唐 露,路學(xué)光 ,毛振婭,施奇武,余修賢,萬城渝,彭 穗,劉 波,黃婉霞

(1.四川大學(xué) a.材料科學(xué)與工程學(xué)院，b.華西醫(yī)院中藥藥理研究室，四川 成都 610065；2.成都先進金屬材料產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院股份有限公司，四川 成都 610300)

單斜晶型M相二氧化釩(VO2(M))在攝氏溫度約為68 ℃時可發(fā)生可逆的絕緣-金屬轉(zhuǎn)變(SMT)，其電學(xué)和光學(xué)性質(zhì)會發(fā)生顯著變化[1-2]，這種特性使其在電光開關(guān)器件[3-4]、智能窗口[5-6]、傳感器[7]等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。此外，VO2(M)的相變特性還可以通過摻雜離子，如鎢離子(W6+)、鉬離子(Mo6+)和鈮離子(Nb5+)進行改性[8-11]，以更適應(yīng)實際應(yīng)用。隨著應(yīng)用領(lǐng)域的擴大，VO2(M) 暴露在周圍環(huán)境中，與人接觸的機會也逐漸增加，由此帶來的生物安全問題也日益引起關(guān)注，其生物毒性研究勢在必行。

雨水沖刷下的VO2(M)智能窗口、VO2(M)材料生產(chǎn)過程中排放的污水等途徑都會增加環(huán)境中的VO2(M)納米粒子及其與人體接觸的機會。在實際應(yīng)用中，材料自身的生物相容性和細胞毒性是必須考慮的因素。目前，學(xué)者們對氧化釩材料的生物毒性進行了實驗分析，但大多數(shù)研究主要集中在五氧化二釩(V2O5)粉體的細胞毒性和VO2(M)的抗菌性，對離子摻雜改性的VO2(M)和中間價態(tài)釩氧化物細胞毒性的研究較少[12-13]。通過對納米三氧化二釩(V2O3)、VO2(M)粉體的毒性研究[14-16]表明，納米粒子的理化特性，特別是形貌和粒徑與生物毒性有顯著關(guān)系。Xi等[17]為了確定納米VO2(M)粉體的體外肺毒性，對比微米級、納米級VO2(M) 粉體的短期(1 d)和長期(20 d)肺細胞A549毒性，發(fā)現(xiàn)在相同條件下暴露在納米級VO2(M)粉體的細胞活力更低。這些研究表明，釩氧化物的粒度、形狀、溶解度、表面特性都影響其細胞毒性[18-19]。此外，釩氧化物的價態(tài)也是一個重要的因素[20]。因為在長時間的存放或使用過程中，VO2(M)與空氣接觸，不可避免地發(fā)生氧化現(xiàn)象，所以對多價態(tài)釩氧化物的生物安全性進行評估也具有重要的現(xiàn)實意義。

為了對VO2(M)粉體氧化過程中可能形成的多種價態(tài)釩氧化物的細胞毒性進行系統(tǒng)性評估，本文中制備VO2(M)、十三氧化六釩(V6O13)、一水合七氧化三釩(V3O7·H2O) 和V2O54種不同價態(tài)的釩氧化物納米粉體，模擬VO2(M)及其氧化過程中可能形成的釩氧化物，研究不同濃度的釩氧化物對小鼠成纖維細胞L929的影響，為評估接觸納米VO2的毒性風(fēng)險提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣品制備

以V2O5作為釩源，草酸(C4H6O6)作為還原劑，鎢酸(H2WO4)作為W元素摻雜劑，通過原位攪拌輔助水熱法制備W摻雜VO2(M)粉體。同時，在攪拌輔助水熱法的基礎(chǔ)上，通過調(diào)整還原劑含量和反應(yīng)時間制備中間價態(tài)釩氧化物V6O13和V3O7·H2O 粉體。通過對上述VO2(M)粉體進行一定條件的熱處理獲得含有W摻雜的V2O5粉體。多價態(tài)釩氧化物納米粉體的合成示意圖如圖1所示。

圖1 多價態(tài)釩氧化物納米粉體的合成示意圖

具體步驟如下：首先，將1.092 g(0.006 mol)V2O5粉末、0.270 g(0.001 8 mol)C4H6O6和一定量的H2WO4加入到70 mL去離子水中，將混合溶液在室溫下使用恒定磁力攪拌器攪拌1 h。然后，將所得混合液轉(zhuǎn)移至100 mL石英內(nèi)襯的多功能水熱反應(yīng)釜中，將反應(yīng)釜的升溫程序設(shè)置為以升溫速率2 ℃/min加熱至240 ℃，保溫開始時啟動原位攪拌裝置，攪拌速率設(shè)置為500 r/min。保溫結(jié)束并待水熱釜自然冷卻后，將所得黑色沉淀物用大量去離子水和乙醇清洗數(shù)次。最后，在溫度為 70 ℃的恒溫干燥箱中干燥制得產(chǎn)物，樣品編號為VO-1。通過調(diào)整還原劑含量和反應(yīng)時間制備VO2(M)粉體及中間價態(tài)釩氧化物V6O13、V3O7·H2O粉體，并通過對上述VO2(M)粉體進行一定條件的熱處理獲得含有W摻雜V2O5粉體，樣品編號依次為VO-2、VO-3、VO-4。具體制備條件見表1。

表1 實驗用樣品的制備條件

1.2 材料表征測試

利用美國FEI公司生產(chǎn)的Inspect F50型掃描電子顯微鏡(SEM)對樣品的微觀形貌進行表征；利用德國布魯克公司生產(chǎn)的D/MAX2500型X射線衍射儀(XRD)對樣品的物相組成進行表征，并使用JADE軟件對數(shù)據(jù)進行處理并確定相應(yīng)的物相；利用英國Kratos公司生產(chǎn)的Xsam800型X射線光電子能譜(XPS)對樣品的化學(xué)價態(tài)進行分析。

1.3 小鼠成纖維細胞L929的毒性實驗

以L929細胞為研究對象，評估VO-1、VO-2、VO-3和VO-4這4種釩氧化物樣品的細胞毒性。將粉體材料經(jīng)超聲分散后，加入完全培養(yǎng)基配置成質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、20、50、100、200、500 mg/L共9個濃度梯度的浸提液，與生長狀態(tài)良好的L929細胞共培養(yǎng)24 h，隨后對樣品的細胞毒性進行檢測。

選擇細胞活性指標CCK-8試劑盒，檢測孵化后的活細胞數(shù)量，可以間接反映多價態(tài)釩氧化物的細胞毒性。按照細胞形態(tài)觀察的步驟對L929細胞進行不同濃度藥物處理，每個濃度取3個平行組，標記后置于細胞培養(yǎng)箱中24 h。取出CCK-8試劑置于水浴箱中預(yù)熱，并在避光條件下與完全培養(yǎng)基混合得到質(zhì)量分數(shù)為5%的CCK-8培養(yǎng)液。將培養(yǎng)板取出，吸出含樣品的培養(yǎng)基，加入配置的CCK-8培養(yǎng)液，在培養(yǎng)箱中孵育2 h；采用多功能酶標儀在波長為450 nm的條件下進行吸光度檢測，根據(jù)測試數(shù)據(jù)計算得到細胞存活率，表征細胞活性，間接反映樣品的細胞毒性。細胞存活率γ計算公式為

γ=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%，

(1)

式中：As為實驗孔(細胞、CCK-8培養(yǎng)液、待測物)的吸光度；Ac為對照孔(細胞、CCK-8培養(yǎng)液)的吸光度；Ab為空白孔(CCK-8培養(yǎng)液)的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 多價態(tài)釩氧化物納米顆粒表征

不同價態(tài)釩氧化物的樣品VO-1、VO-2、VO-3和VO-4的微觀形貌和X射線衍射(XRD)譜圖如圖2所示。由圖2(a)—(d)可以看出，不同樣品的顆粒形貌都趨于棒狀，直徑為幾百納米不等，長度不一，顆粒形貌與文獻[11]中報道的類似。從圖2(e)中可以發(fā)現(xiàn)，樣品VO-1、VO-4的結(jié)晶度均較高，且衍射峰分別與VO2(M)標準粉末衍射(PDF)卡片(JCPDS No.82-0661)和V2O5標準PDF卡片(JCPDS No.89-0612)完全匹配，沒有發(fā)現(xiàn)雜質(zhì)相。由實驗可知，在水熱環(huán)境下V2O5經(jīng)C4H6O6還原成為VO2的過程可能為V2O5→V3O7·H2O或V6O13→VO2，中間相V3O7·H2O和V6O13通常以混合物的狀態(tài)出現(xiàn)，因此VO-2樣品主相為V6O13(JCPDS No.71-2235)，有少量的VO2(M)的衍射峰出現(xiàn)，表明小部分V5+被直接還原成V4+。樣品VO-3的衍射峰基本與V3O7·H2O的標準PDF卡片(JCPDS No.28-1433)匹配良好，但是也存在少量的V6O13的衍射峰。由于V2O5還原過程中的中間相不穩(wěn)定，較難獲得完全純相，因此在后續(xù)多價態(tài)釩氧化物細胞毒性研究時將樣品VO-2、VO-3的主相作為不同價態(tài)釩氧化物進行討論，即樣品VO-2對應(yīng)V6O13，樣品VO-3對應(yīng)V3O7·H2O。

根據(jù)圖3所示的不同價態(tài)釩氧化物的XPS譜圖和通過V 2p的峰值使用帶有XPS Peak 4.1軟件的Shirley函數(shù)擬合樣品VO-1、VO-2、VO-3、VO-4的V 2p3/2峰的結(jié)合能(表2)，結(jié)合XRD分析可以看出，所有樣品應(yīng)含2種釩價態(tài)，即+4價(結(jié)合能為515.7～516.2 eV)和+5價(結(jié)合能為516.8～517.5 eV)。計算了樣品中的V4+、V5+的比例，結(jié)果如表2所示。

表2 不同價態(tài)釩氧化物擬合的V 2p3/2峰的結(jié)合能和峰面積所占比例

2.2 不同濃度樣品的細胞形態(tài)變化

利用倒置相差顯微鏡觀察細胞形態(tài)，對不同濃度的多價態(tài)釩氧化物的細胞毒性進行評估。正常的L929細胞多呈規(guī)則的短梭形，當外界環(huán)境發(fā)生變化時其形狀會隨之改變。L929細胞在添加了質(zhì)量濃度為1、10、50 mg/L的不同價態(tài)釩氧化物的培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)24 h后的細胞形態(tài)如圖4所示。在倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)不同濃度VO2(M)處理的L929細胞[圖4(a)、(b)]大多數(shù)呈短梭形，細胞貼壁生長，折光性良好，且隨著VO2(M)濃度的增大，細胞密度沒有明顯下降，表明在VO2(M)的質(zhì)量濃度為1、10、50 mg/L時其細胞毒性較低。根據(jù)以往的研究結(jié)果可知，粉體材料可以通過細胞的吞噬作用進入到細胞內(nèi)部，從而對細胞形態(tài)和生物學(xué)功能產(chǎn)生影響。從圖4(c)可以看出，VO2(M)的質(zhì)量濃度增加至50 mg/L，L929細胞內(nèi)出現(xiàn)大量聚集的VO2(M)顆粒。與VO2(M)組相比，不同濃度V6O13[見圖4(d)、(e)、(f)]以及V3O7·H2O[見圖4(g)、(h)、(i)]與L929細胞孵化24 h后，細胞形態(tài)呈現(xiàn)為正常的短梭形和死亡的球形共存，隨著樣品濃度的增大，細胞數(shù)量有所減少，細胞密度降低，形狀由梭形變?yōu)榍蛐蔚募毎壤兴黾?，可見V6O13和V3O7·H2O均具有一定程度的細胞毒性反應(yīng)，且隨樣品濃度的增加而毒性增強。從圖4(j)、(k)、(l)中可以看出，V2O5的質(zhì)量濃度分別為1、10 mg/L的培養(yǎng)基處理的L929細胞多數(shù)出現(xiàn)圓縮、死亡，并且隨著V2O5濃度的增加，細胞數(shù)量明顯減少，當V2O5的質(zhì)量濃度為50 mg/L時，L929細胞密度很小并且絕大多數(shù)細胞呈球形，不同濃度的V2O5均呈現(xiàn)明顯的細胞毒性反應(yīng)，高濃度的V2O5造成絕大多數(shù)細胞死亡。

從細胞形態(tài)學(xué)角度觀察分析可知，VO2(M)的質(zhì)量濃度分別為1、10、50 mg/L的培養(yǎng)基與L929細胞共培養(yǎng)24 h后，仍有多數(shù)細胞呈正常的梭形，表明VO2(M)的細胞毒性較低；不同濃度的V6O13、V3O7·H2O和V2O5與L929細胞共培養(yǎng)24 h后均有一定量的細胞形態(tài)出現(xiàn)圓縮，即表現(xiàn)出一定程度的細胞毒性，其中經(jīng)較高濃度V2O5處理后的細胞圓縮最為嚴重，表明其細胞毒性最強。

2.3 不同濃度樣品的細胞毒性測試

圖5所示為不同濃度的4種價態(tài)釩氧化物處理 24 h后的L929細胞活性。從圖中可以看到，經(jīng)過不同濃度的VO2(M)、V6O13、V3O7·H2O和V2O5處理24 h后，L929細胞活性隨著樣品價態(tài)的增加、濃度的增大呈依賴性降低，表明釩氧化物的細胞毒性呈價態(tài)、濃度依賴性增加。在材料浸提液質(zhì)量濃度較低(1、2、5 mg/L)時，4種價態(tài)釩氧化物處理后的L929細胞存活率均在 80%以上，可以推斷低濃度的多價態(tài)釩氧化物的細胞毒性均較低。當質(zhì)量濃度增加至10 mg/L及以上時，V6O13、V3O7·H2O和V2O5處理過的L929細胞活性出現(xiàn)驟降，活細胞數(shù)量隨著樣品濃度的增加大幅減少，表明樣品的細胞毒性隨著濃度的增大而增大。從圖中還可以看出，在樣品質(zhì)量濃度為10 mg/L及以上的任一濃度值時，經(jīng)處理后L929細胞的細胞活性在不同價態(tài)釩氧化物中由強到弱的順序為VO2(M)、V6O13、V3O7·H2O、V2O5，表明釩氧化物的細胞毒性隨著價態(tài)的增加而增大。與其他釩氧化物相比，經(jīng)質(zhì)量濃度小于100 mg/L的VO2(M)處理的L929細胞的存活率無明顯變化，均為90%以上，表明質(zhì)量濃度小于100 mg/L時VO2(M)的細胞毒性很低。當VO2(M)的質(zhì)量濃度增加至200 mg/L時，L929細胞存活率降至80%以下，VO2(M)開始表現(xiàn)出一定的細胞毒性。當VO2(M)的質(zhì)量濃度達到500 mg/L時，L929細胞存活率直接降低到45%，VO2(M)表現(xiàn)出明顯的細胞毒性?？傮w來說，L929細胞活性隨著釩氧化物價態(tài)的增加和濃度的增大而降低，表明樣品的細胞毒性隨價態(tài)的增加和濃度的增大而增強。

圖5 不同濃度的多價態(tài)釩氧化物處理24 h后的小鼠成纖維細胞L929的細胞活性

3 結(jié)語

本文中采用原位攪拌輔助水熱法和熱處理方法制備了4種價態(tài)的釩氧化物，通過細胞形態(tài)觀察和細胞活性檢測(CCK-8試劑)2種方式研究了不同價態(tài)、不同濃度的釩氧化物對L929細胞的毒性。結(jié)果表明，細胞毒性與樣品的濃度和價態(tài)有很大關(guān)系。對于孵化24 h的L929細胞，當釩氧化物的質(zhì)量濃度小于5 mg/L時，細胞存活率均在80%以上，細胞毒性較低；當釩氧化物的質(zhì)量濃度在大于5 mg/L的任一值時，隨著釩離子價態(tài)增加，細胞存活率降低，細胞毒性增大；當樣品濃度一致時，細胞活性在不同價態(tài)釩氧化物中由強到弱的順序為VO2(M)、V6O13、V3O7·H2O、V2O5，說明細胞毒性隨氧化釩的價態(tài)的增加而增強。隨著VO2應(yīng)用領(lǐng)域的逐步擴大，VO2暴露于周圍環(huán)境和與人接觸的可能性也逐漸增加，因此，也需要系統(tǒng)地評估VO2暴露引起的生物安全問題。本文中研究結(jié)果為評估VO2(M)在生產(chǎn)和生活中可能存在的毒性風(fēng)險提供了參考。