馮銘鐳， 王 磊， 龍曉文， 吳旭干，4， 姚東良， 陳阿琴*

（1.上海海洋大學水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306；2.上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點實驗室，上海 201306；3.大理大學 農(nóng)學與生物科學學院，云南大理 671003；4.上海海洋大學水產(chǎn)動物遺傳育種上海市協(xié)同創(chuàng)新中心，上海 201306）

蝦青素是一種廣泛存在于甲殼動物、鮭鱒魚、藻類和真菌中的類胡蘿卜素。根據(jù)來源不同，蝦青素分為天然蝦青素和人工合成蝦青素，前者主要來源于雨生紅球藻和紅發(fā)夫酵母（Bjerkeng，2007），后者由化學合成。蝦青素存在多種同分異構(gòu)體，包括立體異構(gòu)（左旋、右旋和內(nèi)消旋）、幾何異構(gòu)（全反式、9-順式、13-順式等）和酯化（游離、單酯和雙酯）形式。蝦青素結(jié)構(gòu)與其來源密切相關(guān)，如紅發(fā)夫酵母中的蝦青素主要以3R，3’R全反式結(jié)構(gòu)存在，人工合成蝦青素中三種異構(gòu)體（3S，3’S，3R，3’S和3R，3’R）的比例為1:2:1，這兩種來源的蝦青素主要以游離態(tài)存在（Capelli，2013）。天然蝦青素與人工合成蝦青素在穩(wěn)定性、生物活性、抗氧化活性等多方面存在不同（Lim，2002）。

魚類不能從頭合成蝦青素，因此魚類必需從餌料或日糧中獲得外源蝦青素（Yu，2020）。蝦青素對魚類具有多種生理功能，主要包括調(diào)控魚類的色澤、存活、生長、生殖、抗應(yīng)激和免疫等（Lim，2018；Ambati，2014）。研究表明，日糧中添加紅法夫酵母來源的蝦青素可以降低氧化應(yīng)激誘導的虹鱒血清中甘油三酯、總膽固醇和磷脂水平，同時抑制肌肉脂質(zhì)過氧化水平（Nakano，1999）。當飼料中蝦青素添加水平為150～200 mg/kg時可有效提高黃顙魚生長性能（陳秀梅，2022）。蝦青素能夠促進暗紋東方鲀的生長，增加其非特異性免疫反應(yīng)和抗氧化防御系統(tǒng)，提高其對高溫脅迫的抵抗力（Cheng，2018）。

紅慢肌和白快肌構(gòu)成是魚體骨骼肌的主要組織，其中紅肌纖維是皮下淺層的慢收縮肌，紅慢肌血管分布廣泛，細胞富含肌紅蛋白、糖原、脂質(zhì)和線粒體，通過有氧代謝的途徑供應(yīng)能量（Gao，2017）。虹鱒的肌肉中紅肌約為4%、白肌約為96%，在適應(yīng)活動變化過程中紅肌早于白肌發(fā)揮作用（Bernal，2010）。研究表明，在20 d運動刺激下，虹鱒紅肌中SOD活性、SOD1和SOD2 mRNA水平增加，而白肌中SOD活性無變化（Pengam，2021）。脂質(zhì)是虹鱒有氧運動的主要能量來源，通過脂肪酸氧化供能（Lauff，1997）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒紅肌肌膜棕櫚酸的最大轉(zhuǎn)運能力是白肌的2.1倍（Richards，2004）。

虹鱒是重要的冷水經(jīng)濟魚類，是我國養(yǎng)殖產(chǎn)量最高的鮭鱒魚類，同時由于其肌肉組成和生物學特征，也是研究運動生理的模式動物之一（戶國，2017；Lauff，1997）。蝦青素在虹鱒肌肉中沉積，調(diào)節(jié)其色澤，但目前鮮見蝦青素調(diào)節(jié)虹鱒紅肌中的抗氧化系統(tǒng)及脂質(zhì)代謝的研究報道。因此，本試驗以虹鱒為研究對象，在日糧中分別添加紅發(fā)夫酵母蝦青素與人工合成蝦青素，研究其對紅肌抗氧化和脂質(zhì)代謝的影響，為天然蝦青素和人工合成蝦青素在水產(chǎn)飼料中的合理應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料 試驗基礎(chǔ)飼料由丹麥愛樂公司生產(chǎn)，基礎(chǔ)飼料中分別添加50 mg/kg的紅發(fā)夫酵母蝦青素（蝦青素含量0.54%）和人工合成蝦青素（加麗素粉紅，蝦青素含量10%），飼料中實測蝦青素含量及營養(yǎng)水平如表1所示。加麗素粉紅和紅發(fā)夫酵母蝦青素分別購自帝斯曼和廈門君和誠生物科技有限公司。

表1 飼料常規(guī)組分及蝦青素含量%

1.2 試驗魚與飼養(yǎng)管理 試驗魚采自青海龍羊峽生態(tài)水殖有限公司，挑選1350尾體質(zhì)健壯、體表無外傷、活力較好的個體[初始體重：（0.67±0.02）kg，體長：（34.04±2.55）cm]進行養(yǎng)殖試驗。養(yǎng)殖試驗在龍羊峽水庫天然水體的網(wǎng)箱（長×寬×高=4 m×4 m×5 m，水體80 m3）中進行。試驗共設(shè)3個試驗飼料組，每種飼料組設(shè)3個重復網(wǎng)箱，每個網(wǎng)箱中放養(yǎng)150尾魚，所有試驗魚在網(wǎng)箱中適應(yīng)一周后開始正式試驗。試驗期間，每日分別在8：00~9：00和15：00~16：00進行飽食投喂，日投喂量約為虹鱒體重的3%~5%，養(yǎng)殖試驗共進行16周。試驗期間，水溫為8~16℃，溶解氧高于7 mg/L。

1.3 樣品采集 采樣前禁食24 h，從各個試驗網(wǎng)箱中取20條左右虹鱒稱重獲得該網(wǎng)箱虹鱒的平均體重，每個網(wǎng)箱中取3條與平均體重接近的虹鱒用丁香酚麻醉后，進行解剖，參考Kiessling（1995）和Kaneko（2016）的方法采集紅肌于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 測定指標及方法

1.4.1 抗氧化指標檢測 總蛋白含量（TP）、總超氧化物歧化酶活性（T-SOD）、總抗氧能力（TAOC）、丙二醛含量（MDA）、過氧化氫酶（CAT）活力的測定均按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書操作。

1.4.2 谷胱甘肽代謝分析 總谷胱甘肽（TGSH）、GSSG測定按照試劑盒（南京建成生物工程研究所）說明書操作。根據(jù)T-GSH和GSSG含量計算還原性谷胱甘肽含量（GSH），即GSH=TGSH-2×GSSG。同時計算氧化應(yīng)激指數(shù)（OSI），OSI=（2GSSG/T-GSH）×100。

1.4.3 抗氧化及脂質(zhì)代謝相關(guān)基因mRNA表達分析 參照Trizol（invitrogen）的說明書提取紅肌的總RNA，采用瓊脂糖凝膠電泳和NanoDropTM分光光度計檢測RNA的完整性、純度和濃度。將同一網(wǎng)箱的3條魚紅肌的總RNA進行合樣，以1 μg總RNA為模板，按EvoM-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書（AG）進行反轉(zhuǎn)錄。將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA 10倍梯度稀釋，按SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（AG）試劑盒說明書，使用ABI7500 Real Time PCR儀（ABI公司）進行定量分析，實時熒光定量PCR引物見表2。熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括cDNA模板稀釋液2 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL，RNase-free water 7.2 μL。反應(yīng)條件為95℃30 s、95℃5 s、60℃34 s、95℃15 s、60℃1 min、95℃15 s，共40個循環(huán)。每個樣品3個生物學重復，以次黃嘌呤—鳥嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶（HPRT）和β-actin為內(nèi)參基因（二者Ct值取幾何平均數(shù)作為內(nèi)參），采用2-ΔΔCT方法計算目的基因mRNA相對表達量。

表2 熒光定量PCR引物序列

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 26.0對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（one-way ANOVA），采用Duncan氏法進行多重比較，差異顯著水平為P<0.05。試驗所得數(shù)據(jù)均以“平均值±標準誤差”表示，應(yīng)用軟件GraphPad Prism 8作圖。

2 結(jié)果

2.1 不同來源蝦青素對虹鱒紅肌抗氧化酶活性和谷胱甘肽代謝的影響 由表3可知，不同來源蝦青素對虹鱒紅肌中MDA含量無顯著影響。PAST組T-SOD活性較對照組提高38.04%（P<0.05），且P-AST組 中GSSG較 對 照 組 降 低24.73%（P<0.05）。與對照組相比，兩種來源的蝦青 素 對 虹 鱒 紅 肌T-AOC、CAT、T-GSH、GSH、GSH/GSSG和OSI均無明顯影響。

表3 不同來源蝦青素對虹鱒紅肌抗氧化指標和谷胱甘肽代謝的影響

2.2 不同來源蝦青素對虹鱒紅肌抗氧化相關(guān)基因表達的影響 如圖1和圖2所示，添加蝦青素可促進虹鱒紅肌中SOD1基因的表達，其中P-AST組SOD1 mRNA水平較對照組增加58.54%（P<0.05），而S-AST組與對照組間無顯著性差異。添加S-AST和P-AST后，SOD2基因的表達呈上升趨勢，但各組間無顯著性差異。S-AST組和P-AST組CAT基因表達分別低于對照組30.23%和31.78%（P<0.05）。添加S-AST和P-AST后，紅肌中谷胱甘肽代謝相關(guān)基因GPX1a、GPX1b1、GPX1b2、GR和GST mRNA水平均無顯著變化。

圖1 不同來源蝦青素對虹鱒紅肌SOD和CAT表達的影響

圖2 不同來源蝦青素對虹鱒紅肌谷胱甘肽代謝基因表達的影響

2.3不同來源蝦青素對虹鱒紅肌脂質(zhì)代謝基因表達的影響 如圖3所示，S-AST組pparα1基因表達高于對照組147.69%（P<0.05），而P-AST組Sirt1基因表達高于對照組49.37%（P<0.05）。各 組 間，F(xiàn)ASN、CPT1a、CPT1b、CPT1c、CPT1d、pparα2 mRNA表達量無明顯差異。

圖3 不同來源蝦青素對虹鱒紅肌脂質(zhì)代謝基因表達的影響

3 討論

3.1 不同來源蝦青素對虹鱒紅肌抗氧化系統(tǒng)的影響 魚類在高密度養(yǎng)殖過程中易于受到多種應(yīng)激的影響，因此養(yǎng)殖過程中常添加外源抗氧化劑以提高魚類抗應(yīng)激能力。魚類機體的抗氧化防御系統(tǒng)有酶促和非酶促兩個體系，酶促體系包括SOD、CAT等內(nèi)源酶，而非酶促體系則包括各類具有抗氧化作用的維生素、類胡蘿卜素等物質(zhì)。蝦青素是水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的抗氧化劑之一，其一方面能夠與魚體組織中的α-生育酚、抗壞血酸和谷胱甘肽等其他抗氧化劑協(xié)同作用，另一方面可以通過調(diào)節(jié)活性氧（ROS）的產(chǎn)生來調(diào)節(jié)機體基因表達（Nakano，2020）。張春燕（2021）發(fā)現(xiàn)，飼料中添加福壽花和雨生紅球藻中提取的蝦青素能有效改善虹鱒肌肉顏色，增強機體抗氧化能力，但福壽花花瓣來源的蝦青素對虹鱒抗氧化能力沒有顯著影響。李美鑫（2021）發(fā)現(xiàn)，蝦青素能顯著提高烏鱧血清和肝臟中SOD、CAT活性，同時有效降低MDA含量。隨著蝦青素添加量的增加，大鱗副泥鰍的肝臟、腸道、肌肉和皮膚中T-SOD、CAT呈現(xiàn)上升的趨勢，MDA呈現(xiàn)下降的趨勢（姚金明，2020）。日糧中添加50 mg/kg蝦青素可降低虹鱒幼魚血漿SOD、CAT活性，添加量 為75 mg/kg時 僅降 低CAT活性，而高濃度（100 mg/kg）對SOD、CAT活性均無顯著影響（Rahman，2016）。也有研究表明，飼料中添加蝦青素對虹鱒肝臟SOD和CAT等無顯著影響（Elia，2019；Kalinowski，2019）。飼喂雨生紅球藻蝦青素后，虹鱒血清總抗氧化能力和MDA含量隨著劑量效應(yīng)顯著增強（Sheikhzdeh，2012）。本研究表明，紅發(fā)夫酵母蝦青素可提高虹鱒紅肌中T-SOD活性，人工合成蝦青素對紅肌T-SOD、CAT、MDA、T-AOC均無顯著影響。兩種蝦青素均能夠顯著抑制CAT基因表達，而SOD1基因僅在紅發(fā)夫酵母蝦青素組中下調(diào)，SOD2及與谷胱甘肽代謝相關(guān)的基因在兩種蝦青素處理組中均無顯著性變化。該研究結(jié)果進一步表明，不同來源蝦青素對魚類抗氧化的作用具有差異性，其具體作用機制還需進一步深入研究。

3.2 不同來源蝦青素對虹鱒紅肌谷胱甘肽系統(tǒng)的影響 谷胱甘肽抗氧化系統(tǒng)是機體抗氧化體系的重要組成部分，主要由GSH、GPx、GST、GR構(gòu)成。生物有機體受到ROS等損傷時，GSH在GPx、GST的催化下，可清除過氧化氫（H2O2），減輕機體氧化損傷。同時GSSG在GR的作用下還原為GSH，確保機體GSH與GSSG的動態(tài)平衡，減少脂質(zhì)過氧化物（LPO）、H2O2等對機體的毒性影響（李素娟，2017）。Kalinowski（2019）研究發(fā)現(xiàn)，人工合成蝦青素可增強虹鱒肝臟中谷胱甘肽反應(yīng)，提高GR活性和GSH/GSSG比率，降低肝臟中GSSG含量和OSI。另一研究表明，日糧中添加蝦青素養(yǎng)殖虹鱒8周后，肝臟GR活性升高以維持GSH含量（Elia，2019）。Angeles（2016）研究發(fā)現(xiàn)，紅鯛攝食添加蝦青素的飼料后，在攝食6、12 h后紅鯛GPX和GR活性降低，在24 h后GPX和GR活性無顯著變化。本研究中紅發(fā)夫酵母蝦青素通過降低虹鱒紅肌GSSG含量增強谷胱甘肽反應(yīng)，而人工合成蝦青素對紅肌谷胱甘肽代謝系統(tǒng)無影響。上述研究提示，不同來源蝦青素對水生動物谷胱甘肽系統(tǒng)的影響存在差異。在無外界應(yīng)激情況下，攝入含有蝦青素的飼料，有利于虹鱒體內(nèi)GSH和GSSG水平達到平衡狀態(tài)。

3.3 不同來源蝦青素對虹鱒紅肌脂質(zhì)代謝基因表達的影響 在哺乳動物中，蝦青素對肝臟、肌肉和脂肪組織主要發(fā)揮降脂作用。Yang（2014）研究發(fā)現(xiàn)，蝦青素可降低肥胖小鼠血清甘油三酯含量。蝦青素通過調(diào)節(jié)小鼠脂肪酸β-氧化的限速酶CPT1，促進運動過程中脂質(zhì)代謝（Aoi，2008）。除此之外，蝦青素作為哺乳動物中PPAR-α激動劑和PPAR-β拮抗劑，可減少肝臟脂質(zhì)積累（Jia，2012）。目前，在水生動物中蝦青素調(diào)控魚類脂質(zhì)代謝的信息相對匱乏。研究表明，紅法夫酵母蝦青素可降低虹鱒血清中甘油三酯含量（Nakano，1999）。Page（2005）發(fā)現(xiàn)，人工合成蝦青素可以使虹鱒肝臟中總脂水平下降。雨生紅球藻源蝦青素呈劑量效應(yīng)調(diào)控虹鱒脂質(zhì)代謝，低劑量降低血清甘油三酯和總膽固醇，但高劑量時脂質(zhì)含量升高從而導致輕微脂質(zhì)代謝紊亂（Sheikhzdeh，2012）。蝦青素對河豚肝臟與肌肉中脂質(zhì)代謝的影響呈現(xiàn)組織特異性和劑量依賴性，蝦青素能降低肝臟和肌肉中FASN、肝臟中二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（DGAT1）和脂蛋白脂酶（LPL）等脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達，但是能夠促進肝臟和肌肉中CPT1基因表達（Liao，2018）。Kim（2017）在小鼠中的研究表明，蝦青素可以促進骨骼肌中CPT1α和PPARα mRNA表達水平，促進小鼠骨骼肌線粒體中脂肪酸氧化。本研究結(jié)果表明，人工合成蝦青素可顯著提高虹鱒紅肌pparα1基因表達，但紅發(fā)夫酵母蝦青素對pparα1基因表達無顯著性影響。與Liao（2018）研究結(jié)果不同的是，本研究中兩種蝦青素對虹鱒紅肌中FASN、CPT1和pparα2 mRNA表達均無顯著變化。本研究發(fā)現(xiàn)紅發(fā)夫酵母蝦青素可顯著促進虹鱒紅肌Sirt1基因表達，這與Zhang（2017）對小鼠的研究結(jié)果相似。Sirt1是一種III類組蛋白脫乙酰酶，是sirtuin家族中最重要的蛋白質(zhì)，通過激活AMPK調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝（Naderi，2019；Hou，2008）。由于紅肌中具有較高的脂質(zhì)含量和β-氧化能力（Wu，2018；Stubhaug，2005），這可能導致蝦青素對其作用不明顯。

4 結(jié)論

飼料中添加紅發(fā)夫酵母蝦青素和人工合成蝦青素能在一定程度上改善虹鱒紅肌抗氧化能力，并調(diào)控其脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達。此外，紅發(fā)夫酵母蝦青素能通過降低紅肌GSSG含量增強谷胱甘肽反應(yīng)，而人工合成蝦青素對虹鱒紅肌谷胱甘肽代謝系統(tǒng)無顯著影響。