方佳彥, 梁寶珍, 鄒夢(mèng)琦, 楊宇峰

(廣東省東莞市松山湖中心醫(yī)院, 1. 腫瘤科, 2. 乳腺甲狀腺科, 3. 病理科, 廣東 東莞, 523326)

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在中國，乳腺癌發(fā)病率居女性惡性腫瘤首位[1]。因此，尋找可用于乳腺癌臨床診療及預(yù)后評(píng)估的分子標(biāo)志物至關(guān)重要。黑色素瘤缺乏因子2(AIM2)是一種炎癥小體，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究[2-4]表明, AIM2在非小細(xì)胞肺癌、宮頸癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌等惡性腫瘤中低或高表達(dá)，并且其表達(dá)水平與癌癥患者預(yù)后密切相關(guān)。目前，關(guān)于AIM2與乳腺癌患者生存預(yù)后關(guān)系的研究較少。本研究檢測(cè)乳腺癌組織中AIM2的表達(dá)，并分析AIM2表達(dá)與乳腺癌患者臨床病理特征及生存的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集東莞市松山湖中心醫(yī)院2001年1月—2010年12月收治的118例乳腺癌患者的臨床病理資料。納入標(biāo)準(zhǔn): 患者均為女性; 在本院經(jīng)組織病理首次確診為乳腺浸潤性癌，并接受乳腺切除手術(shù)者; 患者術(shù)前均未行新輔助治療、放療和化療。排除標(biāo)準(zhǔn): 未清掃淋巴結(jié)者; 臨床病理相關(guān)資料不完善者。118例乳腺癌患者年齡為34～72歲，中位年齡為47歲。病理醫(yī)師根據(jù)2019版WHO乳腺腫瘤病理學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)[5]明確乳腺癌病理分類、分級(jí)和分期，其中組織學(xué)分級(jí)Ⅰ級(jí)17例, Ⅱ～Ⅲ級(jí)101例; 非特殊型浸潤性癌114例，特殊型浸潤性癌4例; 有神經(jīng)侵犯32例，無神經(jīng)侵犯86例; 有脈管內(nèi)癌栓34例，無脈管癌栓84例; 較高風(fēng)險(xiǎn)分子分型39例，較低風(fēng)險(xiǎn)分子分型79例; TNM分期Ⅰ～Ⅱ期92例, Ⅲ期26例。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化方法: AIM2抗體購自Sigma公司，稀釋濃度1∶1 000。染色標(biāo)本為原發(fā)乳腺癌組織及相應(yīng)癌旁組織，癌旁組織距癌組織至少2 cm。嚴(yán)格按照說明書步驟進(jìn)行操作，石蠟包埋組織標(biāo)本4 μm厚連續(xù)切片，先后經(jīng)常規(guī)脫蠟、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、高壓抗原修復(fù)、一抗4 ℃過夜，去一抗后，滴加二抗, 37 ℃孵育30 min, 二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色，蘇木素襯染，顯微鏡下觀察染色強(qiáng)度及染色細(xì)胞所占比例。以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗為陰性對(duì)照，已知陽性標(biāo)本為陽性對(duì)照。

1.2.2 結(jié)果判斷: AIM2定位于細(xì)胞漿，其表達(dá)水平通過染色強(qiáng)度及染色面積共同判定。① 染色面積<1%為0分, 1%～25%為1分; >25%～50%為2分; >50%～75%為3分; >75%～100%為4分; ② 染色強(qiáng)度無著色為0分，淡黃色為1分，中等黃色為2分，棕褐色為3分。以2項(xiàng)評(píng)分相乘所得表示蛋白表達(dá)水平，以中位評(píng)分?jǐn)?shù)為蛋白表達(dá)水平的閾值。

1.2.3 隨訪: 通過門診隨訪或電話隨訪記錄患者腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)間、死亡時(shí)間及死亡原因等信息。無瘤生存期為腫瘤手術(shù)切除至腫瘤復(fù)發(fā)間期，總生存期為腫瘤手術(shù)切除至患者死亡間期。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法，計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法進(jìn)行生存分析，采用COX回歸分析進(jìn)行多因素分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 AIM2蛋白在乳腺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)

乳腺癌組織中AIM2蛋白陽性率為25.4%(30/118), 低于癌旁組織的89.0%(105/118), 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=97.360,P=0.001)。 乳腺癌組織中AIM2免疫組化評(píng)分為(2.8±1.7)分，低于癌旁組織的(4.5±2.4)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.375,P=0.001)。見圖1。

A: 乳腺癌組織中AIM2的表達(dá); B: 癌旁組織中AIM2的表達(dá); C: AIM2在乳腺癌組織和癌旁組織中免疫組化評(píng)分比較。放大倍數(shù)為200倍,免疫組化具體方法為SP法。圖1 免疫組化方法檢測(cè)乳腺癌組織和癌旁組織中AIM2的表達(dá)

2.2 AIM2蛋白表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

根據(jù)AIM2在乳腺癌組織中的表達(dá)水平(免疫組化評(píng)分中位數(shù)值3分)將所有患者分為AIM2低表達(dá)及高表達(dá)。乳腺癌組織中AIM2的表達(dá)水平與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、腫瘤臨床分期和脈管內(nèi)癌栓有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); AIM2低表達(dá)與AIM2高表達(dá)患者在年齡、組織學(xué)分級(jí)、組織學(xué)類型、神經(jīng)侵犯和分子分型方面比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05), 見表1。

表1 AIM2表達(dá)與乳腺癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 AIM2蛋白與乳腺癌患者生存期的關(guān)系

AIM2低表達(dá)和AIM2高表達(dá)乳腺癌患者中位無瘤生存期分別為63個(gè)月和88個(gè)月，中位總生存期分別為94個(gè)月和103個(gè)月。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示, AIM2低表達(dá)乳腺癌患者無瘤生存期及總生存期均短于AIM2高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.072、6.101,P=0.004、0.015), 見圖2。

A: AIM2表達(dá)高低與無瘤生存期的關(guān)系; B: AIM2表達(dá)高低與總生存期的關(guān)系。

2.4 乳腺癌患者預(yù)后的COX回歸分析

單因素COX回歸分析顯示，腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期、AIM2蛋白和脈管內(nèi)癌栓是乳腺癌患者無瘤生存期的影響因素，進(jìn)一步多因素COX回歸分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和AIM2蛋白是乳腺癌患者無瘤生存期的獨(dú)立影響因素，見表2; 單因素COX回歸分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤分期和AIM2蛋白是乳腺癌患者總生存期的影響因素，進(jìn)一步多因素COX回歸分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和腫瘤分期是乳腺癌患者總生存期的獨(dú)立影響因素，見表3。

表2 乳腺癌患者無瘤生存期影響因素的COX回歸分析

表3 乳腺癌患者總生存期影響因素的COX回歸分析

3 討 論

近年來乳腺癌發(fā)病率不斷升高，且有逐漸年輕化趨勢(shì)。目前，臨床通過檢測(cè)雌激素受體、孕激素受體、人表皮生長因子受體2及Ki67等分子標(biāo)志物的狀態(tài)粗略區(qū)分乳腺癌分子亞型，進(jìn)而作為臨床開展精準(zhǔn)治療和預(yù)后評(píng)估的依據(jù)。然而，由于乳腺癌的異質(zhì)性，以上述分子標(biāo)記物為基礎(chǔ)的乳腺癌分子分型有待完善，尋找新的潛在分子標(biāo)志物有利于乳腺癌個(gè)體化治療及精準(zhǔn)預(yù)后評(píng)估的進(jìn)一步提升。

AIM2屬HIN-200蛋白家族成員，擁有HIN-200蛋白家族的典型結(jié)構(gòu)域: C-末端的OB結(jié)構(gòu)域和N-末端的熱蛋白結(jié)構(gòu)域。AIM2屬于固有免疫系統(tǒng)，能識(shí)別并結(jié)合病毒或細(xì)菌感染時(shí)釋放到細(xì)胞質(zhì)的雙鏈DNA, 進(jìn)而活化半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-1, 引起白細(xì)胞介素1β和白細(xì)胞介素18的成熟和分泌，或誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[6]。研究[7-8]表明, AIM2不僅可參與固有免疫應(yīng)答，還參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。已有研究表明, AIM2在多種惡性腫瘤中的表達(dá)會(huì)發(fā)生改變。AIM2在EB病毒相關(guān)的鼻咽癌[3]、口鱗狀細(xì)胞癌[9]、非小細(xì)胞肺癌[10]以及人乳頭狀瘤病毒(HPV)病毒相關(guān)的宮頸癌[11]中表達(dá)升高，而在肝細(xì)胞肝癌[12]、腸癌[13]、胃癌[14]、膽管癌[15]和胰腺癌[16]中表達(dá)降低或缺失。AIM2在不同類型癌組織中的表達(dá)差異提示，其在不同類型癌發(fā)生發(fā)展過程中可能具有獨(dú)特的作用，并不是在所有腫瘤中都表現(xiàn)出一致的抑制腫瘤或促進(jìn)腫瘤進(jìn)展的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，AIM2在乳腺癌組織中低表達(dá)，表明乳腺癌中AIM2蛋白表達(dá)下調(diào)。雖然本研究未進(jìn)一步從分子層面揭示AIM2在乳腺癌中低表達(dá)的機(jī)制，但已有研究[17]發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞外游離DNA可誘導(dǎo)乳腺癌MCF7細(xì)胞株果蠅樣受體9(TLR9)表達(dá)，下調(diào)AIM2表達(dá)，敲降TLR9表達(dá)后可上調(diào)AIM2表達(dá)。此外，乳腺癌組織中AIM2蛋白表達(dá)與腫瘤直徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)、脈管內(nèi)癌栓和腫瘤分期相關(guān)，提示AIM2參與乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。研究[18]發(fā)現(xiàn), AIM2通過FcγR信號(hào)被募集到吞噬體中，并通過感知被吞噬的腫瘤DNA而被激活，隨后上調(diào)程序性死亡分子配體1和吲哚胺2, 3-雙加氧酶從而導(dǎo)致免疫抑制。LI Y Q等[19]通過體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AIM2能抑制乳腺癌細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，因此AIM2在乳腺癌中發(fā)揮抑癌效應(yīng)，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其抑癌功能的發(fā)揮與抑制NF-κB的轉(zhuǎn)錄活性有關(guān)。LIU Z Y 等[20]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)AIM2 過表達(dá)后引起細(xì)胞色素C 由線粒體釋放到胞漿，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且其過表達(dá)后凋亡前體蛋白Bax表達(dá)增加，同時(shí)抗調(diào)亡蛋白Bcl-xl表達(dá)下調(diào)，引發(fā)DNA修復(fù)蛋白聚腺苷二磷酸核糖聚合酶的裂解，從而誘發(fā)乳腺癌細(xì)胞調(diào)亡。這些研究說明AIM2在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中起重要作用，深入研究其參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展的具體分子機(jī)制不僅有助于揭示其生物學(xué)功能，還有助于理解其潛在臨床應(yīng)用價(jià)值。

Kaplan-Meier生存分析顯示，與AIM2蛋白高表達(dá)患者相比, AIM2蛋白低表達(dá)的患者有較短的總生存期和無瘤生存期; 進(jìn)一步COX回歸分析發(fā)現(xiàn), AIM2蛋白是乳腺癌患者無瘤生存期的獨(dú)立影響因素。這些結(jié)果表明AIM2可作為預(yù)測(cè)乳腺癌患者手術(shù)后生存的潛在標(biāo)志物。已有研究探討了AIM2表達(dá)與惡性腫瘤患者預(yù)后的關(guān)系。研究[21]顯示, AIM2組織表達(dá)水平是結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素。在肝細(xì)胞肝癌中，分層生存分析結(jié)果表明, AIM2低表達(dá)患者比AIM2高表達(dá)患者有更短的總生存期和無瘤生存期[22]。在膽管癌[15]和胰腺癌[16]中, AIM2低表達(dá)可作為預(yù)測(cè)患者預(yù)后不良的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素。然而，AIM2在EB病毒相關(guān)的鼻咽癌中高表達(dá)，并且其高表達(dá)與鼻咽癌患者較高的生存率相關(guān)，多因素分析進(jìn)一步證實(shí)了AIM2在預(yù)測(cè)宮頸癌患者預(yù)后中的價(jià)值[3]。在非小細(xì)胞肺癌中, AIM2的高表達(dá)與患者預(yù)后不佳密切相關(guān)[10]。這些數(shù)據(jù)不僅表明AIM2有望成為預(yù)測(cè)多種惡性腫瘤患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物，也進(jìn)一步提示其在不同類型癌發(fā)生發(fā)展中的獨(dú)特作用。本研究推測(cè)AIM2在乳腺癌中低表達(dá)可能通過促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞增殖并抑制其凋亡，從而促進(jìn)乳腺癌生長，最終導(dǎo)致AIM2低表達(dá)乳腺癌患者預(yù)后不良[19-20]。

綜上所述, AIM2在乳腺癌組織中低表達(dá)，提示乳腺癌患者預(yù)后不佳。但本研究樣本數(shù)量較少，因此有必要收集更多來自不同醫(yī)院的病例，以進(jìn)一步評(píng)估AIM2在預(yù)測(cè)乳腺癌患者預(yù)后中的價(jià)值。