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        生物硫鐵復(fù)合物的合成及分布特性

        2023-01-06 06:38:24鄭志勤1磊1宋英澤翟帆帆郭芊宏謝李平
        關(guān)鍵詞:硫鐵礦弧菌菌體

        胡 璇 鄭志勤1,,3 周 磊1, 宋英澤 翟帆帆 郭芊宏 謝李平

        (1.西南科技大學(xué)核廢物與環(huán)境安全國(guó)防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室 四川綿陽(yáng) 621010;2.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 四川綿陽(yáng) 621010;3.國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)核技術(shù)醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川綿陽(yáng) 621010;4.西南科技大學(xué)環(huán)境友好能源材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 四川綿陽(yáng) 621010)

        硫酸鹽還原菌(SRB)是一類獨(dú)特的功能多樣化的異養(yǎng)厭氧細(xì)菌,它主要是把周圍環(huán)境中的通過(guò)一系列的反應(yīng)還原為S2-。地球上97%的硫化物由硫酸鹽還原菌通過(guò)代謝活動(dòng)產(chǎn)生[1]。硫鐵復(fù)合物在淡水河海洋沉積物中含量豐富,且其來(lái)源主要是對(duì)硫酸鹽的生物還原[2]。在自然界中,硫鐵化合物常以混合物的形式在沉積物中存在,主要是結(jié)晶性較差的四方硫鐵礦(Fe1+xS)、硫復(fù)鐵礦(Fe3S4)以及黃鐵礦(FeS2)[3-4],其中更為穩(wěn)定且結(jié)晶性良好的四方硫鐵礦在水溶液中需要長(zhǎng)達(dá)兩年的時(shí)間來(lái)形成[5-6]。

        隨著科技的發(fā)展,納米材料的應(yīng)用受到廣泛關(guān)注,其合成方法也逐漸多樣化。生物合成納米材料作為一種清潔、無(wú)毒、環(huán)境友好的方法在納米材料的研究中逐漸脫穎而出[7-9]。生物硫鐵復(fù)合物納米顆粒因其具有較強(qiáng)的還原性可作為除氧劑應(yīng)用于重金屬污染的水體或土壤中[10-12]。硫酸鹽還原菌合成硫鐵復(fù)合物,其良好的吸附性能與硫酸鹽還原菌共同作用可將有重金屬污染的水體中的重金屬含量降至一個(gè)較低的水平[13-14]。為探究其應(yīng)用化,關(guān)于硫酸鹽還原菌對(duì)硫酸鹽代謝的影響已有一定的研究[15-17],但硫化物的合成機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。本研究使用脫硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)合成硫鐵復(fù)合物,對(duì)其形成機(jī)理進(jìn)行了探討,為微生物形成納米材料的機(jī)理研究以及利用脫硫弧菌處理重金屬污染提供參考依據(jù)。

        1 實(shí)驗(yàn)部分

        1.1 材料、試劑與儀器

        1.1.1 菌種

        脫硫弧菌菌種由西南科技大學(xué)固體廢物處理與資源化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

        1.1.2 主要試劑與儀器

        脫硫弧菌液體培養(yǎng)基按照DSMZ的Medium_63要求 配 制[18]:K2HPO40.5 g/L,Na2SO41 g/L,CaCl2·2H2O 2 g/L,MgSO4·7H2O 2 g/L,乳酸鈉2 g/L,酵母膏1 g/L,抗壞血酸0.1 g/L。

        高速冷凍離心機(jī),型號(hào)5805 R,Eppendorf AG;真空冷凍干燥機(jī),美國(guó)LABCONCO公司;超級(jí)凈化手套箱,Universal,上海米開羅那有限公司;X-射線衍射光譜儀(XRD),荷蘭帕科公司;傅里葉紅外光譜儀(ATR-FT-IR),美國(guó)珀金埃爾默有限公司;高分辨冷場(chǎng)發(fā)射掃描顯微鏡(FSEM),UItra55,德國(guó)Carl zeissNTSGmbH公司;透射電子顯微鏡(TEM),JEM-1400PLUS,日本電子(JEOL);徠卡組織處理機(jī),EM TP,徠卡生產(chǎn);玻璃制刀機(jī),EM KMR3,徠卡生產(chǎn);超薄切片機(jī),EM UC7,徠卡生產(chǎn)。

        1.2 方法

        1.2.1 脫硫弧菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

        在超凈工作臺(tái)中,將活化好的菌液接種至3組平行培養(yǎng)基中,接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%,充N220 min,于30℃,120 r/min恒溫?fù)u床中培養(yǎng),每隔1 h取樣,紫外分光光度計(jì)在600 nm波長(zhǎng)下測(cè)定其OD值。

        1.2.2 硫鐵復(fù)合物的制備

        按照基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方溶于990 mL去離子水中,121℃下高壓滅菌30 min。待冷卻后,將2 g/L FeSO4·7H2O和0.1 g抗壞血酸溶于10 mL去離子水中,于超凈工作臺(tái)通過(guò)0.22μm濾膜緩慢加入培養(yǎng)基。接種質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液,培養(yǎng)瓶中通N220 min后密封,35℃,120 r/min搖床培養(yǎng)至溶液變黑。約3 d后,將黑色液體培養(yǎng)基10 000 r/min,5 min離心取沉淀后真空冷凍干燥24 h,保存至手套箱。

        1.2.3 產(chǎn)物表征

        用X-射線衍射光譜儀在N2保護(hù)下分析樣品物相,Cu靶,Kα工作電壓40 kV,管流40 mA,掃描范圍10°~80°;采用高分辨冷場(chǎng)發(fā)射掃描顯微鏡觀察樣品顆粒形態(tài);利用能譜儀測(cè)試產(chǎn)物元素組成;采用傅里葉紅外光譜儀確定樣品的化學(xué)成分,分辨率4 cm-1,光譜范圍400~4 000 cm-1,累計(jì)掃描64次,鏡面速度為0.632 9 cm/s;利用JEM-1400PLUS透射電子顯微鏡分析產(chǎn)物合成位置及其結(jié)構(gòu)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 脫硫弧菌生長(zhǎng)曲線測(cè)定及硫鐵復(fù)合物合成過(guò)程

        脫硫弧菌生長(zhǎng)曲線如圖1所示。由圖1可以看出,脫硫弧菌在0~4 h處于生長(zhǎng)遲緩期,菌體數(shù)量增長(zhǎng)緩慢;4 h后,脫硫弧菌生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,生長(zhǎng)速率明顯加快,代謝旺盛,菌體數(shù)量呈對(duì)數(shù)增加,消耗大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);至36 h后脫硫弧菌的OD600nm值趨于基本穩(wěn)定,進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期,活菌數(shù)保持相對(duì)穩(wěn)定,總菌數(shù)達(dá)到最高水平。圖1內(nèi)嵌圖為硫鐵復(fù)合物合成過(guò)程中培養(yǎng)基顏色變化。向滅菌后的培養(yǎng)基加入2 g/L FeSO4·7H2O,溶液呈黃綠色,1 d后溶液變成黑綠色,可明顯看出有黑色的顆粒懸浮于溶液中;第3天溶液變成黑色,有大量的黑色顆粒懸浮其中。硫鐵復(fù)合物的合成轉(zhuǎn)化率約為40%。

        圖1 脫硫弧菌生長(zhǎng)曲線及硫鐵復(fù)合物合成過(guò)程中培養(yǎng)基顏色變化Fig.1 Growth curve of Desulfovibrio vulgaris and color change of culture medium during the synthesis of sulfur-iron complex

        2.2 硫鐵復(fù)合物特性

        自然界中,由脫硫弧菌通過(guò)生物礦化形成的硫鐵復(fù)合物主要以無(wú)定型及微晶型狀態(tài)存在,且結(jié)晶性較差。圖2(a)和圖2(b)是生物硫鐵復(fù)合物中的菌體部分以及脫硫弧菌細(xì)胞壁附著產(chǎn)物的透射電鏡圖;圖2(c)和圖2(d)為生物硫鐵復(fù)合物的掃描電鏡圖。圖2(e)是生物硫鐵復(fù)合物部分EDS圖。從圖2(a)、圖2(b)和圖2(d)可以看出,生物合成的硫鐵復(fù)合物的粒徑尺寸為納米級(jí)別,形態(tài)不規(guī)則,以鱗片狀疊加形式存在,且因其不規(guī)則疊加的原因會(huì)形成一些孔隙狀的形態(tài),這種形態(tài)大大提高了生物硫鐵復(fù)合物的比表面積以及表面粗糙度,表現(xiàn)更高的活性。這一結(jié)果與文獻(xiàn)[19-20]的研究結(jié)果一致。從圖2(a)可以看出,生物硫鐵復(fù)合物合成會(huì)將脫硫弧菌包裹其中,生物硫鐵復(fù)合物顆粒均勻附著在菌體的表面。由圖2(c)的掃描電鏡圖可以看出,脫硫弧菌的菌體表面包裹的生物硫鐵復(fù)合物是層狀疊加形態(tài),一層層的將脫硫弧菌包裹其中。EDS檢測(cè)表明硫鐵復(fù)合物的主要元素組成有Ca,O,F(xiàn)e和S 4種元素。因?yàn)橹苽浼皟?chǔ)存過(guò)程中Fe2+在空氣中易被氧化,所以材料中含有大量的氧原子,鈣元素為培養(yǎng)基添加。

        圖2 硫鐵復(fù)合物TEM,F(xiàn)SEM,EDS圖Fig.2 TEM,F(xiàn)SEM,EDSdiagrams of sulfur-iron complex

        根據(jù)樣品XRD可知(圖3),生物硫鐵復(fù)合物有8個(gè)明顯的衍射峰,分別位于17.55°,25.94°,28.58°,31.80°,34.45°,35.50°,39.73°,49.51°。其中:17.55°,34.45°,35.50°,49.51°對(duì)應(yīng)四方硫鐵礦(PDF#240073,F(xiàn)eS0.9)標(biāo)準(zhǔn)衍射圖譜;25.94°和28.58°分別對(duì)應(yīng)黃鐵礦(PDF#240074,011295,F(xiàn)eS2)標(biāo)準(zhǔn)衍射圖譜;34.45°對(duì)應(yīng)硫化鐵(PDF#491632,F(xiàn)eS)標(biāo)準(zhǔn)衍射圖譜。因此,推斷脫硫弧菌礦化形成的硫鐵納米顆粒主要是由結(jié)晶度較差的四方硫鐵礦組成,且脫硫弧菌形成的硫鐵復(fù)合物并不是均一的,是一種硫鐵的混合物[21]。周繼梅[22]使用菌JF-5和脫硫弧菌合成的黑色礦物的組成主要是四方硫鐵礦且其結(jié)晶狀態(tài)差。王寧[23]利用希瓦氏菌合成無(wú)定型狀態(tài)且結(jié)晶性差、鐵硫原子比為3.93的FeS礦物,通過(guò)XPS證明其為四方硫鐵礦。Schoonen等[24-25]對(duì)生物合成硫化鐵進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)生物合成的硫鐵復(fù)合物為結(jié)晶性差的四方硫鐵礦(FeS)和灰輝石(Fe3S4),并提出這兩類是形成沉積黃鐵礦中的主要固相。Rickard等[26]表示,在環(huán)境中四方硫鐵礦通常被認(rèn)為是黃鐵礦的前體,并且在25℃下形成結(jié)晶良好的四方硫鐵礦可能需要長(zhǎng)達(dá)2年的時(shí)間,所以推測(cè)脫硫弧菌可以加速礦化形成生物硫鐵復(fù)合物,但在短時(shí)間內(nèi)形成的生物硫鐵復(fù)合物會(huì)以一種非晶形為主存在且無(wú)法快速形成完整的微晶體。

        圖3 硫鐵復(fù)合物粉末XRD圖譜Fig.3 XRD pattern of sulfur-iron complex powder

        對(duì)菌體切片,用TEM對(duì)比觀察正常培養(yǎng)基與含F(xiàn)e2+培養(yǎng)基里的菌體切面。從圖4可以看出,在無(wú)Fe2+培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體內(nèi)有明顯的染色質(zhì)等胞內(nèi)遺傳物質(zhì)(圖4(a)、圖4(b)),EDS測(cè)試表明菌體內(nèi)有O,P等元素分布(圖6),皆為生物體內(nèi)的固有元素。

        圖4 脫硫弧菌超薄切片TEM圖Fig.4 TEM diagram of ultrathin sections of desulfovibrio vulgaris

        從圖4(c)、圖4(d)可以看出,硫鐵復(fù)合物顆粒分布在菌體表面及菌體內(nèi)部。根據(jù)EDS面掃圖可知(圖5(b)、圖5(d)、圖5(e)),菌體內(nèi)的S,F(xiàn)e元素均勻分布,根據(jù)EDS分析顯示(圖6),其中硫元素的原子數(shù)百分比為12.31%,鐵元素原子數(shù)百分比為14.06%,F(xiàn)e與S的原子比約為1∶0.88,結(jié)合XRD結(jié)果,印證了脫硫弧菌生成的硫鐵顆粒并不是均一的,是一種硫鐵的混合物。

        圖5 脫硫弧菌超薄切片EDS圖Fig.5 EDSdiagram of ultrathin sections of desulfovibrio vulgaris

        圖6 脫硫弧菌切面EDS圖Fig.6 EDSdiagram of desulfovibrio vulgaris section

        生物合成硫鐵復(fù)合物的紅外光譜如圖7所示。從圖7可以看出,特征峰425~412cm-1有一段較為微弱的頻帶,是Fe(Ⅱ)-S2伸縮振動(dòng)的結(jié)果[22]。564 cm-1處的特征峰為C-Cl的伸縮振動(dòng)所致。618 cm-1處特征峰的出現(xiàn)可能與Fe-S的振動(dòng)有關(guān)。波數(shù)為1 045 cm-1處的特征峰是S=S伸縮振動(dòng)所致。1 156~1 120 cm-1處微弱的頻帶與Fe=S有關(guān)[27]。1 541 cm-1處的特征峰由自酰胺的N-H彎曲振動(dòng)產(chǎn)生。1 650 cm-1處的特征峰為產(chǎn)物中水分子的羥基(-OH)發(fā)生變形產(chǎn)生。2 359 cm-1處的特征峰由-C=C=C引起。2 880,3 410 cm-1處的特征峰分別來(lái)自化合物中C-H的伸縮振動(dòng)和水分子里-OH的伸縮振動(dòng),-OH的出現(xiàn)說(shuō)明生物基硫鐵納米材料在處理過(guò)程中可以通過(guò)物理吸附作用對(duì)水分子進(jìn)行吸附[19]。

        圖7 硫鐵復(fù)合物的FT-IR譜圖Fig.7 FT-IR spectrum of sulfur-iron complex

        2.3 脫硫弧菌礦化形成硫鐵復(fù)合物機(jī)理

        圖8 合成硫鐵復(fù)合物機(jī)理圖Fig.8 Diagram of the mechanism of sulfur-iron complex synthesis

        3 結(jié)論

        本文探究了脫硫弧菌(Desulfovibrio vulgaris)生物礦化形成的生物硫鐵復(fù)合物的微觀形貌、組成和形成位置,得到以下結(jié)論:(1)脫硫弧菌通過(guò)生物礦化作用形成生物硫鐵復(fù)合物,其最佳合成時(shí)間為3 d,復(fù)合物是一種以四方硫鐵礦為主、與黃鐵礦和硫化鐵組成的混合物。(2)生物硫鐵復(fù)合物的形貌主要是微晶型與非晶型的納米級(jí)結(jié)構(gòu),以無(wú)定型狀態(tài)、鱗片層狀疊加形式存在。Fe,S原子比約為1∶0.88。(3)脫硫弧菌在其胞內(nèi)、胞外均可合成硫鐵復(fù)合物,且部分合成的硫鐵復(fù)合物包裹在菌體外部。

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