楊雪蓮 劉 帥 楊 麗 唐文鑫 代天志 龍曉燕 孫德群

（1.西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院 四川綿陽(yáng) 621010；2.山東大學(xué)海洋學(xué)院 山東威海 264200）

白血?。↙eukemia），亦稱作血癌，是一種造血系統(tǒng)的惡性腫瘤。病原是克隆性白血病細(xì)胞出現(xiàn)增殖失控、分化障礙、凋亡受阻等情況并在骨髓中出現(xiàn)大量增殖，浸潤(rùn)其他非造血性組織和器官，同時(shí)抑制正常造血功能。臨床上將白血病分為急性白血病和慢性白血病，具體分為急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）、急性髓系白血?。ˋML）、慢性髓系白血?。–ML）、慢性淋巴細(xì)胞白血?。–LL），白血病在各年齡段均有發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)［1］。目前，白血病是兒童癌癥死亡的主要原因，約占所有兒童癌癥的30%［2］，在發(fā)展中國(guó)家中，兒童白血病治愈率甚至低于35%［3］。臨床上成人白血病治愈率也不樂(lè)觀。這是由于常規(guī)藥物特異性和選擇性較差，沒(méi)有明確的白血病預(yù)防和治療效果［4］。因此，迫切需要開(kāi)發(fā)效果更佳、選擇性更好的新藥。

氮芥屬于一種DNA烷化劑，是細(xì)胞毒性類藥物，起源于二戰(zhàn)時(shí)期的芥子氣，它可對(duì)接觸者造成骨髓和淋巴系統(tǒng)增生低下，有較強(qiáng)的毒副作用。為了將芥子氣運(yùn)用于臨床，對(duì)其進(jìn)行了不同的結(jié)構(gòu)修飾，產(chǎn)生了各種類型的氮芥類衍生物［5］。由于氮芥衍生物是基于雙（2-氯乙基）硫化物對(duì)白細(xì)胞的殺傷作用開(kāi)發(fā)，因此其最開(kāi)始主要用于治療白血?。?］。由于氮芥衍生物具有較強(qiáng)的抗增殖活性，臨床上將其廣泛應(yīng)用于各類腫瘤的化療。比如：最早應(yīng)用于臨床的鹽酸氮芥，主要用于治療惡性淋巴瘤以及慢性白血?。?］；臨床常用的氮芥類藥物環(huán)磷酰胺，具有廣泛抗瘤譜，對(duì)惡性淋巴瘤有顯著治療效果，對(duì)急性或慢性淋巴細(xì)胞白血病以及乳腺癌等也有不錯(cuò)療效［7］。對(duì)氮芥的抗腫瘤機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)，氮芥可通過(guò)與DNA結(jié)合，交聯(lián)兩條鏈，防止DNA復(fù)制并導(dǎo)致細(xì)胞最終死亡而發(fā)揮其生物活性。在分子水平上，氮芥類衍生物主要是與DNA雙螺旋中的腺嘌呤或者鳥(niǎo)嘌呤的N7位或腺嘌呤的N3位結(jié)合，使DNA發(fā)生鏈內(nèi)或雙鏈間交聯(lián)［8］，由此刺激了相對(duì)的遺傳毒性應(yīng)激反應(yīng)，影響細(xì)胞中DNA損傷調(diào)節(jié)反應(yīng)、能量代謝、細(xì)胞周期或者細(xì)胞凋亡（線粒體凋亡通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)凋亡通路）等多個(gè)信號(hào)通路［9］。

由于氮芥類化合物屬于非特異性DNA烷基化，因此對(duì)正常細(xì)胞毒性極大，給患者帶來(lái)許多副作用［10］，這些副作用和耐藥性［11］已成為臨床治療的主要限制因素。為了解決這些問(wèn)題，藥物化學(xué)家在過(guò)去做了很多努力。Hu等［12-14］設(shè)計(jì)并合成了各種氮芥與吳茱萸堿雜合體，此類生物堿具有多種抗腫瘤活性，所合成的化合物對(duì)HL-60細(xì)胞具有優(yōu)良的細(xì)胞活性，IC50值為0.5μmol／L。Xiang等［15］合成并評(píng)估了一系列與氮芥偶聯(lián)的enmein型二萜類化合物，這一系列化合物表現(xiàn)出一定細(xì)胞毒性和選擇性。Wen等［16］描述了具有各種芳香取代基和硼酸酯的新型芳香族氮芥類化合物，這類化合物可有效交聯(lián)DNA。綜上可知，對(duì)氮芥進(jìn)行有效結(jié)構(gòu)修飾，可降低其毒副作用，有利于氮芥類化合物的臨床應(yīng)用。

本文以氮芥為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)并合成了氮芥新衍生物，并通過(guò)白血病細(xì)胞抗增殖活性實(shí)驗(yàn)及一系列熒光染色實(shí)驗(yàn)證明了化合物Y-65體外抗白血病細(xì)胞增殖活性。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 主要儀器和試劑

儀器：ICX41系列倒置生物顯微鏡（寧波舜宇儀器有限公司）；5404低速冷凍離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；SW-CJ-1D型超凈工作臺(tái)（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；ReadMax1900型光吸收全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）；KG-SX-700型高溫蒸汽滅菌鍋（KAGOSHIMA SEISAKUSYO INC）；培養(yǎng)箱（SANYO）。

試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、IMDM培養(yǎng)基（Biological Industeries）；胎牛血清（Gibco）；青鏈霉素（中國(guó)Beyotime研究所）；四甲基噻唑藍(lán)（MTT）（中國(guó)Beyotime研究所）；胰蛋白酶消化液（中國(guó)Beyotime研究所）；PBS（中國(guó)Beyotime研究所）；二甲基亞砜（DMSO）（成都市科隆化學(xué)品有限公司）；超純水（實(shí)驗(yàn)室配制）；線粒體膜電位試劑盒（JC-1）（中國(guó)Beyotime研究所）；Annexin VFITC細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（中國(guó)Beyotime研究所）；Hoechst33258檢測(cè)試劑盒（中國(guó)Beyotime研究所）；苯丁酸氮芥（安耐吉化學(xué)）；濃鹽酸、十二烷基硫酸鈉（SDS）、異丁醇（成都市科隆化學(xué)品有限公司）。

細(xì)胞株來(lái)源：人慢性髓原白血病細(xì)胞系K562、人急性淋巴細(xì)胞白血病T淋巴細(xì)胞系CCRFCEM、人早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞HL-60和人正常肝細(xì)胞L02，上海攬寶生物技術(shù)有限公司。

1.2 試劑配制

DMEM高糖完全培養(yǎng)基配制：在DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%FBS（胎牛血清）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%PS（青霉素鏈霉素），配制好的完全培養(yǎng)基放置在4℃冰箱中保存。

DMEM高糖維持培養(yǎng)基配制：在DMED高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%的FBS（胎牛血清）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的PS（青霉素鏈霉素），配制好的維持培養(yǎng)基放置在4℃冰箱中保存。

IMDM完全培養(yǎng)基配制：在IMDM（含谷氨酸）基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%的FBS（胎牛血清）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的PS（青霉素鏈霉素），配制好的完全培養(yǎng)基放置在4℃冰箱中保存。

IMDM維持培養(yǎng)基配制：在IMDM（含谷氨酸）基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的FBS（胎牛血清）和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的PS（青霉素鏈霉素），配制好的維持培養(yǎng)基放置在4℃冰箱中保存。

RPMI-1640完全培養(yǎng)基和維持培養(yǎng)基的配制方法與DMEM配制方法相同。

MTT溶液配制：稱取500 mg四甲基噻唑藍(lán)（MTT）倒入滅菌后的玻璃瓶中，加入100 mL PBS（磷酸緩沖液）溶解，再用0.22μm無(wú)菌濾膜過(guò)濾，得到的MTT溶液用2 mL EP管分裝置于-20℃冰箱中避光保存。

三聯(lián)裂解液配制：稱取10 g SDS（十二烷基硫酸鈉），量取10 mol／L HCl 0.1 mL、異丁醇5 mL，用雙蒸水溶解并定容至100 mL，再用0.22μm濾膜過(guò)濾，最后進(jìn)行高壓蒸汽滅菌，常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 氮芥新衍生物結(jié)構(gòu)式

氮芥新衍生物為西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院合成實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)合成［17］，并經(jīng)氫譜、碳譜、高分辨質(zhì)譜確定結(jié)構(gòu)式。

化合物Y-65

1H NMR（500 MHz，DMSO-d6）δ8.94（s，1H），8.49（s，1H），7.40～7.06（m，4H），6.81～6.61（m，3H），3.85～3.58（m，8H）。13C NMR（126 MHz，DMSO-d6）164.11，163.98，162.19，162.06，152.90，143.29，142.70，129.66，121.55，112.94，101.26，101.20，101.08，101.02，97.00，96.79，96.58，52.87，41.70。HRMS（ESI）m／z：［C17H17Cl2F2N3OH＋］388.0790（計(jì)算值），388.0793（實(shí)驗(yàn)值）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

HL-60細(xì)胞系、CCRF-CEM和K562細(xì)胞系、L02細(xì)胞系分別使用IMDM完全培養(yǎng)基、RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)、DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。上述細(xì)胞系均在37℃恒溫，體積分?jǐn)?shù)5%CO2的飽和濕度的無(wú)菌細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，1～2 d更換一次細(xì)胞液，培養(yǎng)4 d進(jìn)行細(xì)胞傳代。

2.2 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞抑制率

貼壁細(xì)胞［17］：將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞接種到96孔板，每孔100μL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，分別加入各濃度化合物Y-65，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，對(duì)照組為不加藥維持培養(yǎng)基，陽(yáng)性對(duì)照藥為苯丁酸氮芥（CLB）。將96孔板在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，然后每孔加入100μL MTT工作液（0.5 mg／mL）。培養(yǎng)箱中孵育4 h，吸棄工作液，再向每孔加入100μL DMSO溶解10 min后，檢測(cè)490 nm吸光度，計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）＝（1-OD實(shí)驗(yàn)組／OD對(duì)照組）×100%。IC50值利用GraphPad Prism 8分析得出。

懸浮細(xì)胞：采用三聯(lián)法［17］檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的吸光度，抑制率計(jì)算和IC50值分析同貼壁細(xì)胞的計(jì)算分析方法。

2.3 白血病細(xì)胞在化合物的不同濃度和不同處理時(shí)間下的抑制活性

（1）鋪板。同2.2，濃度為0，0.05，0.10，0.50，2.5，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0μmol／L。

（2）檢測(cè)。將96孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24，48，72 h后，然后用三聯(lián)法在570 nm處檢測(cè)其吸光度，根據(jù)公式計(jì)算其抑制率，用軟件GraphPad Prism 8繪制CCRF-CEM細(xì)胞經(jīng)化合物Y-65不同濃度和不同處理時(shí)間下的抑制活性曲線圖。

2.4 化合物對(duì)白血病細(xì)胞形態(tài)的影響

（1）接種細(xì)胞。用RPMI-1640維持細(xì)胞液將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期CCRF-CEM細(xì)胞制成適當(dāng)細(xì)胞數(shù)量的細(xì)胞懸液，然后用此細(xì)胞懸液，稀釋藥物為0，3.0，6.0，10.0，20.0，30.0μmol／L，然后將各濃度細(xì)胞懸液接種到24孔板中，每孔1 mL，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

（2）觀察。約24 h后，在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并用ImageView軟件進(jìn)行拍照。

2.5 Hoechst33258染色下細(xì)胞核形態(tài)變化

接種細(xì)胞同2.4節(jié)，24 h后，4 min，1 000 g離心收集細(xì)胞，加入試劑盒中固定液，孵育30 min；離心，每個(gè)濃度組細(xì)胞沉淀用PBS洗滌兩遍；離心，留50μL PBS，將細(xì)胞混懸，然后滴在載玻片上，待細(xì)胞貼在載玻片上后，滴加0.2 mL Hoechst33258染液，避光染色2 min；從邊緣吸掉染色液，用PBS洗滌兩遍，在熒光顯微鏡下進(jìn)行核形態(tài)觀察，并拍照記錄。

2.6 Annexin V-FITC和PI染色下不同階段的細(xì)胞凋亡

接種細(xì)胞同2.4節(jié)，離心，收集細(xì)胞，用PBS洗滌；離心，將細(xì)胞在195μL結(jié)合液中重懸，再依次加入5μL Annexin V-FITC和10μL PI染色工作液，混勻，25℃避光孵育20 min后在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，此過(guò)程盡量避光進(jìn)行。

2.7 JC-1染色下細(xì)胞線粒體膜電位的變化

接種細(xì)胞同2.4節(jié)，離心，將細(xì)胞重懸于0.5 mL細(xì)胞液中，加入0.5 mL JC-1染色工作液混勻后，在培養(yǎng)箱中孵育20 min，孵育結(jié)束后，稱量600 g，4℃離心，再用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌兩遍；離心，用適量JC-1染色緩沖液（1×）重懸細(xì)胞，在熒光顯微鏡下觀察并拍照記錄，使用熒光光度計(jì)對(duì)熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量，此過(guò)程盡量避光進(jìn)行。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果討論

3.1 化合物Y-65對(duì)3種白血病細(xì)胞系的抗腫瘤活性

據(jù)表1可知，化合物Y-65對(duì)3株白血病細(xì)胞均有較好抗增殖活性，特別是對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞株增殖抑制作用顯著，其IC50值為4.3±0.3μmol／L。同時(shí)發(fā)現(xiàn)化合物Y-65對(duì)HL-60白血病細(xì)胞活性（IC50值12.4±6.2μmol／L）高于CLB（IC50值34.4±2.7μmol／L［17］）；除此之外更值得注意的是，化合物Y-65對(duì)K562細(xì)胞系抗增殖活性（IC50值25.9±1.7μmol／L）明顯優(yōu)于CLB（IC50值＞100μmol／L），顯著提高了氮芥對(duì)人慢性髓原白血病細(xì)胞系抗增殖活性?？梢?jiàn)，氮芥新衍生物（化合物Y-65）對(duì)3株白血病細(xì)胞均有較好抗增殖作用，且研究發(fā)現(xiàn)其對(duì)急性白血病細(xì)胞（CCRF-CEM，HL-60）的抗增殖作用（IC50值4.3±0.3，12.4±6.2μmol／L）明顯優(yōu)于對(duì)慢性白血病細(xì)胞（K562）的抗增殖作用（IC50值25.9±1.7μmol／L）。由于化合物Y-65對(duì)3株白血病細(xì)胞均有較好抗增殖活性，可進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

通過(guò)選擇性指數(shù)分析可確定化合物Y-65作用于哪一株白血病細(xì)胞更值得進(jìn)行機(jī)制研究。根據(jù)表1數(shù)據(jù)，化合物Y-65對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞的最大選擇性指數(shù)為1.3，高于化合物Y-65對(duì)HL-60細(xì)胞的最大選擇性指數(shù)0.5，因此，選擇化合物Y-65作用于CCRF-CEM抗白血病細(xì)胞活性機(jī)制研究。

表1 氮芥新衍生物對(duì)3種白血病的抑制活性以及選擇性指數(shù)（x±SD，n＝3）Table 1 Inhibitory activity and selectivity index of new nitrogen mustard derivatives on three kinds of leukemia

3.2 化合物濃度、作用時(shí)間與化合物抗細(xì)胞增殖活性的關(guān)系

圖1表明，化合物Y-65濃度越高，作用時(shí)間越久，對(duì)白血病細(xì)胞抗增殖活性越好。通過(guò)比較24，48 h時(shí)間濃度抑制曲線，我們發(fā)現(xiàn)只有24 h和48 h抗白血病活性表現(xiàn)出時(shí)間依賴，而48 h抑制曲線很接近72 h，推測(cè)可能是由于化合物Y-65處理細(xì)胞48 h后，CCRF-CEM細(xì)胞對(duì)化合物Y-65敏感性下降所致。

圖1 化合物Y-65在不同濃度和不同時(shí)間對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞的增值抑制活性Fig.1 Inhibitory activity of compound Y-65 on proliferation of CCRF-CEM cells at different concentrations and different time

3.3 化合物Y-65對(duì)白血病細(xì)胞形態(tài)的影響

細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)出的形態(tài)學(xué)變化主要包括細(xì)胞皺縮、染色質(zhì)凝集、形成凋亡小體、細(xì)胞骨架解散等，可以通過(guò)觀察白血病細(xì)胞外觀變化來(lái)初步判斷化合物Y-65對(duì)細(xì)胞的作用情況。圖2顯示，CCRF-CEM細(xì)胞經(jīng)化合物Y-65作用后發(fā)生了明顯的形態(tài)學(xué)變化。從第一張圖（0μmol／L）可知，未進(jìn)行化合物處理CCRF-CEM細(xì)胞飽滿、圓潤(rùn)，并且大小較為均勻；從后6張圖（3～40μmol／L）可知，隨著化合物濃度增加，細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生了變化，細(xì)胞開(kāi)始皺縮，細(xì)胞膜出現(xiàn)破損，這種變化表明細(xì)胞骨架崩解，細(xì)胞逐漸凋亡；且隨著化合物Y-65濃度增加，細(xì)胞凋亡增多，且細(xì)胞大小無(wú)法保持均勻。據(jù)此可知，氮芥新衍生物（化合物Y-65）對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞毒性作用顯著，且隨著濃度遞增，毒性作用隨之遞增。

圖2 化合物Y-65作用后CCRF-CEM細(xì)胞形態(tài)圖Fig.2 Morphology of CCRF-CEM cells treated with compound Y-65

3.4 Hoechst33258染色下的白血病細(xì)胞核形態(tài)變化

為確定化合物Y-65對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞抗增殖活性是否與其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，進(jìn)行了Hoechst33258實(shí)驗(yàn)。經(jīng)Hoechst33258染色后，正常未凋亡細(xì)胞呈現(xiàn)淺藍(lán)色熒光；凋亡細(xì)胞由于染色質(zhì)凝集，細(xì)胞核會(huì)呈現(xiàn)致密濃染，出現(xiàn)深藍(lán)色熒光。圖3顯示，未經(jīng)化合物Y-65作用的CCRF-CEM細(xì)胞染色后呈現(xiàn)淺藍(lán)色，未出現(xiàn)由于染色質(zhì)凝集產(chǎn)生的深藍(lán)色熒光（0μmol／L）。圖3中后5張圖（3～30 μmol／L）顯示，經(jīng)過(guò)化合物Y-65作用的CCRFCEM細(xì)胞，由于化合物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞核中染色質(zhì)凝集，經(jīng)染色后細(xì)胞核出現(xiàn)致密濃染，產(chǎn)生深藍(lán)色熒光，且隨著化合物濃度加大，細(xì)胞凋亡數(shù)量增加，導(dǎo)致深藍(lán)色熒光量增加。當(dāng)化合物濃度增加到30μmol／L時(shí)，細(xì)胞幾乎全部凋亡。由此可知氮芥新衍生物（化合物Y-65）是以濃度依賴方式誘導(dǎo)白血病細(xì)胞（CCRF-CEM）凋亡。

圖3 Hoechst33258染色CCRF-CEM細(xì)胞的顯微圖像Fig.3 Microscopic image of CCRF-CEM cells after Hoechst33258 staining

3.5 Annexin V-FITC和PI兩種染色下不同階段的細(xì)胞凋亡

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)化合物Y-65抗白血病活性是否與細(xì)胞凋亡有關(guān)，采用Annexin V-FITC和PI染色實(shí)驗(yàn)來(lái)確定化合物Y-65能否誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Annexin V-FITC用綠色熒光探針FITC標(biāo)記Annexin V，根據(jù)Annexin V-FITC與細(xì)胞中的磷脂酸酰絲氨酸結(jié)合情況，可以直接檢測(cè)到磷脂酰絲氨酸外翻情況，從而測(cè)定出細(xì)胞凋亡狀態(tài)。碘化丙啶可以對(duì)壞死的細(xì)胞或凋亡晚期喪失細(xì)胞膜完整性的細(xì)胞進(jìn)行染色，呈現(xiàn)紅色熒光。圖4顯示，當(dāng)化合物濃度為0μmol／L時(shí)，有極少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或者壞死；當(dāng)化合物濃度增加時(shí)（從3～30μmol／L），凋亡早期細(xì)胞數(shù)量增加同時(shí)，凋亡晚期或者壞死細(xì)胞數(shù)量也隨之增加。同時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著化合物濃度增加，凋亡晚期或者壞死細(xì)胞數(shù)量增加比凋亡早期細(xì)胞數(shù)量增加更多。由此可知，隨著化合物Y-65濃度增加凋亡細(xì)胞總數(shù)增加，且化合物濃度增加可能更易誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡，具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。此實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，化合物Y-65可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或者壞死，產(chǎn)生對(duì)白血病細(xì)胞的抗增殖活性。

圖4 Annexin V-FITC和PI染色CCR-CEM細(xì)胞的顯微圖像Fig.4 Microscopic images of CCRE-CEM cells after annexin V-FITCand PI staining

3.6 JC-1染色下細(xì)胞線粒體膜電位的變化

線粒體是細(xì)胞內(nèi)參與多種信號(hào)通路和功能的細(xì)胞器，在確定細(xì)胞存活與死亡中起著關(guān)鍵作用［20］。線粒體膜電位下降是細(xì)胞凋亡早期一個(gè)標(biāo)志性事件。為了驗(yàn)證化合物Y-65是否通過(guò)線粒體通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，進(jìn)行了線粒體膜電位（JC-1）染色實(shí)驗(yàn)。在正常細(xì)胞中，線粒體膜電位較高，此時(shí)JC-1染料是聚合體可以產(chǎn)生紅色熒光；在早期凋亡細(xì)胞中，線粒體膜電位較低，此時(shí)JC-1染料是單體可以產(chǎn)生綠色熒光。圖5顯示，當(dāng)未用化合物作用時(shí)，只有極少數(shù)細(xì)胞凋亡，此時(shí)大多數(shù)細(xì)胞線粒體膜電位較高，染色后呈現(xiàn)紅色熒光。當(dāng)化合物濃度為3μmol／L時(shí)，部分細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，凋亡細(xì)胞線粒體膜電位下降，染色后呈現(xiàn)綠色熒光，但還是有不少細(xì)胞未凋亡，當(dāng)加大化合物濃度后，凋亡細(xì)胞數(shù)量隨之增加，當(dāng)化合物濃度達(dá)到30μmol／L時(shí)，絕大多數(shù)細(xì)胞已經(jīng)凋亡，綠色熒光量達(dá)到最大。由圖6（a）、圖6（b）可知，由于化合物濃度增加，細(xì)胞凋亡增加，染色后綠色單體熒光強(qiáng)度增加，紅色聚合物熒光強(qiáng)度降低。從圖6（c）可知，綠色單體熒光強(qiáng)度／紅色聚合物熒光強(qiáng)度的去極化隨著濃度增加而遞增，說(shuō)明化合物Y-65對(duì)細(xì)胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生顯著影響，并呈現(xiàn)濃度依賴性效應(yīng)。通過(guò)線粒體膜電位（JC-1）染色實(shí)驗(yàn)證明化合物Y-65對(duì)CCRF-CEM細(xì)胞抗增殖活性可能是通過(guò)線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑。

圖5 線粒體膜電位（JC-1）染色CCRE-CEM細(xì)胞的顯微圖像Fig.5 Microscopic image of CCRE-CEM cells after mitochondrial membrane potential（JC-1）staining

圖6 線粒體膜電位熒光光譜及去極化統(tǒng)計(jì)圖Fig.6 Statistical diagrams of fluorescence spectrum of mitochondrial membrane potential and depolarization

4 結(jié)論

設(shè)計(jì)合成的氮芥新衍生物Y-65對(duì)CCRFCEM，K562細(xì)胞的IC50值分別為4.3±0.3，25.9±1.7 μmol／L，明顯優(yōu)于苯丁酸氮芥對(duì)CCRF-CEM，K562的抗增殖活性（IC50值分別為17.7±0.1，＞100μmol／L）。對(duì)化合物Y-65抗腫瘤機(jī)制初步研究表明，其可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞CCRF-CEM發(fā)生細(xì)胞凋亡，呈現(xiàn)濃度和時(shí)間依賴性，且通過(guò)降低線粒體膜電位來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由于缺少對(duì)不同階段細(xì)胞凋亡的定量研究，本課題無(wú)法準(zhǔn)確判斷化合物Y-65能否誘導(dǎo)白血病細(xì)胞發(fā)生晚期凋亡，其作用機(jī)制也有待進(jìn)一步研究。