南文華，吳權明*，張瑞平，王 蕊，孫 佩，張培風，趙彥峰，李合順，王學軍，劉文靜

(1.西北農(nóng)林科技大學，陜西咸陽 712100；2.新鄉(xiāng)市農(nóng)業(yè)科學院，河南新鄉(xiāng) 453000；3.陜西省種子工作總站，陜西西安 710000)

玉米是我國主要糧食，可用于動物飼料和工業(yè)原料等方面，是具有多元用途的作物[1-2]。同時，玉米也是世界上最早且最充分利用雜種優(yōu)勢進行生產(chǎn)的作物之一，國內目前90%以上的玉米生產(chǎn)用種是單交種[3]。玉米產(chǎn)量的提高主要得益于雜種優(yōu)勢利用及優(yōu)良雜交種的普及[4]。玉米雜交種和親本遺傳真實性是種子質量的重要標志之一，直接影響著玉米生產(chǎn)的產(chǎn)量和質量[5]。因此，對玉米雜交種的真實性和純度能夠快速、準確、有效地進行鑒定十分必要。但是，隨著國內種質資源的相互滲透，遺傳基礎趨于狹窄，導致玉米新品種性狀表型相似，在大田基礎上很難區(qū)分[6]。因此，尋求一種操作簡單、省時省力，不受環(huán)境影響且結果可靠的方法非常必要[7-8]。SSR分子標記技術的發(fā)展為玉米雜交種真實性鑒定提供了新的技術手段。SSR作為一種共顯性標記，具有多態(tài)性好、重復性高、安全高效及覆蓋整個基因組的特點[9]，已廣泛應用于玉米雜交種真實性鑒定中。王鳳格等[10]利用篩選出的40對SSR玉米核心引物對3 998份我國審定的玉米品種建立了DNA指紋庫[11]；王蕾等[12]利用17對SSR引物構建了32份黃瓜品種的指紋圖譜；尹祥佳等[13]利用SSR技術與篩選出的引物鑒定玉米雜交種豫玉22的純度；陳國立等[14]用篩選出的7對引物構建了玉米雜交種北青340及其親本的指紋圖譜；李超等[15]利用SSR標記構建了西州蜜系列甜瓜指紋圖譜。此外，SSR分子標記技術還在甜菜[16]、青花菜[17]、食用黃花菜[18]、馬鈴薯[19]、棉花[20]、金銀花[21]、桃子[22]、辣椒[23]等多種作物的指紋圖譜構建、遺傳多樣性分析及純度鑒定等方面發(fā)揮作用。

農(nóng)科大8號是西北農(nóng)林科技大學與楊凌三泰種業(yè)有限公司合作培育的品種，父本是F19，母本是F33。農(nóng)科大8號2012年通過陜西省審定，審定編號是陜審玉2012022號。筆者利用SSR分子標記技術，用40對玉米核心引物，對農(nóng)科大8號及其親本進行分析，根據(jù)SSR分子標記共顯性的原理[24]，篩選出帶型互補清晰、且穩(wěn)定性、重復性好的引物，用來構建農(nóng)科大8號及其親本的指紋圖譜。同時，根據(jù)在相同位置條帶的“有”和“無”分別用“1”和“0”表示，將指紋圖譜數(shù)字化，計算出現(xiàn)相同指紋的概率，以期為快速有效鑒定市場流通的玉米雜交種農(nóng)科大8號的真實性提供鑒定手段和參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑玉米雜交種農(nóng)科大8號及其親本由西北農(nóng)林科技大學提供，40對玉米核心引物序列來自玉米基因數(shù)據(jù)庫(http：//www.maizegbd.org/ssr.php)，并由上海生物工程股份有限公司合成。提取DNA所用CTAB、PCR擴增所需2×PCRMix，以及電泳所用硼酸、EDTA、丙烯酰胺等藥品均購自上海生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1DNA提取。將農(nóng)科大8號及其親本的種子沙培，于光照培養(yǎng)箱中28 ℃暗培養(yǎng)，等玉米葉片長至約10 cm左右時，取至少20株玉米單株的葉片，用CTAB方法分別提取總DNA[25]，加200 μL TE緩沖液溶解，用1%濃度瓊脂糖，于平板電泳槽檢測DNA質量，PCR擴增前可適當稀釋，4 ℃保存?zhèn)溆茫?20 ℃長期保存。

1.2.2PCR擴增及電泳分析。PCR擴增反應總體積15 μL，2×PCR Mix 7.5 μL，DNA 1.0 μL，引物1.0 μL，用滅菌雙蒸水補足體積。擴增程序為：94 ℃預變性6 min，94 ℃ 40 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)，72 ℃延伸10 min[26]。

在擴增產(chǎn)物中加入1 μL 6×上樣緩沖液，于8.0%非變性聚丙烯酰胺凝膠上樣2 μL，電壓150 V電泳，進行分離檢測。最后用銀染顯色，相機拍照保存并分析圖片。

1.2.3指紋圖譜構建及數(shù)字化。根據(jù)電泳結果圖，篩選帶型清晰，且親本條帶互補的引物，用來構建農(nóng)科大8號及其親本的指紋圖譜。同時，用數(shù)字“1”和“0”將指紋圖譜數(shù)字化?！?”和“0”分別代表在相同遷移位置條帶的“有”和“無”2種情況。根據(jù)公式P=1/2n計算出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率[5，27]。

2 結果與分析

2.1 SSR引物篩選根據(jù)40對玉米核心引物對農(nóng)科大8號及其親本DNA擴增的結果，從中篩選出8對條帶清晰、親本條帶互補的引物，用來構建農(nóng)科大8號及其親本的指紋圖譜。這8對引物分別為phi053k2，bnlg2291k4，bnlg2305k4，umc1147y4，bnlg1520k1，umc1489y3，bnlg490y4，umc1936k4(表1)，均分布于6條染色體上，共檢測出17個等位基因，每對引物檢測出2～3個等位基因，平均2.125個，片段大小在100～400 bp。

表1 用于構建農(nóng)科大8號及其親本指紋圖譜引物信息

2.2 農(nóng)科大8號及其親本指紋圖譜構建圖1是篩選出的8對引物(phi053k2，bnlg2291k4，bnlg2305k4，umc1147y4，bnlg1520k1，umc1489y3，bnlg490y4，umc1936k4)所構建的農(nóng)科大8號及其親本的指紋圖譜。從圖1可以看出，這些引物所擴增的農(nóng)科大8號及其親本的帶型穩(wěn)定、清晰，且SSR分子標記是共顯性的遺傳[28]，因此，農(nóng)科大8號父母本條帶是互補的。

注：M.Mark；父.父本F33;H.雜交種農(nóng)科大8號；母.母本F19Note：M. Mark; Father. Male parent F33; H.Hybrid Nongkeda No.8; Mother.Female parent F19圖1 部分SSR引物所構建的玉米雜交種農(nóng)科大8號及其親本指紋圖譜Fig.1 Partial PCR amplification product electrophoresis of hybrid Nongkeda No.8 and its parents identified by SSR primers

2.3 農(nóng)科大8號及其親本指紋圖譜數(shù)字化由表2可知，出現(xiàn)與農(nóng)科大8號及其親本相同指紋圖譜的概率是7.63×10-6，概率極低，由此可推斷由這8對引物構建的農(nóng)科大8號及其親本的指紋圖譜是獨一無二的。證明該研究所篩選出的這8對引物構建的指紋圖譜可用于農(nóng)科大8號的真實性鑒定。

表2 農(nóng)科大8號及其親本的數(shù)字化指紋

3 討論

玉米作為我國重要的糧飼作物[28]，其安全性和真實性不容忽視。目前商業(yè)化育種已成為玉米育種的主要方式，玉米新品種以井噴式涌現(xiàn)[29]。而玉米種子的生產(chǎn)和銷售蘊含著巨大的經(jīng)濟利潤，使得種子市場中的侵權現(xiàn)象嚴重[30]。玉米雜交種的保護和真實性鑒定變得極為重要。

SSR分子標記多態(tài)性極為豐富[31]，特別適合對玉米進行研究[2]，并且在玉米真實性、差異性以及遺傳多樣性等方面有很多成功的例子。戰(zhàn)超等[32]利用SSR分子標記技術對玉米自交系聚類及同源性進行分析，張華生等[2]利用SSR標記對玉米的特異性進行分析，張瑞平等[26]利用SSR標記構建玉米雜交種指紋圖譜等。SSR標記技術在玉米研究中被廣泛應用，可操作性強，結果可靠。

該研究利用SSR分子標記技術構建農(nóng)科大8號及其親本的指紋圖譜，并將指紋圖譜數(shù)字化，計算出現(xiàn)相同指紋圖譜的概率是7.63×10-6，這個概率是極低的，更加客觀和直接地證明該研究篩選出的8對引物所構建的農(nóng)科大8號及其親本的指紋圖譜是特有的，是可以用于鑒定農(nóng)科8號的真實性的。在生產(chǎn)實踐中可從這8對引物中任選2～3對，用來鑒定市場流通的農(nóng)科大8號的真實性，操作簡單易行，結果高效可靠，值得在生產(chǎn)實踐中應用推廣。