牛燦杰，葉素丹，胡玉霞，王鳳軍，凌 云

（浙江經貿職業(yè)技術學院，浙江 杭州 310012）

隨著經濟水平的逐漸提升，人們對食品的需求逐漸從“吃得放心”轉化為“吃得營養(yǎng)”[1]。營養(yǎng)強化淀粉類食品作為營養(yǎng)強化食品，如營養(yǎng)強化米粉，營養(yǎng)強化面條等發(fā)展迅速[2]，人們越來越關注其營養(yǎng)成分，然營養(yǎng)素檢出不合格的情況較多[3]。水溶性VB1、VB2、VB3（煙酸、煙酰胺）、VB6（吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺）等作為重要的營養(yǎng)成分，對其檢測具有重要意義。目前，針對水溶性維生素的國家標準檢測方法多為單一維生素的檢測，前處理步驟繁瑣，不易操作，檢測周期長。多種水溶性維生素同時檢測的研究方法主要為液相色譜-串聯(lián)質譜法[4-7]和液相色譜法[8-13]。液相色譜-串聯(lián)質譜法儀器價格昂貴、操作難度較大、維護成本高、一般實驗室難以配備。高效液相色譜法則主要采用紫外檢測器進行檢測，部分維生素檢出限較高，干擾嚴重。研究的樣品基質以奶粉[14-18]和保健食品[19-24]居多，且對于VB6的測定多只檢測其中的一種[4-6]，而研究表明，淀粉類食品中含有吡哆醛、吡哆醇和吡哆胺形式的VB6[25]。VB1、VB2、VB3（煙酸、煙酰胺）、VB6（吡哆醇、吡哆醛、吡哆胺）作為強化類食品的重要組成部分[26]，其在營養(yǎng)強化淀粉類食品中同時檢測的方法并鮮見報道?；诖?，本研究采用高效液相色譜-二極管陣列-熒光（high performance liquid chromatography with diode array detector and fluorescence detector，HPLC-DAD-FLD）聯(lián)用的方法檢測強化淀粉類食品中的7種水溶性維生素，對酶解條件、提取液、流動相等實驗條件進行探究；通過不同時間段轉化熒光檢測器激發(fā)、發(fā)射波長實現(xiàn)VB2、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺的同時檢測，降低基質干擾、提高靈敏度，以期建立快速、準確、可同時檢測強化淀粉類食品中多種維生素的檢測方法，打擊無良商家的非法行為，保護消費者權益，為政府監(jiān)督抽查及風險監(jiān)測提供技術支撐，進而促進營養(yǎng)強化食品行業(yè)的健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

強化淀粉類食品：胡蘿卜營養(yǎng)米粉、淮山薏米營養(yǎng)米粉、南瓜玉米營養(yǎng)米粉、原味營養(yǎng)米粉、蛋黃雙歧因子營養(yǎng)米粉、牛肉番茄營養(yǎng)米粉、小米蘋果營養(yǎng)米粉、小米燕麥營養(yǎng)米粉、雞肉蔬菜營養(yǎng)米粉、魚肉DHA營養(yǎng)米粉、果蔬寶多維營養(yǎng)米粉、DHA核桃仁營養(yǎng)米粉、鐵鋅鈣營養(yǎng)米粉、營養(yǎng)強化小面條、均衡營養(yǎng)小面條、多彩果蔬面、多彩雜糧面、營養(yǎng)強化核桃面、營養(yǎng)均衡菠菜面、牛油果菠菜營養(yǎng)面條，以上樣品主要來源于市購。

VB1（鹽酸硫胺素，純度99.9%）、VB2（純度98.0%）、煙酸（純度99.8%）、煙酰胺純度（純度99.8%）、鹽酸吡哆醇（純度99.9%）、鹽酸吡哆醛（純度99.9%）、雙鹽酸吡哆醇（純度99.9%） 北京壇墨質檢科技有限公司；鹽酸（分析純） 杭州嘉辰化工有限公司；磷酸（色譜純，85%） 濟寧誠泰化工有限公司；十二烷基硫酸鈉（離子對色譜純）、淀粉酶（α-淀粉酶，生物酶活力≥1.5 U/mg） 上海麥克林試劑公司；磷酸二氫鉀（分析純） 西隴科學股份有限公司；乙腈（色譜純） 美國Tedia公司；實驗所用的水均為超純水。

1.2 儀器與設備

UltiMate 3000 DGLC雙三元高效液相色譜儀（配有DAD、FLD及變色龍Chromeleon7色譜數據處理系統(tǒng)）美國Thermo Fisher公司；SK6200LHC超聲儀 上?？茖С晝x器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標準溶液配制

分別準確稱取VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、鹽酸吡哆醛、雙鹽酸吡哆胺、鹽酸吡哆醇標準物質，用0.01 mol/L鹽酸溶液溶解并定容，配制成標準儲備液，VB1質量濃度為100 mg/L，VB2質量濃度為50 mg/L，煙酸質量濃度為500 mg/L，煙酰胺質量濃度為500 mg/L，鹽酸吡哆醛質量濃度為100 mg/L，雙鹽酸吡哆胺質量濃度為100 mg/L，鹽酸吡哆醇質量濃度為100 mg/L，再用水逐級稀釋成系列混合標準工作液。

1.3.2 樣品前處理

準確稱取5 g樣品（已經粉碎并混合均勻）于具塞錐形瓶中，加入40 mL超純水，加入0.5 g淀粉酶，在60 ℃振蕩水浴鍋中，振蕩酶解45 min，用鹽酸溶液調pH 1.7，放置2 min后，再用氫氧化鈉水溶液調pH 4.5，充分混勻后于超聲儀中超聲提取10 min，轉移定容至100 mL容量瓶中，過0.22 μm水膜，上機。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相：A相為十二烷基硫酸鈉溶液（5 mmol/L，加入0.1%磷酸，再用三乙胺調節(jié)pH值至3.0），B相為乙腈；梯度洗脫條件：0～5.0 min，90% A，10% B；5.0～20 min，90%～38% A，10%～62% B；20.1～25.0 min，38%～90% A，62%～10% B；25.1～33.0 min，90% A，10% B。流速1 mL/min；進樣量10 μL；檢測器為DAD串聯(lián)FLD，DAD檢測波長為261、245 nm。FLD：0～10 min，激發(fā)波長462 nm，發(fā)射波長522 nm，10～28 min，激發(fā)波長293 nm，發(fā)射波長462 nm。

1.4 數據處理

采用UltiMate 3000 DGLC雙三元高效液相色譜儀的變色龍Chromeleon7色譜數據處理系統(tǒng)及Excle軟件進行圖譜分析及數據處理。

2 結果與分析

2.1 檢測波長的選擇

取7種維生素的標準溶液分別進樣，在190～800 nm波長下進行掃描，見圖1。VB1、煙酸、煙酰胺分別在波長246、261 nm左右有最大吸收，因此選為檢測波長；VB2在波長267、445 nm處有最大吸收，吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺在波長290 nm左右有最大吸收；采用最大吸收波長作為檢測波長進行色譜條件摸索，確定各目標物質出峰時間，VB2、VB6有熒光特性，采用熒光檢測代替紫外檢測，既可以提高檢測靈敏度降低檢出限，同時可以大大減少干擾峰的影響。因此，根據VB2、VB6的熒光特性，在VB2的出峰時間段采用激發(fā)波長462 nm，發(fā)射波長522 nm，在VB6的出峰時間段選用激發(fā)波長293 nm，發(fā)射波長462 nm，進行檢測。

圖1 7種水溶性維生素光譜圖Fig. 1 Spectra of seven water-soluble vitamins

2.2 流動相的選擇

目前，多種水溶性維生素同時檢測，常用流動相主要為磷酸氫二鉀緩沖液[13,20]、離子對試劑[10,22-24,27]。在已有實驗條件下，研究發(fā)現(xiàn)，采用磷酸氫二鉀緩沖液[13]（0.05 mol/L，pH 6.0），VB1、VB2、吡哆醇分離良好，煙酸峰出現(xiàn)肩峰，經光譜輔助定性為同種物質，考慮為流動相pH值的影響，吡哆醛、吡哆胺未出峰；采用磷酸氫二鉀緩沖液[20]（0.05 mol/L，pH 3.0），煙酸峰形良好，即pH 3.0左右，有利于改善煙酸的峰形，吡哆醛、吡哆胺仍未出峰，考慮目標物質在色譜柱上保留較弱，宜加入離子對試劑。采用離子對試劑十二烷基硫酸鈉緩沖液時[24]（5 mmol/L，含0.05%甲酸），吡哆醛出峰，但峰形不對稱，吡哆胺未出峰，進一步研究發(fā)現(xiàn)，采用十二烷基硫酸鈉（5 mmol/L，加1 mL磷酸，后再用三乙胺調節(jié)pH值至3.0），此時7種維生素得到較好分離，峰形良好，見圖2，三乙胺的加入利于改善吡哆醛的峰形，同時吡哆胺出峰。對不同濃度的十二烷基硫酸鈉緩沖液進行研究發(fā)現(xiàn)，當十二烷基硫酸鈉濃度為1～4 mmol/L時，煙酸、煙酰胺、VB1的峰形會出現(xiàn)不同程度的拖尾，5～20 mmol/L時，7種維生素分離較好，峰形較佳。因此，在保證良好分離及較好峰形的前提下，減少離子對試劑對色譜柱的傷害，因此最終確定十二烷基硫酸鈉（5 mmol/L，加1 mL磷酸，用三乙胺調節(jié)pH值至3.0）作為流動相。研究發(fā)現(xiàn)，乙腈作流動相比甲醇作流動相出峰更快、峰形更好，因此采用乙腈-十二烷基硫酸鈉緩沖液作為流動相進行洗脫。由于7種維生素在色譜柱上保留能力相差較大，因此采用梯度洗脫，但是采用離子對試劑進行梯度洗脫時，短時間梯度快速變化，更容易出現(xiàn)鬼峰及臺階峰，宜適當延長改變梯度的平衡時間。

圖2 7種水溶性維生素色譜圖Fig. 2 Chromatograms of seven water-soluble vitamins

2.3 酶解溫度的選擇

強化淀粉類食品中淀粉含量較高，良好的酶解條件，既要利于目標物質的提取，又要盡可能降低目標物質的損失。在營養(yǎng)強化米粉樣品中加入混合標準溶液，按加工工藝進行充分混勻[28]。實驗研究酶解時間為45 min時，45、50、55、60、65、70 ℃酶解條件下，7種維生素的平均加標回收率（n=6）如圖3所示。結果表明，酶解溫度由45 ℃升至60 ℃時，7種維生素的平均加標回收率逐漸增加，增加速度逐漸減小，可能是隨著溫度升高，越來越接近最佳酶解溫度，酶解反應越來越充分，維生素游離出來；60 ℃升至70 ℃時，維生素的加標回收率有所下降，下降速度逐漸增大，煙酸、煙酰胺的回收率高于其他幾種維生素，可能是溫度升高，降低了淀粉酶的催化效率，同時，可能與維生素自身的穩(wěn)定性有關，在溫度相對較高，近中性的水溶液中煙酸、煙酰胺相對穩(wěn)定，其他維生素更易損失，綜上，選擇酶解溫度為60 ℃。

圖3 不同酶解溫度測得維生素的平均加標回收率（n=6）Fig. 3 Effect of hydrolysis temperature on average recoveries of vitamins from spiked samples (n = 6)

2.4 酶解時間的選擇

在營養(yǎng)強化米粉樣品中加入混合標準溶液，按加工工藝進行充分混勻[28]，酶解溫度60 ℃，考察酶解時間分別為15、30、45、60、75、90 min，測得7種維生素的平均加標回收率（n=6）如圖4所示，酶解時間由15 min升至45 min時，維生素的加標回收率逐漸增加，可能是隨著時間的延長，酶解反應更充分，維生素釋放更充分；由45 min延長酶解時間至60 min時，幾種維生素的加標回收率變化不大，酶解時間由60 min升至90 min時，VB1、VB2、吡哆醛、吡哆胺的加標回收率略微下降，兼顧提高回收率、節(jié)約時間的原則，選擇酶解時間為45 min。

圖4 不同酶解時間測得維生素的平均加標回收率（n=6）Fig. 4 Effect of hydrolysis time on average recoveries of vitamins from spiked samples (n = 6)

2.5 提取液的選擇

結合7種維生素國標法及已有研究[6,20,24,27]，探究酶解后2種前處理方式對檢測結果的影響：方式（1）10%甲醇+0.1%磷酸溶液作提取液；方式（2）先用酸調pH 1.7，靜置2 min后再用堿調pH 4.5。如圖5所示，以基質相對簡單的原味營養(yǎng)強化米粉作基質時，2種前處理方式，7種水溶性維生素的測定平均值（n=6）的相對標準偏差為1.07%～5.38%，小于10%，無明顯差異；兩種處理方式的平均加標回收率（n=6）在92%～103%之間，就準確度而言可以滿足該類實際樣品檢測；但對于較為復雜的樣品基質，如牛肉番茄米粉、果蔬寶營養(yǎng)米粉、營養(yǎng)均衡菠菜小面樣品，采用10%甲醇+0.1%磷酸溶液作提取液時，在VB1、煙酸、煙酰胺的出峰位置會有不同程度的干擾，增加了分離難度，可能是有機溶劑的加入，提取出來部分干擾物質，而采用方式（2）并沒有出現(xiàn)干擾。因此，本實驗采用先用酸調pH 1.7，靜置2 min后再用堿調pH 4.5。

圖5 2種提取方式測得維生素的平均加標回收率（n=6）Fig. 5 Effect of extraction methods on average recoveries of vitamins from spiked samples (n = 6)

2.6 標準曲線及檢出限、定量限結果

按照1.3.1節(jié)配制的系列標準溶液，以待測組分的質量濃度為橫坐標，以色譜峰面積為縱坐標，繪制標準工作曲線，以3 倍信噪比對應的目標物質量濃度為檢出限，以10 倍性噪比對應的目標物質量濃度為定量限，所得7種維生素線性回歸方程、相關系數、檢出限、定量限見表1。

表1 7種維生素的線性關系、檢出限、定量限Table 1 Linear relationships, limits of detection and limits of quantification of seven vitamins

2.7 方法回收率和重復性實驗結果

按優(yōu)化好的實驗條件分別向營養(yǎng)強化米粉樣品中加入標準溶液，根據實際購買樣品標簽上的標識，選定7種維生素的加標水平以評價方法的回收率及重復性。所得數據見表2，VB1的回收率為95.6%～100.6%，相對標準偏差為0.80%～1.25%，VB2的回收率為90.5%～97.2%，相對標準偏差為0.70%～2.50%，煙酸的回收率為95.9%～99.3%，相對標準偏差為0.48%～1.20%，煙酰胺的回收率為92.2%～98.4%，相對標準偏差為0.63%～1.49%，吡哆醛的回收率為93.5%～102.1%，相對標準偏差為1.29%～2.93%，吡哆醇的回收率為92.0%～102.5%，相對標準偏差為2.12%～3.45%，吡哆胺的回收率為91.1%～97.1%，相對標準偏差為1.86%～3.07%，該方法回收率高，精密度好，可滿足強化類淀粉食品中7種維生素同時檢測的要求。

表2 加標回收率和相對標準偏差（n=6）Table 2 Recoveries and RSDs for spiked samples (n = 6)

2.8 本方法與現(xiàn)有方法的比較

取營養(yǎng)強化米粉、營養(yǎng)強化面條各一批次樣品，分別依據本實驗建立方法、國標方法進行檢測，重復6 次平行實驗，所得數據見表3、4。就檢測值看，采用本方法所得測定值與國標方法測定值，均高于標簽標識值，標識值為人為添加的含量，而樣品基質本身含有一定量的維生素，測定值高于標識值合理，更接近真實值；建立的方法與國標方法的測定值沒有明顯差異，建立的方法能夠滿足實際樣品的測定。就檢測項目和時間而言，需要采用4 個國標方法完成7種維生素的檢測，前處理較為耗時，VB1、VB2水解時間均需16 h以上，不同維生素采用不同的流動相體系，完成一批次樣品檢測需要耗時3～4 d，采用本方法0.5 d即可完成檢測，更利于大批量樣品檢測，以滿足風險監(jiān)督快速抽檢的需要。

表3 本實驗建立方法與國標方法測定值對比（營養(yǎng)強化米粉）（n=6）Table 3 Comparison between the results of the HPLC method and the national standard methods for VBs in nutrient-fortified rice flour and the certified values (n = 6) μg/100 g

表4 本實驗建立方法與國標方法測定值對比（營養(yǎng)強化面條）（n=6）Table 4 Comparison between the results of the HPLC method and the national standard methods for VBs in nutrient-fortified noodles and the certified values (n = 6) μg/100 g

2.9 實際樣品檢測

結合本研究方法對20 批次產品進行檢測，結果發(fā)現(xiàn)，根據標簽明示值及GB 28050—2011《預包裝食品營養(yǎng)標簽通則》中對營養(yǎng)成分的判定，所檢樣品中維生素測得值與標簽值均符合。所檢樣品中，有15 批次樣品VB3僅以煙酰胺形式檢出，3 批次以煙酸形式檢出，2 批次樣品同時檢出少量煙酸和煙酰胺；有17 批次樣品VB6的檢出形式為吡哆醇，3 批次檢出吡哆醛、吡哆醇，這可能與商家的添加形式、樣品基質本底量有關。本實驗進行檢測的營養(yǎng)強化淀粉類食品，以主流強化米粉、面條為主，樣品類型及數量比較有限，有待進一步擴大強化淀粉類食品研究范圍。

3 結 論

采用HPLC-DAD-FLD聯(lián)用方法同時快速檢測強化淀粉類食品中VB1、VB2、煙酸、煙酰胺、吡哆醛、吡哆醇、吡哆胺的方法，步驟簡單，節(jié)約時間，方法回收率高，利于大批量強化淀粉類食品中水溶性維生素的快速檢測，為改善現(xiàn)有研究中強化淀粉類食品中多種水溶性維生素同時檢測方法匱乏的現(xiàn)狀提供了基礎技術參考，然本研究中以營養(yǎng)強化淀粉類食品中的主流產品，強化米粉、面條為研究對象，針對其他產品的研究尚欠缺，有待進一步深入研究，以促進營養(yǎng)強化食品行業(yè)的健康發(fā)展。