王準，尹毅青

天津醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院麻醉科 國家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心 天津市“腫瘤防治”重點實驗室 天津市惡性腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心，天津300060

術(shù)后認知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是指手術(shù)后新出現(xiàn)的學(xué)習(xí)和記憶等能力下降的神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥，發(fā)病率可因手術(shù)類型以及患者的情況而有所差異，老年人的發(fā)病率要明顯高于青年人［1］。盡管已經(jīng)受到越來越多人的關(guān)注，但是由于大腦的學(xué)習(xí)和記憶過程的復(fù)雜性以及影響因素的混雜性，POCD 的發(fā)病機制仍不明確。在學(xué)習(xí)和記憶的形成過程中，突觸可塑性一直被認為起到關(guān)鍵性作用［2］，在抑制性突觸的作用下，興奮性突觸的可塑性可以發(fā)生改變，而影響大腦的學(xué)習(xí)和記憶能力。γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，通過與GABA 受體結(jié)合而起到調(diào)節(jié)神經(jīng)信號傳遞的作用。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的GABA 受體主要分為GABAA受體、GABAB受體和GABAC受體三類。含有α5 亞單位的GABAA受體被稱為α5-GABAA受體，它不僅可以為多種麻醉藥物提供作用位點從而產(chǎn)生麻醉效應(yīng)，而且還在突觸內(nèi)外的錨靠蛋白作用下參與突觸可塑性的調(diào)節(jié)，因此該受體類型有可能是POCD 發(fā)生過程中的關(guān)鍵位點，而且隨著研究的深入，其在學(xué)習(xí)和記憶過程中的重要作用也逐漸被發(fā)掘［3-6］。現(xiàn)將α5-GABAA受體對認知功能的調(diào)節(jié)作用及其在突觸內(nèi)外分布的雙錨靠機制研究進展綜述如下，為臨床探究預(yù)防和治療POCD 提供新的思路。

1 α5-GABAA受體的結(jié)構(gòu)及其在突觸內(nèi)外的分布

1.1 α5-GABAA受體的結(jié)構(gòu) 在GABA 的三種類型受體中，GABAA受體是由同源亞單位構(gòu)成的異五聚體，從而形成配體門控的氯離子通道受體，通過與配體結(jié)合，該類受體可以發(fā)揮離子通道的作用允許氯離子通過，從而產(chǎn)生快速的抑制性應(yīng)答。GABAA受體的每種亞單位均具備相同的結(jié)構(gòu)，包括一個較大的N 末端結(jié)構(gòu)域、一個較小的C 末端結(jié)構(gòu)域和四個跨膜區(qū)域（transmembrane，TM）1～4。在TM3與TM4之間形成的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（intracellular domain，ICD）是多種形式的翻譯后修飾（post-translation modification，PTM）的重要位點，同時也是細胞內(nèi)蛋白與受體結(jié)合的作用位點，在調(diào)節(jié)受體的定位中起到非常重要的作用。迄今為止，人們在GABAA受體中一共發(fā)現(xiàn)了八大類共計19種亞單位，分別為：α1～6、β1～3、γ1～3、θ、δ、ε、π、ρ1～3［6］。而α5-GABAA受體則是指包含有α5 亞單位的GABAA受體類型。不同亞單位裝配成的受體可以發(fā)揮不同的功能，比如α5/γ2結(jié)合后可以為苯二氮卓類藥物提供作用位點。隨著電子顯微鏡等新技術(shù)的應(yīng)用［7-8］，對于受體的構(gòu)成及相關(guān)藥物作用位點等問題可以更好地被進一步研究和解決。

1.2 α5-GABAA受體在突觸內(nèi)外的分布 α5-GABAA受體在大腦中表達量不多，僅占腦內(nèi)全部受體的5%，但是在海馬區(qū)，這一比例可上升至25%，并且較多分布在海馬區(qū)的CA1和CA3區(qū)域［9］。在大腦的其他區(qū)域雖然也有α5-GABAA受體的分布，如大腦皮質(zhì)、杏仁核、下丘腦等，但是這些區(qū)域受體的表達水平都較低［10］。隨著進一步的研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)成GABAA受體的亞單位不同，不僅影響著受體在組織上的空間定位，而且還影響受體在更細微的亞細胞水平的分布。GABAA受體在細胞膜上的分布可以分為突觸內(nèi)分布和突觸外分布，其中含有α1、α2和α3亞單位的GABAA受體主要分布在突觸內(nèi)，由于對GABA的親和力低，因此介導(dǎo)快速而短暫的phasic 抑制。而突觸外含有α4 和/或α6 亞單位的GABAA受體對GABA 具有更強的親和力，可以介導(dǎo)緩慢但持久的tonic 抑制［10-11］。初始人們認為α5-GABAA受體主要定位在突觸外，并在海馬中產(chǎn)生tonic 抑制而發(fā)揮作用。但近些年的研究則發(fā)現(xiàn)，α5-GABAA受體在突觸內(nèi)也有一定分布。通過分布位點不同，α5-GABAA受體可同時發(fā)揮phasic 抑制和tonic 抑制兩種作用［9］。對于受體來說，其位置的分布并非一成不變，而是一個動態(tài)調(diào)節(jié)的過程。受體可在細胞內(nèi)合成并被分泌至細胞膜，并在受體的合成分泌過程中受到多種受體相關(guān)蛋白的調(diào)節(jié)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，不同類型的亞單位被裝配組合成GABA 受體，成功合成的GABAA受體則被運輸?shù)礁郀柣w。通過與Plic-1 的結(jié)合，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的受體亞基會停留一定時間，從而使得未組裝的受體亞單位有足夠的時間發(fā)生多泛素化而被降解。當受體被轉(zhuǎn)運至高爾基體內(nèi)后，受體會與GABARAP/NSF 復(fù)合物結(jié)合，進一步促進其向質(zhì)膜轉(zhuǎn)運［12］。但是有研究發(fā)現(xiàn)，α5-GABAA受體在突觸內(nèi)外的分布并不固定，通過受體在質(zhì)膜上的移動，即橫向擴散作用，可以實現(xiàn)受體在突觸內(nèi)外表達的再分布［13-14］。

2 α5-GABAA受體對認知功能的調(diào)節(jié)作用

大腦的海馬區(qū)一直被認為是與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)的腦區(qū)，而α5-GABAA受體在海馬區(qū)大量分布的特點，使得人們將該受體與學(xué)習(xí)記憶聯(lián)系在一起［14］。隨著研究的深入，的確發(fā)現(xiàn)α5-GABAA受體的改變可以影響實驗動物的學(xué)習(xí)記憶能力。在部分敲低海馬區(qū)α5-GABAA受體的小鼠中可以發(fā)現(xiàn)，小鼠在一些海馬依賴的行為如在痕跡條件恐懼試驗、新事物識別試驗中會發(fā)生改變，通過影響SST +/α 5-GABAA受體這一通路來改變受體的表達后，老年動物模型的認知功能發(fā)生了明顯的改善［15-16］。這些研究都表明，α5-GABAA受體在學(xué)習(xí)和記憶的過程中確實發(fā)揮著關(guān)鍵性作用。但是α5-GABAA受體功能的調(diào)節(jié)具有雙向性。作為α5-GABAA受體的競爭性拮抗劑，S44819 可以使小鼠的空間學(xué)習(xí)能力和記憶能力可以得到明顯的改善［17］。而在前期實驗中我們發(fā)現(xiàn)，L-655，708 雖然是α5-GABAA受體的反向激動劑，但是卻并不總能夠改善實驗小鼠的認知能力，而是表現(xiàn)出一種年齡相關(guān)性：在青年小鼠異氟醚麻醉前和麻醉后應(yīng)用L-655，708 均可改善小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力，但是對于老年小鼠來說，僅在麻醉前給予L-655，708 有改善認知的作用，麻醉后再給予L-655，708 則對于小鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力不會產(chǎn)生明顯的影響［18］。近些年來，在老年動物如阿爾茲海默癥小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，通過正向激動α5-GABAA受體，實驗動物的認知能力也可得以提高［19］。激動或者拮抗α5-GABAA受體的功能均可能改善實驗動物的認知功能。

3 調(diào)節(jié)α5-GABAA受體在突觸內(nèi)外分布的雙錨靠機制

興奮性突觸的可塑性如長時程增強（long-term potential，LTP）一直被認為是在哺乳動物大腦中進行學(xué)習(xí)和形成記憶的機制，通過調(diào)整突觸可塑性可以改變動物的學(xué)習(xí)記憶能力［20］。但是LTP是一個正反饋過程，興奮性信號傳遞至突觸后部位發(fā)生去極化后刺激機體產(chǎn)生興奮活動，從而再次出現(xiàn)興奮性信號，進一步誘導(dǎo)下一次LTP 的產(chǎn)生。因此在此過程中，抑制性突觸可以通過其抑制作用避免LTP 的累積，在改變抑制性突觸的強度后，LTP 的發(fā)生可以被影響和改變［21］。由于突觸內(nèi)外受體產(chǎn)生抑制的性質(zhì)上的差異，tonic 抑制和phasic 抑制對興奮性突觸后電位（excitatory postsynaptic potential，EPSP）改變的程度也有所差異［22］，因此對LTP 的抑制程度也有不同。最新研究發(fā)現(xiàn)，在刺激誘發(fā)LTP 產(chǎn)生的過程中，突觸外的α5-GABAA受體可以進入抑制性突觸，并對興奮性突觸反應(yīng)進行抑制，進而影響動物的反向?qū)W習(xí)能力［14］。先前也有研究［23］報道，通過橫向擴散作用，突觸外α5-GABAA受體進入突觸后可以使動物的學(xué)習(xí)記憶能力發(fā)生改變。因此，在學(xué)習(xí)和記憶產(chǎn)生的過程中，除α5-GABAA受體的表達量及總體功能之外，其在突觸內(nèi)外分布的調(diào)節(jié)可能是發(fā)揮其影響認知功能的更為關(guān)鍵的機制。α5-GABAA受體在質(zhì)膜表達時存在不定向的流動性，使得受體在突觸內(nèi)外均有分布具備了條件基礎(chǔ)，不同分布的GABAA受體可以分別產(chǎn)生不同的抑制電流來干擾突觸可塑性，進而可以影響學(xué)習(xí)和記憶的形成。目前認為，在突觸外主要依靠radixin蛋白將α5-GABAA受體錨靠在質(zhì)膜上，從而降低受體的流動性［23-24］，而在突觸內(nèi)，α5-GABAA受體聚集則主要歸功于gephyrin 蛋白［14］。這種在突觸內(nèi)外分別由不同的錨靠蛋白對α5-GABAA受體的分布進行調(diào)節(jié)的機制，我們稱之為雙錨靠機制。

3.1 錨靠蛋白radixin 在突觸外對α5-GABAA受體的錨靠作用及其調(diào)控機制 Radixin 是ERM（ezrin，radixin，meosin）蛋白家族中的一員，最初在大鼠的肝臟組織中被發(fā)現(xiàn)。Radixin 蛋白主要由三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成：FERM 結(jié)構(gòu)域、C 末端結(jié)構(gòu)域（C-terminal domain，CTD）以及連接以上兩個結(jié)構(gòu)域的中間α結(jié)構(gòu)域。FERM 結(jié)構(gòu)域和CTD 可以分別與膜蛋白和肌動蛋白作用，從而將蛋白固定在肌動蛋白細胞骨架上發(fā)揮錨靠作用［25］。2006 年，LOEBRICH 團隊通過酵母雙雜交篩選的方式首次在大鼠大腦中發(fā)現(xiàn)radixin蛋白與α5-GABAA受體存在相互作用，并證實radixin可將α5-GABAA受體錨定在突觸外位點［26］。在特異干擾radixin 的表達后，突觸外的α5-GABAA受體簇數(shù)量明顯減少，而穩(wěn)定radixin 與α5-GABAA受體結(jié)合后，可以阻止α5-GABAA受體再分布于抑制性突觸內(nèi)則進一步證明了radixin 在突觸外對α5-GABAA受體的錨靠作用［14，23］。

但是radixin 的錨靠作用是磷酸化依賴性的，必須要經(jīng)過磷酸化修飾發(fā)生構(gòu)象變化被激活后，radixin 才能實現(xiàn)對α5-GABAA受體的錨靠。靜息狀態(tài)下，radixin 處于磷酸化狀態(tài)，α5-GABAA受體可與radixin 蛋白結(jié)合并因此錨靠在細胞骨架，當有興奮信號傳遞時，radixin 的磷酸化水平下降，α5-GABAA受體結(jié)合不穩(wěn)定，從而使更多受體進入突觸內(nèi)實現(xiàn)再分布過程［14，23］。然而目前對于磷酸化radixin 的信號通路存在一定爭議，認為可能與蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）和RhoA/Rock 信號通路有關(guān)［27-28］。

PKC 是一種Ca2+依賴的蛋白激酶，最初在非神經(jīng)元細胞中發(fā)現(xiàn)可以參與ERM 蛋白家族的磷酸化過程。α5-GABAA受體再分布過程具有活動依賴性，當興奮性突觸活動時可以增加細胞內(nèi)的Ca2+濃度并促使radixin 蛋白發(fā)生去磷酸化，從而介導(dǎo)α5-GABAA受體的再分布［14］。因此，與Ca2+相關(guān)的可調(diào)控radixin 磷酸化過程的PKC 進入人們的視野。當使用抑制劑Go 6976 阻斷PKC 的活性后，ERM 蛋白的磷酸化水平增加［27］更加可以證明，Ca2+依賴性的PKC可以影響radixin 的磷酸化過程。Rho 具有調(diào)節(jié)如Rho激酶/ROKα等絲/蘇氨酸激酶活性的作用，通過對radixin 蛋白C 末端T564 位點進行磷酸化修飾，Rho 激酶可以改變radixin 蛋白的頭尾相連的構(gòu)象從而使radixin 蛋白被激活［29］。但是當神經(jīng)元活性發(fā)生變化時，RhoA/ROCK 信號通路可以使radixin 發(fā)生去磷酸化，而喪失對α5-GABAA受體的錨靠作用，從細胞骨架釋放的α5-GABAA受體橫向擴散速度增加，進而實現(xiàn)突觸和突觸外α5-GABAA受體的再分布過程［23］。

3.2 錨靠蛋白gephyrin 在突觸內(nèi)對α5-GABAA受體的錨靠作用及其調(diào)控機制 Radixin 發(fā)生去磷酸化使α5-GABAA受體從突觸外位點被釋放，釋放后的受體流動性增加并擴散至突觸而被位于突觸內(nèi)的gephyrin 蛋白捕獲，實現(xiàn)受體從突觸外向突觸內(nèi)的再分布［23］。研究［30］顯示，與正常對照組相比，降低gephyrin 的表達可以顯著增加GABAA受體的流動性，縮短受體在突觸部位的停留時間，這足以說明gephyrin 蛋白對受體的捕獲在GABAA受體再分布過程中的重要意義。Gephyrin 最初在與甘氨酸受體（glycine receptor，GlyR）共純化時被發(fā)現(xiàn)，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)gephyrin 與GABA 能抑制性突觸存在共定位現(xiàn)象，而通過與肌動蛋白細胞骨架相互作用，gephyrin 可以將膜蛋白與細胞骨架連接發(fā)揮其錨靠作用。Gephyrin 主要由G-結(jié)構(gòu)域、E-結(jié)構(gòu)域和C-結(jié)構(gòu)域三個結(jié)構(gòu)域構(gòu)成，各單體之間可以互相作用形成多聚體，并經(jīng)PTM 而發(fā)揮其錨靠功能［31］。但是與radixin 不同，gephyrin 的PTM 不僅形式多樣，而且調(diào)節(jié)相同PTM 方式的作用位點也并不單一，因此目前對于gephyrin 如何發(fā)揮其對α5-GABAA受體的錨靠作用尚不明確。

Gephyrin 的C-結(jié)構(gòu)域可以發(fā)生磷酸化修飾，在全身各系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)的gephyrin 蛋白中，其C-結(jié)構(gòu)域大約存在40個可磷酸化的位點，但在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，這一數(shù)目減少至個位數(shù)，其中與gephyrin 的成簇聚集現(xiàn)象密切相關(guān)的磷酸化位點之一即Ser270 氨基酸殘基。Ser270 位點的磷酸化可以受GAK3β 的調(diào)節(jié)。在GSK3β 的作用下，該位點發(fā)生磷酸化修飾而減少gephyrin-GABAA受體簇的形成，當使用抑制劑將GSK3β 活性抑制后，Ser270 殘基發(fā)生了去磷酸化，同時gephyrin-GABAA受體簇的密度相應(yīng)增加。與GSK3β 的作用相同，CDK5 也可以調(diào)節(jié)Ser270 位點發(fā)生磷酸化修飾［32-33］，但令人不解的是，在CDK5的作用下發(fā)生磷酸化修飾后對gephyrin-GABAA受體簇造成的影響與GSK3β 完全相反［32］，在這兩條信號通路中雖然蛋白發(fā)生相同的磷酸化，但最終產(chǎn)生不同結(jié)局的原因仍值得進一步探究。除Ser270 位點外，gephyrin 的Ser303和Ser305殘基在PKA 和CaMKⅡ的作用下也可以發(fā)生磷酸化。同前所述，α5-GABAA受體再分布的發(fā)生需要興奮活動的刺激，同時radixin 構(gòu)象的改變也與興奮信號密切相關(guān)。與此相一致的是，PKA 和CaMKⅡ作為Ca2+依賴的蛋白激酶，在調(diào)節(jié)Ser303 和Ser305 位點的磷酸化修飾時也需要興奮信號的刺激［34］，因此，Ca2+依賴的PKA和CaMKⅡ在調(diào)節(jié)gephyrin 發(fā)揮對GABAA受體的錨靠作用中可能扮演了非常關(guān)鍵的角色。

與上述通路介導(dǎo)的磷酸化修飾不同，DHHC-3可以介導(dǎo)gephyrin 的棕櫚酰化修飾。棕櫚酰化是將長鏈脂肪酸通過共價鍵連接至半胱氨酸殘基而對蛋白質(zhì)進行修飾的一種作用機制，通過棕櫚?；揎?，蛋白與細胞膜的結(jié)合程度可以發(fā)生改變。目前對抑制性突觸中可進行棕櫚?；揎椀牡鞍籽芯枯^少，其中g(shù)ephyrin 蛋白就是可以發(fā)生棕櫚酰化的蛋白之一［35］。在DHHC-3酶的作用下，gephyrin的C-結(jié)構(gòu)域中的Cys212和Cys284兩個位點可以被棕櫚?；沟胓ephyrin 蛋白與突觸后膜的連接更加緊密，進而對質(zhì)膜表面流動的GABAA受體進行捕獲而改變突觸的可塑性［36］。隨著研究的深入，更多調(diào)節(jié)gephyrin 修飾的信號通路進入人們的探討范圍，比如對gephyrin 聚集有負性調(diào)控作用的S-亞硝基化，對賴氨酸殘基Lys148 和Lys724 進行小泛素樣修飾物（Small Ubiquitin-like Modifier，SUMO）添加的SUMO化以及乙酰化等，都被發(fā)現(xiàn)可以改變突觸后膜上gephyrin蛋白簇的表達量［37-38］。更為復(fù)雜的是，在多條信號通路中，不同的修飾方式可能會相互作用、互為補充，這種復(fù)雜性使得人們對gephyrin 蛋白的研究變得愈發(fā)困難。

綜上所述，在雙錨靠機制的作用下，α5-GABAA受體可以完成在突觸內(nèi)外的再分布進而影響學(xué)習(xí)和記憶等認知功能，這可能是探究POCD 發(fā)生機制的重要靶點。但是在雙錨靠機制發(fā)揮作用的過程中，radixin 和gephyrin 似乎存在完全獨立的調(diào)節(jié)機制，對于是否存在一些共同的作用機制影響兩者的活性以及兩者在α5-GABAA受體的再分布中如何協(xié)調(diào)配合發(fā)揮作用等問題目前均無研究。因此，研究radixin 和gephyrin 在α5-GABAA受體再分布過程中的雙錨靠機制在相關(guān)疾病發(fā)生發(fā)展過程中的作用將會是接下來研究的重點，可能為治療相關(guān)疾病提供新的思路和方法。