宋增炫，陳 媛，米 玲，鄧映明（通信作者）

（梅州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)所生測(cè)室 廣東 梅州 514071）

青翹感冒顆粒為梅州市中醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)院制劑，其標(biāo)準(zhǔn)為廣東省藥監(jiān)局的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)》粵ZB20110012。青翹感冒顆粒由大青葉、連翹、馬鞭草等5 味中藥經(jīng)現(xiàn)代制藥工藝制成，具有清熱與解毒和解表的功效，主要用于治療常見(jiàn)的風(fēng)熱感冒及上呼吸道感染、急性扁桃體炎、咽喉炎。醫(yī)院制劑為了確?；颊吲R床使用的安全性，必須為其制定微生物限度檢查方法（照《中國(guó)藥典》2020 年版）以控制其微生物限度[1]。常規(guī)微生物限度檢測(cè)目前尚無(wú)其微生物限度檢查方法的報(bào)道。中藥成分較復(fù)雜，不同藥味組方常常含有抑菌物質(zhì)，且有些制劑含有防腐劑，常規(guī)微生物檢驗(yàn)法檢驗(yàn)往往會(huì)顯示假陰性的結(jié)果，發(fā)生微生物污染漏檢的情況[2-7]。本實(shí)驗(yàn)建立了青翹感冒顆粒適合的微生物限度方法，提高了醫(yī)院制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為監(jiān)管機(jī)構(gòu)提供了參考。

1.儀器與材料

1.1 儀器

電子天平（AE ADAMHighlandHCB602H）、CL-40M 立式壓力蒸汽滅菌鍋（高山有限公司）、GHO-9080N-3 恒溫培養(yǎng)箱（中國(guó)上海一恒公司）、BPMJ-250F霉菌培養(yǎng)箱（中國(guó)上海一恒公司）、THERMO 1384 A2 生物安全柜（THERMO（上海）儀器有限公司）、BPC-150F 生化培養(yǎng)箱（中國(guó)上海一恒公司）。

1.2 培養(yǎng)基

胰酪大豆胨培養(yǎng)基TSA（批號(hào)：1097453）、TSB胰酪大豆胨培養(yǎng)基（批號(hào)：1107232）、SDA 沙氏葡萄糖培養(yǎng)基（批號(hào)：1097161）、SDB 沙氏葡萄糖培養(yǎng)基（批號(hào)：1085972）、麥康凱MCB（批號(hào)：1093641）、麥康凱MAC（批號(hào)1095291）、腸道菌增菌液體培養(yǎng)基（批號(hào)1196031）、VRBGA（紫紅膽鹽葡萄糖）（批號(hào)1094631）、RV 沙門(mén)菌培養(yǎng)基（批號(hào)1106591）、XLD 瓊脂培養(yǎng)基（批號(hào)1090311）均購(gòu)自環(huán)凱微生物廣東有限公司。經(jīng)過(guò)適用性檢查，符合藥典四部通則1101、1102、1103 規(guī)定。

1.3 試劑

稀釋液：pH 7.0無(wú)菌氯化鈉- 蛋白胨緩沖液，批號(hào)1085991。

1.4 菌種

金黃色葡萄球菌〔CMCC（B）26003-5a8〕，銅綠假單胞菌〔CMCC（B）10104-2a5〕,大腸埃希菌〔CMCC（B）44102-3a〕，枯草芽孢桿菌〔CMCC（B）63501-2a22-3〕均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。白色念珠菌〔CMCC（F）98001-2a〕，購(gòu)與廣東環(huán)凱微生物有限公司。

黑曲霉定量工作菌株 菌種編號(hào)：CMCC（F）98003批號(hào)：1450-2014，由杭州微球科技有限公司提供。

1.5 供試品

青翹感冒顆粒，由梅州市中醫(yī)醫(yī)院提供，批號(hào)20220309、20220323、20220412。

2.方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)菌液的制備

取新鮮培養(yǎng)物（銅綠菌、金葡菌、枯草菌）接種至10 mL TSB（胰酪大豆胨）培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h，取此培養(yǎng)液1 mL 加pH7.0 無(wú)菌Nacl-蛋白緩沖液9 mL，采用10 倍遞增稀釋法制成1 000 ～10 000 cfu/mL 的菌懸液；取新鮮培養(yǎng)物（白念珠菌），接種至10 mL SDB 沙氏葡萄糖培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)48 h，取此培養(yǎng)液1 mL 加pH7.0 無(wú)菌NaCl-蛋白緩沖液9 mL，采用10 倍遞增稀釋法制成每1 000 ～10 000 cfu/mL 的菌懸液；取黑曲霉定量工作菌株，用1.1 mL 復(fù)溶液溶解后，制成1 000 ～10 000 cfu/mL 的菌懸液。以上5 種試驗(yàn)菌用于微生物計(jì)數(shù)。另取銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門(mén)菌制成50 ～100 cfu/mL 的菌懸液，用于控制菌檢查。菌液制備后若在實(shí)驗(yàn)室溫室下放置的，則應(yīng)在2 h 內(nèi)使用完成；若保存在2 ～8 ℃的冰箱，則可在24 h 內(nèi)使用[8-9]。

2.2 供試液的制備

取供試品1 0 g，加入TSB 胰酪大豆胨培養(yǎng)基至100 mL，制成1:10的供試液。取1:10的供試液，加入TSB 胰酪大豆胨培養(yǎng)基制成1:50、1:80 的供試液[10]。

2.3 微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.3.1 平皿傾注法 ①試驗(yàn)組：取1:10的供試液9.9 mL，加入上述（金葡、銅綠、枯草、白念、黑曲霉）5 種試驗(yàn)菌液各0.1 mL，混勻，使其每1 mL 供試液里的加菌量不大于100 cfu。取1 mL 注平皿，每株試驗(yàn)菌每種培養(yǎng)基制備2 個(gè)平皿。②供試品對(duì)照組：取1:10的供試液9.9 mL，加入TSB 胰酪大豆胨培養(yǎng)基0.1 mL，混勻，取1 mL 注平皿，平行制備2 個(gè)平皿[11]。③菌液對(duì)照組：取TSB 胰酪大豆胨培養(yǎng)基9.9 mL,同法加入上述（金葡、銅綠、枯草、白念、黑曲霉）5 種試驗(yàn)菌液各0.1 mL，進(jìn)行微生物回收試驗(yàn)。以上各組平皿按照《中國(guó)藥典》2020年版四部要求注入15 ～20 mL 溫度不超過(guò)45 ℃融化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（用于需氧菌培養(yǎng)）和沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（用于霉菌和酵母菌培養(yǎng)），混勻，凝固，倒置培養(yǎng)。測(cè)定各平皿菌落數(shù)，計(jì)算各試驗(yàn)菌回收率，結(jié)果見(jiàn)表1 和表2。提示需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用平皿傾注法（1:10）實(shí)驗(yàn)，金葡菌和枯草桿菌的回收率結(jié)果低于50%，霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)試驗(yàn)菌回收率均在50%～200%范圍內(nèi)。表明青翹感冒顆粒對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌具有一定的抑菌活性[12]，采用平皿傾注法（1:10）不能消除其抑菌活性，霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)可采用平皿傾注法（1:10）。

表1 平皿傾注法需氧菌系統(tǒng)適用性結(jié)果

表2 平皿傾注法霉菌和酵母菌系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.3.2 稀釋法 ①試驗(yàn)組：取1:50、1:80 的供試液各9.9 mL，加入金葡球菌懸液（2.1）和枯草菌懸液（2.1）各0.1 mL,混勻，分別取1 mL 注皿，每株試驗(yàn)菌平行制備2 個(gè)平皿。并注入15 ～20 mL TSA（胰酪大豆胨瓊脂）培養(yǎng)基，混勻，凝固，倒置培養(yǎng)24 h。測(cè)定各平皿菌落數(shù)，并計(jì)算金葡菌及枯草菌的回收率。②供試品對(duì)照組：取1:50、1:80 的供試液各9.9 mL，不加菌，以胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基代替試驗(yàn)菌液，同試驗(yàn)組操作。③菌液對(duì)照組：取胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基9.9 mL，加入試驗(yàn)組的2 種試驗(yàn)菌液各0.1 mL，其余操作同試驗(yàn)組。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。提示可知需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用稀釋法，金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌回收率低于50%，表明采用稀釋法不能去除其抑菌活性。

表3 稀釋法需氧菌系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.3.3 薄膜過(guò)濾法 ①試驗(yàn)組：取“2.2”項(xiàng)下1:10供試液1 mL 兩組，分別加入置有100 mL 的pH7.0 無(wú)菌NaCl-蛋白緩沖液中，混勻，過(guò)濾。用pH7.0 無(wú)菌NaCl-蛋白緩沖液200 mL 進(jìn)行濾膜沖洗兩次，即100 mL/次，在第2 次1 0 0 mL 的沖洗液中分別加入≤100 cfu 的金葡球菌及枯草桿菌菌液，抽濾結(jié)束后，迅速將濾膜的菌面朝上放置于TSA 胰酪大豆胨培養(yǎng)基平板上。②供試品對(duì)照組：以稀釋液代替試驗(yàn)菌液，其余同試驗(yàn)組制備。③菌液對(duì)照組：以稀釋液代替供試液，其余同法按試驗(yàn)組制備。將上述試驗(yàn)組等各組平皿按照《中國(guó)藥典》2020年版四部要求在規(guī)定條件下培養(yǎng)[13]。測(cè)定各組菌落，計(jì)算、即得各組回收率，結(jié)果金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌回收率均符合通則規(guī)定（50%～200%）的范圍內(nèi)，表明采用薄膜過(guò)濾法可去除青翹感冒顆粒的抑菌活性。取1:10 供試液和用于微生物計(jì)數(shù)的5 種試驗(yàn)菌液，按以上薄膜過(guò)濾法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，見(jiàn)表4。

表4 薄膜過(guò)濾法需氧菌系統(tǒng)適用性結(jié)果

2.3.4 試驗(yàn)結(jié)果 由表4、表2 可知青翹感冒顆粒采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，采用平皿傾注法（1:10）進(jìn)行霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)，各試驗(yàn)菌回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，符合《中國(guó)藥典》2020 年版規(guī)定，表明該方法有效、可行。

2.4 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)（常規(guī)法）

（1）大腸埃希菌。取1:10 的供試液10 mL 和1.0 mL菌懸液（大腸埃希菌）（菌落數(shù)為50 ～100 cfu），加入到100 mL TSB（胰酪大豆胨培養(yǎng)基）中，混勻，于35 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,即為試驗(yàn)組。取1:10 的供試液10 mL，以稀釋液代替試驗(yàn)菌液，其余操作同試驗(yàn)組，作為供試品對(duì)照組。取TSB 代替供試液，其他同供試品對(duì)照組，作為陰性對(duì)照組。分別取上述TSB 培養(yǎng)物1.0 mL接種至100 mL MCB 麥康凱液體培養(yǎng)基中，置44 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。取上述MCB 培養(yǎng)物劃線接種于MAC（麥康凱瓊脂培養(yǎng)基平板）上，于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。（2）耐膽鹽革蘭陰性。取1:10 的供試液，25 ℃預(yù)培養(yǎng)2 h。分別取1 mL 的預(yù)培養(yǎng)物各2 份，1 份加入銅綠假單胞桿菌懸液（不大于100 cfu），1 份加入大腸埃希菌懸液（不大于100 cfu），接種至10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)48 h，作為試驗(yàn)組。取1 mL 預(yù)上述腸道菌增菌液接種至10 mL 腸道菌增菌液體培養(yǎng)基中，作為供試品對(duì)照組。取TSB 代替供試液，其他同供試品對(duì)照組，作為陰性對(duì)照組[14]。取上述EE 培養(yǎng)物接種劃線在VRBGA（紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基）平板上，于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。（3）沙門(mén)菌。①試驗(yàn)組：取供試品10.0 g，加入沙門(mén)1.0 mL 菌懸液（≤100 cfu），直接接種至100 mL TSB 胰酪大豆胨培養(yǎng)基中，混勻、培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)24 h。取上述培養(yǎng)物0.1 mL 接種至10 mLRV 沙門(mén)菌增菌液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)24 h。取少量培養(yǎng)物（RV 沙門(mén)菌增菌液中）劃線接種于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）平板上，35 ℃培養(yǎng)48 h。②供試品對(duì)照組：取供試品10 g，直接接種至100 mL 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，其余操作同試驗(yàn)組。③陰性對(duì)照組：以TSB 代替供試液，其他同供試品對(duì)照組，作為陰性對(duì)照組。（4）試驗(yàn)結(jié)果。以上各組控制菌檢查試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。提示采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)，試驗(yàn)組均能檢出試驗(yàn)菌，陰性對(duì)照組均無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明該試驗(yàn)方法可行。

表5 控制菌檢查方法適用性結(jié)果

表6 控制菌檢查方法適用性結(jié)果

3.討論

微生物是具繁殖力的活細(xì)胞，其在藥品中會(huì)受到種種因素的影響處于不穩(wěn)狀態(tài)，導(dǎo)致檢驗(yàn)結(jié)果的不準(zhǔn)確，如藥品儲(chǔ)存條件、供試品的組合、原料來(lái)源、生產(chǎn)工藝的差別、檢驗(yàn)方法的不同等都可造成結(jié)果的差異，影響因素中供試品的組合尤為重要。有些本身含有抑菌成分，如中藥黃芩、冰片、青黛中都含有較強(qiáng)的殺菌成分，而在一定濃度下，對(duì)微生物僅起到抑菌作用，如抑菌成分消除或濃度降低，仍可生長(zhǎng)、繁殖。采用常規(guī)法檢驗(yàn)往往會(huì)顯示假陰性的結(jié)果，還有些藥品為保證質(zhì)量，需在低溫甚至冷凍環(huán)境中保存，可使細(xì)菌存活狀態(tài)發(fā)生改變，呈休眠狀態(tài)。因此微生物檢驗(yàn)時(shí)應(yīng)根據(jù)以上所述的種種情況采用不同的檢驗(yàn)方法，使微生物處于穩(wěn)定狀態(tài)后，檢驗(yàn)結(jié)果才能反映藥品的真實(shí)污染狀況[15]。

由于藥品的抑菌活性會(huì)影響到微生物限度檢查的準(zhǔn)確性，為了消除其抑菌活性，本試驗(yàn)從常規(guī)法入手[16]。由微生物計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)結(jié)果可知青翹感冒顆粒中的成分對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌有抑菌活性，采用常規(guī)的平皿傾注法不能進(jìn)行需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)。本試驗(yàn)選擇稀釋法，制備1:50、1:80 的供試液對(duì)需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果表明，采用稀釋法不能消除其抑菌活性。進(jìn)一步選擇薄膜過(guò)濾法，結(jié)果提示，各試驗(yàn)菌回收率均在50%～200%范圍內(nèi)，符合《中國(guó)藥典》2020 年版有關(guān)規(guī)定，確定需氧菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用薄膜過(guò)濾法；霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)采用平皿傾注法（1:10）；青翹感冒顆粒對(duì)控制菌無(wú)抑菌活性，可采用常規(guī)法進(jìn)行控制菌檢查。