瞿巖儼，楊子嘉，李 軍，李 溱,*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院，北京 100193；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)網(wǎng)絡(luò)技術(shù)中心，北京 100083）

普洱茶產(chǎn)自云南西南部，以云南特有的大葉種茶青鮮葉經(jīng)過萎凋、殺青、揉捻、曬干制成曬青毛茶，即普洱生茶[1]。普洱生茶經(jīng)過渥堆發(fā)酵后得到普洱熟茶[2]。云南大葉種茶樹是喬木，與常見的灌木型小葉種茶樹在外形上有顯著差異[3]。云南現(xiàn)存大量樹齡超過一百年、甚至五百年的大葉種古茶樹。由于歷史和自然條件等原因。一些古樹茶園在生產(chǎn)過程中被荒廢，在一定時(shí)期內(nèi)處于無人管理的荒廢狀態(tài)。荒廢茶園在恢復(fù)采摘和人工管理后，初期采摘茶葉的品質(zhì)往往不佳，有較強(qiáng)的苦澀味并缺乏香氣。在經(jīng)過3～5 a的采摘和人工管理后，茶葉苦澀味逐步褪去，香氣逐步提升，品質(zhì)逐步恢復(fù)。本研究于2018年在云南省臨滄市雙江縣勐庫鎮(zhèn)祭天山一個(gè)已經(jīng)被荒廢超過60 a的古樹茶園采集了處于自然野生狀態(tài)的茶青，制作成普洱生茶，又分別于2020年和2021年再次在該茶園收集經(jīng)過采摘和人工管理2～3 a后的茶青，制成普洱生茶。經(jīng)過對(duì)比品飲發(fā)現(xiàn)，2018年初次采摘的普洱生茶味道苦澀，沒有普洱茶特征性的清香和花果香，氣味如同腐爛的木頭。而2020年采摘的茶葉帶有普洱茶特有的清香，且入口苦澀味也有所減弱。2021年采摘的普洱茶，則香氣清純持久、滋味濃厚回甘。

本研究使用基于高分辨質(zhì)譜的代謝組學(xué)技術(shù)，對(duì)野生普洱茶和經(jīng)過人工采摘和管理的普洱茶的內(nèi)含物質(zhì)進(jìn)行分析，解析普洱茶口味和品質(zhì)變化與其內(nèi)含物質(zhì)之間的關(guān)聯(lián)關(guān)系。對(duì)普洱茶的無機(jī)離子、氨基酸、可溶性糖、黃酮、多酚、抗氧化能力進(jìn)行分析，結(jié)合細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究野生普洱茶和經(jīng)過人工管理的普洱茶細(xì)胞毒性和抗氧化能力差異，旨在為解析野生大葉種茶樹在人工管理下的演化機(jī)制提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

普洱古樹生茶樣品由云南國(guó)色端莊茶葉有限公司提供，分別于2018、2020、2021年3月底至4月初采摘于云南省臨滄市雙江縣勐庫鎮(zhèn)祭天山。茶葉嫩度為一芽?jī)扇~和一芽三葉，并在當(dāng)年按照GB/T 22111—2008《地理標(biāo)志產(chǎn)品 普洱茶》以相同的加工工藝制作成普洱生茶餅，茶餅在室溫條件下在昆明倉庫密閉貯藏。2018年是該茶園荒廢超過60 a后的首次人工采摘。

氨基酸、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)品 美國(guó)Sigma公司；AccQ·Tag氨基酸衍生劑 美國(guó)Waters公司；超純水、乙腈（均為色譜級(jí)） 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；乙酸銨、甲酸（均為色譜級(jí)） 北京迪科馬科技有限公司；用于檢測(cè)細(xì)胞增殖及毒性的試劑盒（Biorigin/BN15201）、2’,7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA）活性氧（reactive oxygen species，ROS）檢測(cè)試劑盒（Biorigin/BN16033） 北京百瑞極生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

I-Class超高效液相色譜儀 美國(guó)Waters公司；Q-Exactive Focus高分辨質(zhì)譜儀、ICS-5000離子色譜儀美國(guó)賽默飛世爾科技公司；R-5418離心機(jī)、Thermomixer振蕩儀 德國(guó)Eppendorf公司；KC-10S超聲儀 中國(guó)寧波碩力公司；BSA2202S天平 德國(guó)Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

茶葉樣品使用研缽研磨成粉末，準(zhǔn)確稱取0.02 g茶葉粉末放入離心管中，加入1 mL去離子水，室溫超聲提取30 min，14 000 r/min離心10 min，取上清過0.1 μm濾膜，進(jìn)行后續(xù)的無機(jī)離子、可溶性糖、氨基酸含量分析和代謝組學(xué)分析等。

1.3.2 無機(jī)離子、可溶性糖含量分析

將茶葉提取液稀釋后進(jìn)行離子色譜分析，每種樣品3 個(gè)重復(fù)。陽離子使用20 mmol/L的甲磺酸流動(dòng)相，Dionex CS12A陽離子交換柱（4 mm×250 mm）和電導(dǎo)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[4]?？扇苄蕴鞘褂肈ionex PA10色譜柱（4 mm×250 mm），流動(dòng)相為純水和200 mmol/L NaOH溶液的梯度洗脫程序，使用電化學(xué)檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)[5]。

1.3.3 游離氨基酸含量檢測(cè)

取10 μL茶葉提取液，加入50 μL硼酸鹽緩沖液和20 μL氨基酸衍生劑，室溫放置1 min，55 ℃振蕩器加熱振蕩10 min，冷卻至室溫后進(jìn)行質(zhì)譜分析，每種樣品3 個(gè)重復(fù)。使用Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流動(dòng)相A為20 mmol/L乙酸銨（pH 5.0），流動(dòng)相B為乙腈溶液（乙腈-水，80∶20，V/V），洗脫程序：0 min，97% A，3% B；2 min，97%～88% A，3%～12% B；9.5 min，88%～66% A，12%～34% B；10～12 min，66%～0% A，34%～100% B；12.5～15.5 min，0%～97% A，100%～3% B。流速0.3 mL/min；柱溫40 ℃；樣品室溫度15 ℃；進(jìn)樣量1 μL。使用Q-Exactive Focus高分辨質(zhì)譜儀檢測(cè)色譜洗脫物的一級(jí)和二級(jí)質(zhì)譜，正離子模式；毛細(xì)管溫度320 ℃；噴霧電壓3.5 kV；輔助氣溫度350 ℃；霧化氣，輔助氣和反吹氣流速分別為35、10、5 個(gè)單位；質(zhì)量掃描范圍m/z70～1 000[6]。

1.3.4 代謝組學(xué)分析

1.3.4.1 樣品處理及分析條件

將茶葉提取液稀釋后進(jìn)行基于高分辨質(zhì)譜的代謝組學(xué)分析，每種樣品6 個(gè)重復(fù)，將茶葉提取物等量混合得到質(zhì)控樣品。使用Acquity BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相A為水（含有0.1%甲酸），流動(dòng)相B為乙腈（含有0.1%甲酸）；洗脫程序：0 min，95% A，5% B；5 min，95%～70% A，5%～30% B；10 min，70%～5% A，30%～95% B；13 min，5% A，95% B；13.1 min，5%～95% A，95%～5% B；16 min，95% A，5% B。流速0.3 mL/min；柱溫35 ℃；樣品室溫度8 ℃；進(jìn)樣量5 μL[6]。質(zhì)譜條件同氨基酸分析。

1.3.4.2 茶葉內(nèi)含物質(zhì)含量測(cè)定

向200 μL茶葉提取物中加入2.5 mL 0.1 mol/L福林-酚試劑，混勻后靜置5 min，加入2 mL 7.5% Na2CO3溶液和5 mL水，室溫避光放置1 h，檢測(cè)反應(yīng)后溶液在波長(zhǎng)765 nm處的吸光度，以沒食子酸作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定茶葉中總酚含量。

向50 μL茶葉提取液中加入3 mL鐵離子還原/抗氧化能力試劑和6 mL水，37 ℃放置20 min，檢測(cè)反應(yīng)后溶液在波長(zhǎng)590 nm處的吸光度，以抗壞血酸作為標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)定茶葉的抗氧化能力[7]。

1.3.5 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

對(duì)照組培養(yǎng)基：未加茶葉提取物的DMEM培養(yǎng)基。實(shí)驗(yàn)組培養(yǎng)基：每1 mL DMEM培養(yǎng)基加入20 μL茶葉提取物的培養(yǎng)基，每種茶葉做5 個(gè)重復(fù)。U2OS細(xì)胞系由中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)生物學(xué)院傅靜雁教授課題組提供。

CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：取4 000 個(gè)U2OS細(xì)胞懸液鋪板（96 孔板），貼壁后使用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)基在37 ℃，5%二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h，棄掉培養(yǎng)基，用新鮮培養(yǎng)基清洗后，加入100 μL培養(yǎng)基和10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育3 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm處吸光度[8-9]。

DCFH-DA測(cè)定ROS：用無血清培養(yǎng)基將DCFH-DA探針稀釋1 000 倍作為工作液（8 μL母液+8 mL培養(yǎng)基）。取密度為1.5×105/mL的細(xì)胞懸液鋪板（35 mm培養(yǎng)皿），貼壁后利用實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組培養(yǎng)基培養(yǎng)8 h（培養(yǎng)條件同上）。之后棄掉培養(yǎng)基，用無血清培養(yǎng)基清洗兩次，加入1 mL DCFH-DA探針工作液。37 ℃孵育30 min，進(jìn)行熒光檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm[10]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及圖表繪制

無機(jī)離子、可溶性糖含量分析的離子色譜數(shù)據(jù)使用Chromeleon7.2 SR5軟件進(jìn)行峰面積積分和定量分析。在游離氨基酸含量檢測(cè)中，質(zhì)譜數(shù)據(jù)使用Xcalibur軟件進(jìn)行峰提取，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積計(jì)算樣品中游離氨基酸的含量。在代謝組學(xué)分析中，質(zhì)譜采集的原始數(shù)據(jù)導(dǎo)入Progenesis QI軟件（美國(guó)Waters公司）進(jìn)行色譜保留時(shí)間對(duì)齊、質(zhì)譜峰匹配與峰面積提取，單因素方差分析（ANOVA），并篩選具有組間顯著性差異的化合物。QI軟件提取的質(zhì)譜特征峰列表導(dǎo)入SIMCA-P 13.0軟件（瑞典Umetrics公司）中，進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和偏最小二乘判別分析。篩選得到的差異化合物使用二級(jí)質(zhì)譜結(jié)合HMDB和茶葉代謝物數(shù)據(jù)庫進(jìn)行鑒定。柱狀圖繪制利用GraphPad Prism（GraphPad Software）和Origin軟件（OriginLab），熱圖分析使用Origin軟件。顯著性分析利用SPSS軟件（美國(guó)SPSS股份有限公司）進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）中的Duncan分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無機(jī)離子含量

圖1 不同采摘年份普洱生茶中K+含量Fig. 1 Contents of K+ in raw Pu-erh tea picked in different years

K+可以維持適當(dāng)?shù)目缒る娢唬{(diào)節(jié)細(xì)胞膨壓，還作為酶的輔基參與代謝調(diào)節(jié)[11]。植物在缺K+時(shí)，抗旱、抗寒能力下降，葉片失水，老葉邊緣焦枯[12]。2020年和2021年茶葉中K+含量存在顯著差異（圖1），但不同年份采摘的茶葉中K+含量均為10 mg/g左右，2020年與2021年茶葉的K+含量?jī)H相差8.7%，說明人工管理對(duì)茶葉中K+含量的影響較小，茶樹生長(zhǎng)環(huán)境較穩(wěn)定。

2.2 可溶性糖含量

圖2 不同采摘年份普洱生茶中葡萄糖、蔗糖含量Fig. 2 Contents of glucose and sucrose in raw Pu-erh tea picked in different years

普洱茶中檢測(cè)到主要的可溶性糖為葡萄糖和蔗糖，其中蔗糖含量略高于葡萄糖（圖2）。2018年和2020年茶葉的葡萄糖含量具有顯著差異，但變化倍數(shù)較小，僅為1.093 倍，而2020年采摘茶葉的蔗糖含量明顯高于其他2 個(gè)年份，說明人工管理過程會(huì)顯著影響茶葉的可溶性糖含量。蔗糖可以降低多酚類物質(zhì)的澀味強(qiáng)度及持續(xù)時(shí)間，這可能是2020年茶滋味改善的原因之一[13]。

2.3 代謝組學(xué)分析

2.3.1 PCA結(jié)果

圖3 不同采摘年份的普洱生茶差異代謝物PCA得分圖Fig. 3 Principal component analysis score plot of differential metabolites in raw Pu-erh tea picked in different years

表1 不同采摘年份的普洱生茶差異化合物信息Table 1 Information about the differential compounds in raw Pu-erh tea picked in different years

續(xù)表1

對(duì)3 個(gè)年份采摘的普洱茶進(jìn)行高分辨質(zhì)譜分析，共檢測(cè)到5 322 個(gè)特征質(zhì)譜峰，其中滿足P≤0.05，變異系數(shù)≤20%，變化倍數(shù)≥1.5的特征峰有1 104 個(gè)，對(duì)這1 104 個(gè)質(zhì)譜峰進(jìn)行PCA，質(zhì)控樣品很好地聚集在PCA得分圖的中間，不同年份采摘的茶可以明顯分開，且隨采摘年份呈現(xiàn)規(guī)律性的分布，顯示人工干預(yù)對(duì)普洱茶內(nèi)含物質(zhì)的組成與含量產(chǎn)生顯著影響（圖3）。

2.3.2 差異代謝物鑒定

從5 322 個(gè)特征質(zhì)譜峰中篩選了P≤0.05，變異系數(shù)≤20%，變化倍數(shù)≥1.5，變量投影重要性大于0.94，質(zhì)譜峰面積大于7 400的400 個(gè)峰進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜鑒定，共鑒定到69 個(gè)差異代謝物。其中包括黃酮及其衍生物類物質(zhì)18 個(gè)，兒茶素類/多酚類物質(zhì)16 個(gè)，生物堿類物質(zhì)11 個(gè)，其他代謝物5 個(gè)（表1）。對(duì)鑒定到差異代謝物進(jìn)行熱圖分析（圖4），發(fā)現(xiàn)大部分兒茶素類物質(zhì)在2021年茶葉中含量較高；部分兒茶素類、部分黃酮及其衍生物類在2020年茶葉中含量較高，而大多數(shù)黃酮及其衍生物類物質(zhì)在2018年茶葉中含量較高，說明采摘和人工管理對(duì)茶葉中兒茶素及黃酮及其衍生物等內(nèi)含物質(zhì)的組成與含量產(chǎn)生了較大影響。

總的來看，2021年茶中兒茶素類化合物含量較高，是2021年茶湯入口回甘的主要原因。而2018年茶中黃酮及其衍生物含量較高，是2018年茶湯苦澀的原因之一。2020年茶葉則體現(xiàn)了2018年向2021年的轉(zhuǎn)化過程，茶葉中兒茶素類物質(zhì)逐漸增加，黃酮及其衍生物逐漸減少。表明采摘和人工管理可以顯著改變茶葉的化學(xué)組成，進(jìn)而改善其口感與品質(zhì)。

圖4 不同采摘年份普洱生茶差異代謝物熱圖Fig. 4 Heatmap of differential metabolites in raw Pu-erh tea picked in different years

2.3.3 兒茶素/多酚類化合物

兒茶素類化合物是茶葉中最主要的多酚，約占茶葉中茶多酚含量的60%～80%[14]，具有卓越的清除ROS、抑制腫瘤細(xì)胞增殖能力[15-16]。兒茶素類化合物呈味苦澀回甘，是茶葉中重要的呈味物質(zhì)[17]。Robichaud等[18]的研究認(rèn)為兒茶素類化合物的苦味強(qiáng)于澀味。采摘于2018年茶葉中(-)-表沒食子兒茶素3-對(duì)-香豆酸酯和鞣花酸含量較高。而2020年采摘的茶葉中7-沒食子酰兒茶素、1,4-二-O-咖啡酰奎尼酸、(+)-沒食子兒茶素、表沒食子酰兒茶素、聚酯型兒茶素C等含量較高。2021年采摘的茶葉中沒食子酸及沒食子酸酯、3’-沒食子酰原翠雀素B2、異茶黃素、3-O-沒食子酰金縷梅單寧、茶黃酸、異茶黃素3’-沒食子酸酯等含量較高（圖4）?；瘜W(xué)分析顯示3 個(gè)年份茶葉中總多酚含量沒有顯著差異（圖5），說明采摘和人工管理會(huì)對(duì)茶葉中總多酚含量影響較小，但會(huì)顯著改變茶葉中兒茶素類化合物組成和相對(duì)含量。

圖5 不同采摘年份普洱生茶多酚含量分析Fig. 5 Contents of polyphenols in raw Pu-erh tea picked in different years

2.3.4 黃酮類化合物

黃酮類化合物是茶葉中重要的呈味和活性物質(zhì)，其呈味苦澀，可以增強(qiáng)咖啡因的苦味[19]，同時(shí)具有清除氧由基等抗氧化作用[20]。黃酮類化合物可以通過腸道微生物群發(fā)揮其抗氧化、降血脂、調(diào)血糖、抑炎癥等生理功效，預(yù)防二型糖尿病、阿茲海默癥等多種疾病[21]。在本實(shí)驗(yàn)鑒定到屬于黃酮及其衍生物類物質(zhì)的差異代謝物中，花旗松素3-阿拉伯糖苷、芹菜苷、花青素7-葡萄糖苷等黃酮類化合物在2021年茶葉中含量最高，而飛燕草素3-(3’-p-香豆酰葡糖苷)、槲皮素3-(3-p-香豆酰葡糖苷)等在2020年采摘的茶葉中含量較高，而其余的大部分黃酮及其衍生物類化合物均在2018年含量較高（圖4）。

2.3.5 生物堿類化合物

圖6 不同采摘年份普洱生茶中咖啡因含量Fig. 6 Contents of caffeine in raw Pu-erh tea picked in different years

咖啡因、可可堿、次黃嘌呤均為次黃嘌呤類生物堿，它們是茶葉苦味的主要來源[22]。通常認(rèn)為咖啡因可以與兒茶素類化合物相互作用，增強(qiáng)兒茶素類化合物的回甘與苦味，但是對(duì)兒茶素類化合物的澀味影響不大[17]?？煽蓧A則可作為支氣管舒張劑和血管舒張劑[23]。對(duì)咖啡因的質(zhì)譜信號(hào)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同年份采摘的茶葉中咖啡因含量相差不大（圖6）?？煽蓧A在2021年采摘茶葉中含量最高，在2020年與2018年采摘茶葉中含量相差不大，而次黃嘌呤在2018年茶中含量最高（圖4）?？Х纫蚣s占茶葉干質(zhì)量的1%～5%，不同年份采摘茶葉中咖啡因含量保持穩(wěn)定說明人工干預(yù)沒有對(duì)茶樹生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著影響。除了次黃嘌呤類生物堿，游離核苷酸也是重要的呈味物質(zhì)。在2021年茶中含量較高的脫氧肌苷單磷酸是一種5’-單磷酸核苷酸（圖4），被認(rèn)為會(huì)加強(qiáng)鮮味的味覺[24]。

2.3.6 氨基酸含量分析

圖7 不同采摘年份普洱生茶總氨基酸及茶氨酸含量Fig. 7 Contents of total amino acids and theanine in raw Pu-erh tea picked in different years

氨基酸是茶葉中重要的呈味物質(zhì)。對(duì)比3 個(gè)年份采摘茶葉的總氨基酸含量（圖7），采摘于2018年茶中總氨基酸含量最低，為49.53 μmol/g（8.03 mg/g）；2021年最高，為63.31 μmol/g（10.00 mg/g）；2020年為57.85 μmol/g（9.20 mg/g）。

茶葉中含量最高的氨基酸是茶氨酸，是茶葉鮮爽味的主要來源[25]，茶氨酸還可以減緩心理和生理應(yīng)激反應(yīng)，舒緩情緒[26]。2021年采摘的茶葉中茶氨酸含量達(dá)到25.10 mol/g，對(duì)應(yīng)茶葉的鮮爽味也最強(qiáng)（圖7），說明采摘和人工管理會(huì)顯著改善茶葉中茶氨酸的含量，提高茶葉品質(zhì)。連續(xù)人工管理和采摘4 a（2021年）茶葉中的丙氨酸（2.44 μmol/g）和谷氨酰胺（3.49 μmol/g）含量也都顯著高于長(zhǎng)期未采摘的茶葉（2018年，0.99 μmol/g和1.23 μmol/g），丙氨酸和谷氨酰胺都呈鮮味，表明人工管理可以顯著提高茶葉的鮮爽度[27]（圖8）。

圖8 不同采摘年份普洱生茶氨基酸含量變化熱圖Fig. 8 Heatmap of amino acid contents in raw Pu-erh tea picked in different years

采摘于2021年茶中的賴氨酸含量明顯低于其他年份。2018、2020和2021年茶中賴氨酸含量分別為1.18、0.64 μmol/g和0.68 μmol/g，賴氨酸呈苦味[28-29]，其含量隨采摘時(shí)間增加而下降說明人工管理可以有效改善茶葉的苦澀（圖8）。

茶葉中精氨酸的含量在人工管理后迅速上升，2018年茶葉中精氨酸含量為0.70 μmol/g，到了2020年，精氨酸含量迅速提高到3.99 μmol/g，到2021年仍維持3.27 μmol/g的高含量。精氨酸呈苦味回甘[30]，被認(rèn)為具有增香作用[31]，其含量在人工采摘后迅速上升，表明人工管理可以顯著提高茶葉的香氣，同時(shí)可以加強(qiáng)茶葉的回甘（圖8）。

對(duì)不同年份采摘茶葉的氨基酸含量進(jìn)行聚類分析（圖8），結(jié)果分成3 類，第1類在長(zhǎng)期未采摘的茶葉（2018年）中含量最高，主要是呈苦味的氨基酸，如苯丙氨酸、賴氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和組氨酸等[32]；第2類在2020年茶葉中含量最高，包括呈鮮味的天冬氨酸和有增香作用的精氨酸；第3類在2021年茶葉中含量最高，主要是呈鮮味的氨基酸，如茶氨酸、谷氨酸，以及呈甜味的氨基酸，如蘇氨酸和丙氨酸[6]。另外，具有鎮(zhèn)靜、抗壓等生理活性的γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）也是在2021年茶中含量最高[33]。

從氨基酸定量分析和聚類分析結(jié)果看，長(zhǎng)期未采摘茶葉的氨基酸總含量低，且呈苦味的氨基酸含量高。開始每年的正常采摘之后，茶葉中氨基酸總含量增加，呈苦味的氨基酸含量降低，呈甜味和鮮味的氨基酸含量增加，且GABA含量也隨之增加，茶葉的品質(zhì)隨采摘時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸提高。

2.3.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和ROS測(cè)定實(shí)驗(yàn)

圖9 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和ROS測(cè)定實(shí)驗(yàn)Fig. 9 Inhibitory effect of raw Pu-erh tea picked in different years on tumor cell proliferation and ROS scavenging effect

研究表明綠茶提取液可以抑制骨肉瘤癌細(xì)胞的遷移[34]，本實(shí)驗(yàn)使用U2OS細(xì)胞（骨肉瘤細(xì)胞）表征茶湯的細(xì)胞毒性和抗氧化能力。CCK-8細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明，茶湯可以顯著抑制U2OS細(xì)胞的增殖。其中2021年采摘茶葉的茶湯對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的抑制最明顯，2018年次之，2020年茶葉的茶湯對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的抑制最弱（圖9）。

圖10 不同采摘年份的普洱生茶抗氧化能力分析Fig. 10 Antioxidant capacity of raw Pu-erh tea picked in different years

茶葉中的多酚與黃酮均有抗氧化的作用?；瘜W(xué)分析結(jié)果顯示，不同年份采摘茶葉在細(xì)胞外的抗氧化能力沒有顯著差異（圖10）。但DCFH-DA細(xì)胞ROS自由基分析顯示采摘于2021年茶葉對(duì)U2OS細(xì)胞內(nèi)ROS的清除能力最強(qiáng)，2018年茶湯次之，2020年茶湯對(duì)U2OS細(xì)胞內(nèi)ROS清除能力最弱（圖9）。

細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和ROS測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，采摘于2021年茶葉對(duì)U2OS細(xì)胞增殖的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)ROS的清除能力也最強(qiáng)。即2021年采摘的茶葉在抗癌、抗氧化方面的功效更好。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)使用離子色譜、高效液相色譜-高分辨率質(zhì)譜聯(lián)用、化學(xué)分析和細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)等方法，解析了經(jīng)過多年荒廢后的云南大葉種茶樹在恢復(fù)采摘和人工管理后內(nèi)含物質(zhì)的變化規(guī)律，及其與普洱茶品質(zhì)、口味和保健功效的關(guān)聯(lián)關(guān)系。研究結(jié)果表明茶葉無機(jī)離子、咖啡因、總多酚含量較為穩(wěn)定，說明茶樹生長(zhǎng)較為穩(wěn)定?；瘜W(xué)分析結(jié)果顯示3 個(gè)年份采摘茶葉的抗氧化能力無顯著差異，但細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)和ROS測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示2021年采摘茶葉對(duì)U2OS細(xì)胞內(nèi)ROS的清除作用最強(qiáng)，對(duì)U2OS腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用也最強(qiáng)。氨基酸定量分析結(jié)果顯示，經(jīng)過多年荒廢后的茶葉中氨基酸總含量低，且呈苦味的氨基酸含量高，而經(jīng)過多年人工采摘后（2021年），茶葉氨基酸總含量以及呈鮮味和甜味的氨基酸含量均顯著高于其他兩個(gè)年份的茶葉。

代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)可以用于區(qū)分不同采摘年份茶葉的69 個(gè)化合物。其中呈味苦澀的黃酮及其衍生物類化合物和生物堿中的次黃嘌呤等在2018年茶葉中含量較高；呈味苦澀但能增強(qiáng)回甘和增強(qiáng)鮮味的物質(zhì)，如兒茶素類物質(zhì)、生物堿中的脫氧肌苷單磷酸等在2021年茶中含量較高；而2020年茶介于2018和2021年之間，呈味苦澀但能增強(qiáng)回甘和增強(qiáng)鮮味的物質(zhì)較2021年茶中較少，而呈味苦澀的物質(zhì)較2018年的較少。

綜上，經(jīng)過4 a人工管理后，2021年采摘的普洱生茶的品質(zhì)、口味和保健功效均有大幅提升。本研究為解析從荒廢到人工管理轉(zhuǎn)變過程中普洱茶內(nèi)含物質(zhì)的變化規(guī)律提供了理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。