王鑫磊，周 聰，高保軍，蔡倩倩，楊傳倫，李 超，王金菊，蘇亞平，王艷萍*

（1.天津科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.黃河三角洲京博化工研究院有限公司，山東 濱州 256500）

灰樹花（Grifola frondosa）又名云蕈、舞茸，是一種極具開發(fā)前景的食、藥兩用真菌[1]。灰樹花子實(shí)體和菌絲體中含有豐富的多糖、多酚、多肽等營養(yǎng)物質(zhì)[2-5]，具有益氣健脾，補(bǔ)虛扶正、調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗疲勞等多種生物活性[6-9]。海棠果（Crabapple）又名楸子、紅厚殼，原產(chǎn)于我國，現(xiàn)主要分布在華北地區(qū)，其果皮色澤鮮紅奪目，果肉黃白色，鮮食酸甜香脆[10]。海棠果中含有大量的營養(yǎng)物質(zhì)，如糖類、維生素、多酚、有機(jī)酸等，能夠補(bǔ)充人體所需營養(yǎng)，增強(qiáng)機(jī)體免疫力，具有生津止渴、健脾開胃、澀腸止痢的功效[11-12]。

益生菌發(fā)酵可改善果蔬汁原有不良風(fēng)味，賦予果蔬汁獨(dú)特口感[13]。此外，在果蔬汁發(fā)酵過程中可產(chǎn)生有機(jī)酸、短肽、多酚等多種營養(yǎng)物質(zhì)，其可調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)，賦予發(fā)酵果蔬汁一定的保健功能[14-17]。本實(shí)驗(yàn)室前期研制了一款海棠果酵素，該飲品口感良好，酸甜適口?；覙浠I養(yǎng)豐富，但相關(guān)食品種類單一、口感較差，難以滿足市場需要[18-20]。

本試驗(yàn)以灰樹花、海棠果為原料，利用乳酸菌發(fā)酵制備灰樹花海棠果發(fā)酵飲料，探究接種量、接種比例、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間等條件對灰樹花海棠果發(fā)酵飲料相關(guān)指標(biāo)的影響，并研究其抗疲勞活性，以期為灰樹花、海棠果深加工及綜合利用提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）MA2、保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）717和嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）176：天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院發(fā)酵食品與微生物資源開發(fā)研究室。

1.1.2 試驗(yàn)原料

灰樹花浸提液：山東博華有限公司；海棠果果汁：山東博華有限公司；白砂糖：北京古松經(jīng)貿(mào)有限公司。

1.1.3 試驗(yàn)動物

無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級Wistar雄性大鼠（體質(zhì)量100～110 g）：斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司。動物飼養(yǎng)于天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院屏障系統(tǒng)動物實(shí)驗(yàn)中心。室內(nèi)條件為：相對濕度（55±5）%，溫度（23±1）℃，控制12 h明暗光照循環(huán)，自由攝食和飲用水。天津科技大學(xué)動物保護(hù)與使用委員會已經(jīng)通過本實(shí)驗(yàn)的申請，并按照《實(shí)驗(yàn)動物管理及使用指南》進(jìn)行飼養(yǎng)管理。

1.2 儀器與設(shè)備

FA2204B電子天平：上海精密科學(xué)儀器股份有限公司；HK-04B 搖擺式粉碎機(jī)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；Y909 榨汁機(jī)：山東九陽有限公司；DFD-7000 四孔水浴鍋：德陽東方電工有限責(zé)任公司；ATAGO 糖度儀：日本ATAGO公司；HFsafe-900超凈工作臺：上海力申科學(xué)儀器有限公司；DL201恒溫自動干燥箱：天津市實(shí)驗(yàn)儀器廠；SM510自動滅菌鍋：日本Yamato公司；BCD-217GM-20℃冰箱：中國海爾有限公司；DELTA-320 pH計：法國METTLER-TOLEDO公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料制備工藝

將灰樹花浸提液與海棠果果汁按1∶1（V/V）混合均勻→調(diào)配（添加6%白砂糖）→滅菌（90 ℃、15 s）→接種發(fā)酵劑→恒溫發(fā)酵→灌裝→灰樹花海棠果發(fā)酵飲料

1.3.2 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料制備工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

試驗(yàn)前期通過單因素試驗(yàn)[21]考察了白砂糖添加量、發(fā)酵時間、接種量、發(fā)酵菌種比例、發(fā)酵溫度單因素對灰樹花海棠果發(fā)酵飲料總酸、pH、可溶性固形物、感官評分的影響，結(jié)果表明，最優(yōu)白砂糖添加量為6%，發(fā)酵時間為3 d，接種量為3×107CFU/mL，發(fā)酵菌種比例（MA2∶717∶176）為2∶1∶1，發(fā)酵溫度為35 ℃。

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以灰樹花海棠果發(fā)酵飲料感官評分作為評價指標(biāo)，以白砂糖添加量、發(fā)酵時間、菌種比例、發(fā)酵溫度為試驗(yàn)因素，設(shè)計L9（34）正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料制備工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermented Grifola frondosa crabapple beverage preparation technology optimization

1.3.3 動物試驗(yàn)條件及分組

將18只4周齡Wistar雄性大鼠隨機(jī)分為3組：空白對照組（NC）為6只Wistar雄性大鼠，灌胃1 mL生理鹽水，持續(xù)10 d；紅牛功能飲料組（RB）為6只Wistar雄性大鼠，灌胃1 mL紅牛功能飲料，持續(xù)10 d；灰樹花海棠果發(fā)酵飲料組（GF）為6只Wistar雄性大鼠，灌胃1 mL灰樹花海棠果發(fā)酵飲料，持續(xù)10 d。

1.3.4 跑籠試驗(yàn)

將裝有大鼠的跑籠置于大水槽中，水溫控制在10 ℃以下，水面高于籠高的2/3又不浸沒跑籠。大鼠在求生本能和寒冷的雙重刺激下，不得不依靠提高動能（速度）來維持一定的動力勢能避免被水淹沒和保持體溫。為了避免大鼠抓附跑籠的側(cè)壁，采用光滑的墻紙將側(cè)壁密封[22]。

1.3.5 爬桿試驗(yàn)

將各試驗(yàn)組大鼠置于干凈的統(tǒng)一的有機(jī)玻璃棒上（試驗(yàn)時將爬桿架置于深10 cm、水溫15 ℃的水盆中）。讓在玻璃棒上的大鼠的肌肉處在靜力緊張的狀況，記錄試驗(yàn)大鼠因?yàn)槠浼∪獾钠?，而從玻璃棒上掉下來的時間。大鼠3次落水的時候，停止試驗(yàn)，3次試驗(yàn)測得的時間累加作為該試驗(yàn)組大鼠的爬桿時間[23-24]。

1.3.6 負(fù)重游泳試驗(yàn)

每組選用6只大鼠，末次給予大鼠受試物30 min后，置大鼠于游泳箱中游泳，水深為35 cm，水溫為（25.0±0.5）℃，鼠尾根部負(fù)荷10%體質(zhì)量的鉛皮。記錄大鼠從游泳開始至力竭的時間，作為大鼠游泳力竭時間[25-26]。

1.3.7 數(shù)據(jù)處理

本試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均采用數(shù)理統(tǒng)計軟件SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差”表示，P＜0.05表示兩組之間具有顯著性差異，P＜0.01 表示兩組之間具有極顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料制備工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料制備工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermented Grifola frondosa crabapple beverage preparation technology optimization

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 3 Variance analysis for orthogonal experiment results

由表2、表3可知，影響灰樹花海棠果發(fā)酵飲料口感的主次因素為白砂糖添加量＞發(fā)酵溫度＞菌種比例＞發(fā)酵時間，最佳組合為A2B1C1D2，即白砂糖添加量為6%；發(fā)酵時間為3 d；菌種比例為2∶1∶1；發(fā)酵溫度為37 ℃。對最優(yōu)組合A2B1C1D2進(jìn)行驗(yàn)證，感官評分結(jié)果為89分。

2.2 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對大鼠體質(zhì)量的影響

大鼠體質(zhì)量指標(biāo)是反映大鼠健康狀況的重要指標(biāo)。各組大鼠活潑，精神狀態(tài)良好，皮毛光滑，未見任何不良反應(yīng)。由圖1可知，3組大鼠灌胃10 d后體質(zhì)量均有增加，但與空白對照組（NC）相比，紅牛功能飲料組（RB）和灰樹花海棠果發(fā)酵飲料組（GF）大鼠體質(zhì)量無顯著差異（P＞0.05），以上結(jié)果表明灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對大鼠體質(zhì)量增長無顯著性影響。

圖1 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對大鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of fermented Grifola frondosa crabapple beverage on body mass of rat

2.3 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對大鼠運(yùn)動耐力的影響

2.3.1 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對大鼠跑籠時間的影響

運(yùn)動耐力的下降是疲勞最直接、客觀的表現(xiàn)[22]。跑籠試驗(yàn)是測定運(yùn)動耐力的方法之一，是評價抗疲勞的主要方法。跑籠時間的長短可反映動物運(yùn)動疲勞程度。由圖2可知，t（RB）＞t（GF）＞t（NC），即紅牛功能飲料組（RB）大鼠跑籠時間最長，跑籠時間為（1 234.43±104.92）s，而灰樹花海棠果發(fā)酵飲料組（GF）跑籠時間為（1 222.97±187.79）s。與空白對照組（NC）相比，紅牛功能飲料（RB）和灰樹花海棠果發(fā)酵飲料（GF）均能延長大鼠跑籠時間，延長率分別為12.30%和11.25%，但組間均無顯著性差異（P＞0.05），這可能與組內(nèi)個體差異較大有關(guān)。以上結(jié)果表明，飲用灰樹花海棠果發(fā)酵飲料可延長大鼠跑籠時間。

圖2 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對大鼠跑籠時間的影響Fig.2 Effect of fermented Grifola frondosa crabapple beverage on rat cage running time

2.3.2 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對大鼠爬桿時間的影響

爬桿試驗(yàn)是測定運(yùn)動耐力的方法之一，是評價抗疲勞的常用方法。由圖3可知，t（GF）＞t（RB）＞t（NC），即灰樹花海棠果發(fā)酵飲料組（GF）大鼠爬桿時間最長，爬桿時間為（81.88±8.56）s，而紅牛功能飲料組（RB）爬桿時間為（65.18±7.44）s。與空白對照組（NC）相比，紅牛功能飲料（RB）和灰樹花海棠果發(fā)酵飲料組（GF）極顯著延長了大鼠爬桿時間（P＜0.01），延長率分別為41.32%和77.54%。與紅牛功能飲料組相比，灰樹花海棠果發(fā)酵飲料組（GF）極顯著延長了大鼠爬桿時間（P＜0.01）。以上結(jié)果表明，飲用灰樹花海棠果發(fā)酵飲料可延長大鼠爬桿時間，具有增強(qiáng)耐力、緩解疲勞的作用，且效果優(yōu)于紅牛功能飲料組。

圖3 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對大鼠爬桿時間的影響Fig.3 Effect of fermented Grifola frondosa crabapple beverage on rat pole climbing time

2.3.3 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對負(fù)重游泳時間的影響

負(fù)重游泳力竭試驗(yàn)是測定運(yùn)動耐力的方法之一，是評價抗疲勞的主要方法。負(fù)重游泳力竭時間的長短可反映動物運(yùn)動疲勞程度。由圖4可知，t（GF）＞t（RB）＞t（NC），即灰樹花海棠果發(fā)酵飲料組（GF）大鼠游泳力竭時間最長，游泳時間為（772.12±65.17）s，而紅牛功能飲料組（GF）游泳時間為（643.16±87.60）s。與空白對照組（NC）相比，紅牛功能飲料和灰樹花海棠果發(fā)酵飲料組（GF）可顯著延長大鼠游泳時間（P＜0.05），延長率分別為31.86%、58.31%。與紅牛功能飲料組相比，灰樹花海棠果發(fā)酵飲料組（GF）顯著延長了大鼠力竭游泳時間（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，飲用灰樹花海棠果發(fā)酵飲料可延長大鼠負(fù)重游泳力竭時間，具有增強(qiáng)耐力、緩解疲勞的作用，且效果優(yōu)于紅牛功能飲料組。王金菊等[9]研究表明，灌胃灰樹花發(fā)酵液可顯著延長小鼠游泳力竭時間，增強(qiáng)小鼠運(yùn)動耐力，這與本試驗(yàn)研究結(jié)果相一致。

圖4 灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對大鼠力竭游泳時間的影響Fig.4 Effect of fermented Grifola frondosa crabapple beverage on rat exhaustive swimming time

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過正交試驗(yàn)，確定灰樹花海棠果發(fā)酵飲料最佳發(fā)酵工藝為：白砂糖添加量為6%；發(fā)酵時間為3 d；MA2∶717∶176接種比例為2∶1∶1；發(fā)酵溫度為37 ℃。在此條件下制得飲料酸甜可口，風(fēng)味良好，感官評分為89分。通過跑籠試驗(yàn)、負(fù)重游泳試驗(yàn)、爬桿試驗(yàn)，探究了灰樹花海棠果發(fā)酵飲料對大鼠抗疲勞的作用。結(jié)果表明，與紅牛功能飲料組（RB）相比，灰樹花海棠果發(fā)酵飲料具有相似的抗疲勞效果，且部分試驗(yàn)效果更優(yōu)。與空白對照組（NC）相比，灰樹花海棠果發(fā)酵飲料具有顯著提高機(jī)體耐力，緩解疲勞的效果，具有開發(fā)為抗疲勞食品的潛力。