劉天宇，丁健洋，許立偉，薛桂新

（延邊大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，吉林 延吉 133000）

柑橘（Citrus reticulataBlanco）是我國南方栽培的重要果樹之一[1]，面積和產(chǎn)量較大[2]。柑橘采收后貨架期短，收獲旺季導(dǎo)致滯銷、腐爛等問題，造成資源浪費和經(jīng)濟損失。柑橘酸甜適中，汁水豐富，適合加工果醋等制品。果醋是集營養(yǎng)、保健和食療等功能為一體的新型調(diào)味品[3-4]，將柑橘加工成果醋可為其加工利用提供一條新途徑。

目前柑橘果醋的研究報道較多，主要集中在對柑橘果醋發(fā)酵條件、發(fā)酵基質(zhì)、發(fā)酵方式、風(fēng)味成分及微生物多樣性等方面。孫娜[5]采用三種發(fā)酵方式對柑橘醋發(fā)酵品質(zhì)及微生物多樣性進行了研究，結(jié)果固態(tài)發(fā)酵菌群較液態(tài)發(fā)酵豐富；楊馨悅等[6]優(yōu)化了柑橘果醋液態(tài)表面和液態(tài)深層發(fā)酵工藝；楊宇馳等[7]比較研究了一次和二次發(fā)酵對柑橘果醋品質(zhì)的影響，結(jié)果一次發(fā)酵周期比二次發(fā)酵長；王炳宇等[8]研究了不同發(fā)酵基質(zhì)柑橘果醋揮發(fā)性成分的差異。CHEN Y等[9]對混菌發(fā)酵柑橘果醋進行了研究；HU F F等[10]對柑橘果醋沉淀的化學(xué)成分、形成機理及抗增殖作用進行了研究。但有關(guān)不同醋酸菌及發(fā)酵方式對柑橘果醋品質(zhì)的影響尚少見報道。

本研究以柑橘為原料，采用滬釀1.01、AS1.41和許氏醋酸菌三種醋酸菌，通過一次發(fā)酵、二次發(fā)酵兩種發(fā)酵方式分別制備6種柑橘果醋，并通過分析這6種果醋理化指標，比較其品質(zhì)差異，旨在探討不同醋酸菌及發(fā)酵方式對柑橘果醋品質(zhì)的影響，為柑橘果醋產(chǎn)業(yè)化技術(shù)研究提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘：市售；釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）：意大利AEB公司；滬釀1.01醋酸菌：上海釀造科學(xué)研究所；AS1.41醋酸菌：中國普通微生物菌種保藏管理中心；許氏醋酸菌（Acetobacter schutzenbachii）：浙江臨海市利民化工有限公司；果膠酶（酶活50 000 U/g）：德國三顆星食品公司；食用酒精（酒精度85%vol）：牡丹江白酒廠；柑橘果酒（酒精度6%vol）、柑橘果汁（可溶性固形物為10.8°Bx）：實驗室自制。

甲醇、乙腈、冰醋酸、磷酸（均為色譜純）：北京邁瑞達有限公司；草酸、DL-酒石酸、L-乳酸、檸檬酸、L-蘋果酸、琥珀酸、沒食子酸、（+）-兒茶素、綠原酸、咖啡酸、對香豆酸、白藜蘆醇、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁、槲皮素標準品（純度均＞98%）：上海源葉生物科技有限公司；其他化學(xué)試劑（分析純及生化試劑）：天津科密歐化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S分析天平：塞多利斯（中國）科技有限公司；SX-700高壓蒸汽滅菌器：日本TOMY公司；TDZ5-WS高速離心機：湖南湘儀實驗儀器有限公司；CM-5色差儀：北京柯尼卡美能達投資有限公司；LC-2010A高效液相色譜儀、L-8900氨基酸分析儀：日本島津公司；Promosil C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：博納艾杰爾科技公司。

1.3 方法

1.3.1 醋酸菌液體培養(yǎng)基

滬釀1.01醋酸菌液體培養(yǎng)基：1%葡萄糖和1%酵母浸膏用蒸餾水溶解，121 ℃滅菌20 min，使用前加入4%食用酒精。

AS1.41醋酸菌液體培養(yǎng)基：10%葡萄糖和1%酵母浸膏用蒸餾水溶解，121 ℃滅菌20 min，使用前加入4%食用酒精。

許氏醋酸菌液體培養(yǎng)基[11]：1%葡萄糖和1%酵母膏，121 ℃滅菌20 min，使用前按體積分數(shù)3%加入無水乙醇。

1.3.2 柑橘果醋實驗設(shè)計

本實驗采用種醋酸菌及兩種發(fā)酵方式制備六種柑橘果醋，其代號及發(fā)酵液組成見表1。

表1 六種柑橘果醋實驗設(shè)計Table 1 Experimental design of six kinds of citrus fruit vinegar

1.3.3 柑橘果醋加工工藝流程及操作要點

（1）一次發(fā)酵法

（2）二次發(fā)酵法

（3）二次發(fā)酵法操作要點

柑橘去皮、榨汁、柑橘去皮榨汁后用120目的濾布過濾。

酶解：濾汁按照10 kg柑橘添加1 g果膠酶進行常溫酶解4 h。

調(diào)糖：酶解結(jié)束后添加白砂糖，調(diào)整糖度為20°Bx。

酵母菌活化：取活性干酵母加入10倍35～38 ℃無菌蒸餾水攪拌溶解，在此溫度水浴活化20～30 min。

酒精發(fā)酵：在柑橘果汁中加入0.02%活化后的酵母，置20～24 ℃室溫條件下發(fā)酵至酒精度為12%vol左右。

醋酸菌活化：將醋酸菌接入液體培養(yǎng)基，在30 ℃恒溫培養(yǎng)至醋酸菌菌落數(shù)＞108CFU/m L。

醋酸發(fā)酵：柑橘果酒用蒸餾水稀釋至酒精度為6%vol，按10%（V/V）接種量接種醋酸菌，于32 ℃條件下發(fā)酵，每隔12 h取樣測定醋酸含量，醋酸含量不再增加時結(jié)束發(fā)酵。

果醋殺菌：70 ℃條件下殺菌30 min。

陳釀：常溫下陳釀貯存3個月。

（4）一次發(fā)酵法操作要點

柑橘果汁90 ℃恒溫殺菌30 min，待溫度冷卻至室溫，將原果汁用蒸餾水稀釋至50%后加入食用酒精至酒精度為6%vol，按10%（V/V）接種量接種醋酸菌。其他操作要點同二次發(fā)酵法。

1.3.4 柑橘果汁和果醋品質(zhì)指標測定

總酸、蛋白質(zhì)測定：分別采用GB 12456—2021《食品中總酸的測定》和GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》；總糖測定：采用苯酚-硫酸法[12]；總多酚測定：采用Folin-Ciocalteu法[13]；總黃酮測定：采用閆慧君等[14]的方法；單體酚測定：采用孫翔宇等[15]的高效液相色譜法，其色譜條件如下：Promosil C18色譜柱（5 μm，4.6 mm×250 mm），柱溫30 ℃，流速0.8 mL/min，進樣量20 μL；采用梯度洗脫，流動相A：乙腈-冰乙酸（98∶2，V/V），流動相B：水-冰乙酸（98∶2，V/V）。有機酸含量測定：采用GB 5009.157—2016《食品中有機酸的測定》；氨基酸測定：參考GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》。柑橘果醋顏色參數(shù)L*值（明亮度）、a*值（紅色度）、b*值（黃色度）測定：采用湯曉宏等[16]的方法；透光率測定：采用程浩[17]的方法。

1.3.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)通過Excel2016和SPSS22.0軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同醋酸菌和發(fā)酵方式對柑橘果醋總酸的影響

不同醋酸菌和發(fā)酵方式對柑橘果醋總酸含量的影響結(jié)果見圖1。由圖1可知，在酒精含量為6%vol的條件下，不同醋酸菌對總酸含量影響無顯著差異（P＞0.05），但發(fā)酵快慢不同，滬釀1.01醋酸菌發(fā)酵最快，許氏醋酸菌最慢，AS1.41醋酸菌居中，這與3種醋酸菌發(fā)酵特性有關(guān)，滬釀1.01醋酸菌將乙醇發(fā)酵為乙酸的能力最強，許氏醋酸菌最弱，AS 1.41醋酸菌介于二者之間。3種醋酸菌二次發(fā)酵比一次發(fā)酵得快，這與發(fā)酵底物有關(guān)，醋酸菌將乙醇氧化為乙酸的能力很強，而將葡萄糖氧化為葡萄糖酸的能力很弱，一次發(fā)酵底物中有果汁，其葡萄糖含量高于二次發(fā)酵，氧化代謝糖需要時間長一些，所以發(fā)酵得慢。這說明發(fā)酵菌種及發(fā)酵方式對醋酸發(fā)酵快慢均有一定的影響。

圖1 不同醋酸菌及發(fā)酵方式對6種柑橘果醋發(fā)酵過程中總酸含量的影響Fig.1 Effects of different acetic acid bacteria and fermentation methods on total acid contents in six kinds of citrus vinegar samples

2.2 不同醋酸菌和發(fā)酵方式對柑橘果醋總糖、總多酚、總黃酮、蛋白質(zhì)及單體酚含量的影響

不同醋酸菌和發(fā)酵方式對柑橘果醋總糖、總多酚、總黃酮及蛋白質(zhì)含量的影響結(jié)果見表2。

表2 不同柑橘醋酸菌及發(fā)酵方式對6種果醋總糖、總酚、總黃酮及蛋白質(zhì)含量的影響Table 2 Effects of different acetic acid bacteria and fermentation methods on total sugar,total phenols,total flavones and protein contents in six kinds of citrus vinegar samples

由表2可知，同種發(fā)酵方式3種菌種相比，總多酚、總黃酮、蛋白質(zhì)含量呈現(xiàn)出相同的規(guī)律，AS1.41醋酸菌＞滬釀1.01醋酸菌＞許氏醋酸菌，且存在顯著性差異（P＜0.05）?？偺呛烤鶠樵S氏醋酸菌＞AS1.41醋酸菌＞滬釀1.01醋酸菌。同種醋酸菌兩種發(fā)酵方式相比，總糖、總多酚、總黃酮、蛋白質(zhì)含量一次發(fā)酵法均顯著高于二次發(fā)酵法（P＜0.05）。

10種單體酚標準品標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。由表3可知，10種單體酚標準品在質(zhì)量濃度10～300 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均＞0.999。

表3 10種單體酚標準品標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 3 Regression equation and correlation coefficient of standard curves of ten free phenols standards

6種柑橘果醋中單體酚含量測定結(jié)果見表4。由表4可知，6種柑橘果醋均檢測出10種單體酚，單體酚含量與總多酚、總黃酮、蛋白質(zhì)含量順序一致，同種發(fā)酵方式3種醋酸菌相比，單體酚總含量高低依次為AS1.41醋酸菌＞滬釀1.01醋酸菌＞許氏醋酸菌，且存在顯著性差異（P＜0.05）。同種醋酸菌兩種發(fā)酵方法相比，單體酚含量一次發(fā)酵法顯著高于二次發(fā)酵法。分析原因主要與發(fā)酵底物有關(guān)，一次發(fā)酵底物是酒精度為6%vol食用酒精的果汁，二次發(fā)酵底物是用蒸餾水稀釋酒精度為6%vol酒精的發(fā)酵酒，果汁中總糖、總多酚、總黃酮、蛋白質(zhì)含量高于稀釋酒，另外二次發(fā)酵的果醋多酚和黃酮等發(fā)生氧化水解，多酚含量降低[18]，所以一次發(fā)酵醋高于二次發(fā)酵醋。

表4 6種柑橘果醋中單體酚含量測定結(jié)果Table 4 Determination results of ten free phenols in six kinds of citrus vinegar mg/L

同種發(fā)酵方式3種醋酸菌相比，AS1.41醋酸菌＞滬釀1.01醋酸菌＞許氏醋酸菌，可能與3種醋酸菌對這些成分代謝能力不同有關(guān)。AS1.41醋酸菌對單體酚、總多酚、總黃酮、蛋白質(zhì)代謝能力低于滬釀1.01醋酸菌和許氏醋酸菌，而對糖的代謝能力高于滬釀1.01但低于許氏醋酸菌。

10種單體酚主要分為酚酸類化合物和類黃酮物質(zhì)，沒食子酸，綠原酸、咖啡酸、對香豆酸和阿魏酸屬于酚酸類化合物[19]，兒茶素、表兒茶素、蘆丁和槲皮素等屬于類黃酮[20]。采用AS1.41醋酸菌一次發(fā)酵的果醋中咖啡酸、綠原酸、對香豆酸和蘆丁含量高于其他5種果醋，兒茶素和槲皮素含量也較高，這與AS1.41醋酸菌發(fā)酵特性及一次發(fā)酵底物中含有原果汁有關(guān)。

2.3 不同醋酸菌和發(fā)酵方式對柑橘果醋有機酸的影響

6種有機酸標準品標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表5。由表5可知，6種有機酸質(zhì)量濃度和檢測峰面積相關(guān)性較好，標準曲線回歸方程相關(guān)系數(shù)R2均≥0.999 4。

表5 6種有機酸標準品標準曲線回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 5 Regression equation and correlation coefficient of standard curves of six organic acid standards

6種柑橘果醋中有機酸含量測定結(jié)果見表6。由表6可知，6種柑橘果醋均含有6種有機酸，且有機酸總含量高低依次為PCV101＞PCV141＞SCV141＞PCVAS＞SCV101＞SCVAS，其中一次發(fā)酵法有機酸總含量高低依次為PCV101＞PCV141＞PCVAS，二次發(fā)酵法有機酸總含量高低依次為SCV141＞SCV101＞SCVAS，說明滬釀1.01和AS1.41菌種有機酸總含量均高于許氏醋酸菌，一次發(fā)酵法有機酸總含量高于二次發(fā)酵法，這與發(fā)酵底物以及3種醋酸菌發(fā)酵特性不同有關(guān)。

表6 6種柑橘果醋中有機酸含量測定結(jié)果Table 6 Determination results of organic acid contents in six kinds of citrus vinegar mg/L

從單一有機酸含量來看，6種柑橘果醋均是檸檬酸＞酒石酸＞琥珀酸＞蘋果酸＞乳酸＞草酸（AS1.41菌種二次發(fā)酵蘋果酸與乳酸例外），且均具有顯著性差異（P＜0.05）。檸檬酸是柑橘中含量最高的酸，果醋中檸檬酸含量高在一定程度上緩解乙酸刺激性氣味，使柑橘果醋味道變得柔和豐滿[21-22]。

2.4 不同醋酸菌和發(fā)酵方式對柑橘果醋氨基酸含量的影響

6種柑橘果醋中氨基酸含量測定結(jié)果見表7。由表7可知，6種果醋分別檢測出17種氨基酸，其中7種為必需氨基酸，這說明柑橘果醋中氨基酸含量比較豐富，主要來源包括原果汁中含有氨基酸、發(fā)酵過程中果實中蛋白質(zhì)降解為氨基酸以及醋酸菌代謝釋放出的氨基酸[23]。6種柑橘果醋的總氨基酸（total amino acid，TAA）和非必需氨基酸（non-essential amino acid，NAA）含量高低依次為PCV141＞PCV101＞PCVAS＞SCV141＞SCV101＞SCVAS；而EAA含量高低依次為PCV141＞PCV101＞PCVAS＞SCV141＞SCVAS＞SCV101，即采用1.41醋酸菌一次發(fā)酵的6種果醋TAA、必需氨基酸（essential amino acid，EAA）、NAA含量均為最高，分別為1 830.10 mg/kg、420.80 mg/kg和1 409.30 mg/kg；一次發(fā)酵法TAA、EAA、NAA含量均顯著高于二次發(fā)酵法（P＜0.05），可能是由于二次發(fā)酵過程中游離氨基酸通過Strecker降解的緣故[24]。

表7 6種柑橘果醋中氨基酸含量測定結(jié)果Table 7 Determination results of amino acid contents in six kinds of citrus vinegar mg/kg

氨基酸的種類與含量不同，對果醋的風(fēng)味品質(zhì)也有一定的影響。6種柑橘果醋呈味氨基酸含量測定結(jié)果見表8。由表8可知，鮮味氨基酸主要包括天冬氨酸、谷氨酸和賴氨酸；甜味氨基酸主要包括甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、組氨酸和脯氨酸；苦味氨基酸主要包括纈氨酸、甲硫氨酸、異亮氨酸、亮氨酸和精氨酸；芳香族氨基酸主要有酪氨酸和苯丙氨酸[25]。鮮、甜、苦、香4種呈味氨基酸含量及其總含量高低均為PCV141＞PCV101＞PCVAS＞SCV141＞SCV101＞SCVAS，且具有顯著性差異，均是AS1.41＞滬釀1.01＞許氏醋酸菌。4種呈味氨基酸含量高低相比，均是甜味氨基酸＞鮮氨基酸＞苦氨基酸＞芳香族氨基酸。

表8 6種柑橘果醋呈味氨基酸含量測定結(jié)果Table 8 Determination results of flavor amino acid contents in six kinds of citrus vinegar mg/kg

2.5 不同醋酸菌和發(fā)酵方式對柑橘果醋色澤和透光率的影響

由表9可知，6種柑橘果醋除了個別果醋，明亮度和澄清度均為二次發(fā)酵法顯著高于一次發(fā)酵法（P＜0.05），黃色度一次發(fā)酵法高于二次發(fā)酵法，由于柑橘醋是黃色的所以紅色度均很低。不同醋酸菌對果醋L*值、a*值、b*值和澄清度的影響顯著（P＜0.05）。

表9 6種柑橘果醋顏色參數(shù)及透光率的比較Table 9 Comparison of color parameters and light transmittance of six kinds of citrus vinegar

3 結(jié)論

本研究以柑橘為原料，采用3種醋酸菌（滬釀1.01、AS1.41、許氏醋酸菌）兩種液態(tài)發(fā)酵方式（一次發(fā)酵法、二次發(fā)酵法）共發(fā)酵6種柑橘果醋。對6種柑橘果醋總酸、總糖、總多酚、總黃酮、有機酸、單體酚、氨基酸含量及果醋顏色、澄清度等理化指標進行了綜合分析。結(jié)果表明，采用AS1.41醋酸菌和一次發(fā)酵法加工的果醋總多酚、總黃酮、蛋白質(zhì)、單體酚、總氨基酸、必需氨基酸、非必需氨基酸、呈味氨基酸含量均高于其他5種果醋，滬釀1.01和AS1.41醋酸菌一次發(fā)酵法和二次發(fā)酵法有機酸總含量均高于許氏醋酸菌。因此，AS1.41醋酸菌和一次發(fā)酵法加工的柑橘果醋最好。