié)果進(jìn)行回歸擬合分析，得到玫瑰果格瓦斯發(fā)酵過程中酒精度含量的二次回歸方程為：

總酸含量是格瓦斯感官品質(zhì)的另一個重要指標(biāo)，總酸含量過低會使格瓦斯失去其獨特的口感，過酸又會降低格瓦斯的品質(zhì)。表6顯示了因變量和自變量之間的線性關(guān)系的重要性。該模型F值為36.35（P＜0.001），極顯著，且失擬項不顯著，表明二次回歸方程可以很好地預(yù)測響應(yīng)值。決定系數(shù)R2=98.49%；調(diào)整決定系數(shù)R2adj=95.78%，表明只有大約4.22%的總方差不能用該模型解釋。總酸含量的二次模型可以用下式表示：

表6 回歸模型方差分析Table 6 Variance analysis of regression model

一次項A、B和C三個因素對酒精度均有著極顯著影響（P＜0.001），交互項AB、二次項A2、B2和C2對酒精度的影響均顯著（P＜0.05）。一次項B、二次項C2對總酸含量影響極顯著（P＜0.001），一次項C、二次項A2對結(jié)果影響非常顯著（P＜0.01）。交互項BC和二次項B2對總酸含量影響均顯著（P＜0.05）。

圖6 各因素間交互作用對玫瑰果格瓦斯酒精度和總酸含量影響的響應(yīng)面及等高線Fig.6 Response surface plots and contour lines of effect of interaction between various factors on the alcohol content and total acid content of rosehip Kvass

格瓦斯的酒精度一般低于1.5%vol，但格瓦斯酒精度過低時，產(chǎn)品中很難產(chǎn)生醇香的味道，并且麥汁味道會過重[27]，酒精度過高時又會使產(chǎn)玫瑰果格瓦斯的酒味過重。因此在保證酒精度在1.0%vol和1.2%vol之間，這樣才能保證產(chǎn)品獲得更加濃郁的醇香。格瓦斯的酸味也是感官評價中的重要指標(biāo)，既要體現(xiàn)出乳酸的味道也不能酸味過重，因此把總酸含量定為4 g/L最好[6]。在響應(yīng)面試驗中設(shè)置總酸目標(biāo)值為4 g/L，同時設(shè)置酒精度范圍為1.0%vol～1.2%vol，根據(jù)模型計算，初始可溶性固形物含量、發(fā)酵溫度和時間的最優(yōu)值分別為8.002°Bx、26.517 ℃、20.483 h，根據(jù)實際操作條件，將其分別調(diào)整為8°Bx、26 ℃、20 h，其他條件為接種量2%，接種比為1∶1∶1。并得到此模型預(yù)測的酒精度和總酸含量分別為1.047%vol和4 g/L。

2.3 發(fā)酵工藝的驗證

為了驗證該模型是否可靠，將模型得到的最優(yōu)工藝（初始可溶性固形物含量8°Bx，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時間20 h）進(jìn)行驗證。該組試驗有6個平行，最終測得酒精度的實際值為1.09%vol，總酸含量的實際值為4.02 g/L。與理論值相差不大，由此可知，該響應(yīng)面模型有效，可以預(yù)測玫瑰果格瓦斯發(fā)酵的最佳工藝，具有一定的實踐指導(dǎo)意義。

3 結(jié)論

本研究以玫瑰果和麥芽為原料研制玫瑰果格瓦斯，通過單因素和響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計對玫瑰果格瓦斯的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。最終確定最優(yōu)發(fā)酵工藝為初始可溶性固形物含量8°Bx，發(fā)酵溫度26 ℃，發(fā)酵時間20 h，三種菌株總接種量2%，接種比為1∶1∶1。此優(yōu)化條件下，玫瑰果格瓦斯酒精度為1.09%vol，總酸含量為4.02 g/L。為玫瑰果格瓦斯的大規(guī)模生產(chǎn)提供了有力的數(shù)據(jù)支撐。