梅玉潔，賽麥提喀日·阿布都巴日，安恒慶，陶寧，3

1 新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，烏魯木齊 830017；2 新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿三科；3 新疆泌尿男生殖系統(tǒng)臨床醫(yī)學(xué)研究中心

前列腺癌（PCa）是男性常見的癌癥之一，在全球男性惡性腫瘤中，發(fā)病率排第二［1］。前列腺特異性抗原（PSA）是PCa 早期診斷標(biāo)志物［2］，但是依靠PSA 檢測并不能準(zhǔn)確診斷PCa，并且PSA 也與前列腺其他良性疾病有關(guān)，常會造成誤診［3］。為了提高PCa 患者的早期診斷率并改善其預(yù)后，確定新的有效生物標(biāo)志物至關(guān)重要。加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）在2005 年由ZHANG 等提出，能夠從大數(shù)據(jù)中快速地提取與樣本特征相關(guān)的基因模塊，以供后續(xù)分析，為尋找疾病相關(guān)生物標(biāo)志物提供了很大便利。因此，本研究采用WGCNA 方法篩選與PCa相關(guān)性最高的基因模塊（關(guān)鍵基因模塊）及關(guān)鍵基因，通過對配對的PCa 組織和正常癌旁組織樣本基因表達(dá)分析，進(jìn)一步篩選其中的PCa 關(guān)鍵差異表達(dá)基因及預(yù)后相關(guān)基因，為PCa 患者提供新的研究靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)及其來源 從GEO數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi. nlm. nih. gov/geo/）中，通過以下條件“Prostate cancer”、“Series”、“Homo sapiens”及“Sample count大于15”搜索PCa相關(guān)數(shù)據(jù)集，從中篩選含配對正常癌旁組織的數(shù)據(jù)集。最后選擇下載了GSE104131 數(shù)據(jù)集的轉(zhuǎn)錄組測序標(biāo)準(zhǔn)化后的FPKM 數(shù)據(jù)及相關(guān)資料。GSE104131 數(shù)據(jù)集是通過平臺GPL16791 Illumina HiSeq 2500（Homo sapiens）測序生成的，包括16 個(gè)患者的PCa 組織樣本及其正常癌旁組織樣本，共32個(gè)樣本，病種來源于美國。

下載GSE69223 數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)和平臺數(shù)據(jù)。GSE69223 數(shù)據(jù)集是通過平臺GPL570［HGU133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 生成，包括15 個(gè)患者的PCa 組織樣本及其正常癌旁組織樣本，共30個(gè)樣本，病種來源于德國。

采用 Rstudio 4. 0 軟件 affy 包處理 GSE69223 數(shù)據(jù)集的原始數(shù)據(jù)，獲取探針和樣本的表達(dá)矩陣，并利用平臺數(shù)據(jù)將探針名稱轉(zhuǎn)換為基因名稱，GSE104131 數(shù)據(jù)集的FPKM 數(shù)據(jù)只需提取基因和樣本的表達(dá)矩陣，最后對兩個(gè)表達(dá)矩陣進(jìn)行l(wèi)og2轉(zhuǎn)換，后續(xù)分析將處理過的兩個(gè)表達(dá)矩陣稱為GSE69223數(shù)據(jù)集和GSE104131數(shù)據(jù)集。

1.2 PCa 組織關(guān)鍵基因模塊的篩選及通路富集分析 在Rstudio 4. 0 軟件中，加載WGCNA 包對GSE104131 數(shù)據(jù)集進(jìn)行WGCNA 分析。首先，選擇數(shù)據(jù)集中基因表達(dá)量排名前5 000的基因；然后對數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本聚類，并去除差異較大的樣本；其次，通過分析每對基因之間的Pearson相關(guān)性，生成關(guān)系矩陣；最后根據(jù)無標(biāo)度拓?fù)鋽M合指數(shù)（R2）值和平均連接度，確定最佳軟閾值（β），由此構(gòu)建WGCNA［4］。

根據(jù)基因間的高拓?fù)渲丿B度將相似基因合并構(gòu)建為多個(gè)基因模塊，并根據(jù)模塊間的協(xié)同表達(dá)情況對基因模塊進(jìn)行聚類，合并相似度較高的模塊，計(jì)算每個(gè)模塊與PCa 之間的相關(guān)性，最后選擇和PCa 關(guān)聯(lián)度最高的基因模塊作為關(guān)鍵基因模塊。

在 Rstudio 4. 0 軟件中，加載 clusterprofiler 包對關(guān)鍵基因模塊中的基因進(jìn)行KEGG 分析，觀察關(guān)鍵基因模塊的生物信號通路富集情況。

1.3 PCa 組織關(guān)鍵基因的篩選 計(jì)算關(guān)鍵基因模塊中所有基因的基因顯著性（GS）值和模塊身份（MM）值，根據(jù)|MM|＞0. 8、|GS|＞0. 8，篩選出與關(guān)鍵基因模塊、PCa 均高度相關(guān)的基因作為關(guān)鍵基因［4］。GS 代表基因與疾病的相關(guān)性，MM 代表基因與模塊的相關(guān)性。

1.4 PCa 組織關(guān)鍵差異表達(dá)基因的篩選 在GSE104131、GSE69223 兩個(gè)數(shù)據(jù)集中通過 t 檢驗(yàn)或非參數(shù)檢驗(yàn)比較關(guān)鍵基因在PCa組織與正常癌旁組織中的表達(dá)情況，將差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)鍵基因作為關(guān)鍵差異表達(dá)基因。

1.5 PCa 組織預(yù)后相關(guān)基因的篩選 GEPIA2 數(shù)據(jù)庫（http：//gepia2. cancer-pku. cn/）包括來自TCGA和GTEx 項(xiàng)目的9 736 個(gè)腫瘤和8 587 個(gè)正常樣本RNA測序表達(dá)數(shù)據(jù)［5］，本研究在GEPIA2數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行Kaplan-Meier 生存分析，根據(jù)關(guān)鍵差異表達(dá)基因表達(dá)量的中位數(shù)將數(shù)據(jù)分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，生存指標(biāo)分別選擇總體生存期（OS）和無病生存期（DFS），數(shù)據(jù)選擇“PRAD”癌癥選項(xiàng)（PRAD是數(shù)據(jù)庫中 PCa 的簡稱），共有492 個(gè)PCa 樣本，進(jìn)行生存曲線繪制。選擇兩組生存曲線比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的關(guān)鍵基因作為PCa組織預(yù)后相關(guān)基因。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用Rstudio 4.0 和SPSS26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料中，符合正態(tài)分布采用表示，兩組間比較采用 t 檢驗(yàn)，否則采用中位數(shù)（M）及四分位數(shù)（P25，P75）表示，兩組間比較采用非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PCa 組織關(guān)鍵基因模塊及調(diào)控的信號通路最終確定了10個(gè)基因模塊并進(jìn)行了顏色編碼，其中灰色模塊是未聚類的基因集（以下分析不關(guān)注該模塊）。根據(jù)基因模塊與PCa 相關(guān)性，棕色、黃色、青色、粉色、綠色、灰色、黑色、紅色、藍(lán)色、紫色模塊與PCa 的r 分別為 0.86、0.52、0.43、0.30、0.25、0.21、-0.041、-0.24、-0.49、-0.66，P 分 別 為 ＜0.01、0.006、0.02、0.1、0.2、0.3、0.8、0.2、0.01、＜0.01。棕色模塊與PCa 組織的相關(guān)性最高（r=0.86，P＜0.01），最終確定棕色模塊為本研究的關(guān)鍵基因模塊，其中包含789個(gè)基因。

關(guān)鍵基因模塊內(nèi)的基因主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路。

2.2 PCa 組織關(guān)鍵基因 關(guān)鍵基因模塊中，|MM|＞0.8、|GS|＞0. 8 的基因有 14 個(gè)，分別是 P4HB、ERGIC1、FOXA1、RP11-498C9.2、HNRNPF、CANT1、SYNGR2、HID1、EIF2AK1、MARCKSL1、NME1、ST14、HPN、RAB3D，將這14 個(gè)基因作為PCa 組織的關(guān)鍵基因。

2.3 PCa 組織關(guān)鍵差異表達(dá)基因 GSE104131 數(shù)據(jù)集中，PCa 組織中關(guān)鍵基因 P4HB、ERGIC1、FOXA1、RP11-498C9.2、HNRNPF、CANT1、SYNGR2、HID1、EIF2AK1、MARCKSL1、NME1、ST14、HPN、RAB3D 相 對 表 達(dá) 量 分 別 為 7.01 ± 0.30、5.97 ± 0.36、5.83 ± 0.34、5.68 ± 0.31、4.64 ±0.33、4.60 ± 0.34、4.43 ± 0.25、4.22 ± 0.42、3.79 ± 0.30、4.10 ± 0.52、3.90 ± 0.31、3.88 ±0.43、4.21± 0.71、3.20± 0.31，正常癌旁組織中分別為 5.73 ± 0.37、4.80 ± 0.33、4.67 ± 0.42、4.52 ±0.39、3.88 ± 0.24、3.38 ± 0.38、3.32 ± 0.35、2.99 ± 0.48、2.98 ± 0.24、2.64 ± 0.56、2.77 ±0.37、2.52 ± 0.39、1.54 ± 0.72、2.26 ± 0.41，與正常癌旁組織比較，關(guān)鍵基因在PCa 組織中表達(dá)水平均 升 高（t 分 別 為 9.811、8.788、7.809、8.557、6.839、8.802、9.417、7.021、7.752、7.027、8.554、8.631、9.703、6.681，P均＜0.001）。

GSE69223 數(shù)據(jù)集中，PCa 組織中關(guān)鍵基因P4HB、ERGIC1、FOXA1、HNRNPF、CANT1、SYNGR2、HID1、EIF2AK1、MARCKSL1、NME1、ST14、HPN、RAB3D 相 對 表 達(dá) 量 分 別 為 11.12［10.91，11.43］、8.87 ± 0.33、9.68 ± 0.29、8.00［7.80，8.20］、10.08 ± 0.27、7.52 ± 0.29、7.07 ± 0.34、7.95［7.69，8.50］、11.42 ± 0.52、9.88 ± 0.37、7.16±0.24、9.11±0.79、7.69±0.34，正常癌旁組織中分別為 10.11［9.82，10.76］、7.97 ± 0.54、7.89 ± 0.88、7.83［7.54，7.70］、8.87 ± 0.68、6.63 ± 0.39、6.13 ± 0.52、7.77［7.44，7.92］、10.02 ± 0.55、8.90 ± 0.38、6.21 ± 0.42、6.25 ±1.07、6.78±0.45，與正常癌旁組織比較，關(guān)鍵基因在PCa 組織中表達(dá)水平均升高（t/z 分別為3.712、5.532、7.484、2.053、6.378、7.030、5.846、2.717、7.222、7.108、7.654、8.336、6.283，HNRNPF：P=0.04，EIF2AK1：P=0.006，其 余 P 值 均 ＜0.001）。RP11-498C9.2 在該數(shù)據(jù)集中未出現(xiàn)，故未做比較分析。

最終確定14 個(gè)關(guān)鍵基因均為PCa 組織的關(guān)鍵差異表達(dá)基因。

2.4 PCa組織預(yù)后相關(guān)基因 P4HB、ERGIC1 以及RP11-498C9.2 高表達(dá)較低表達(dá)的患者DFS 更長（Log rank P 分別為0.018，0.029，0.024），HNRNPF低表達(dá)患者較高表達(dá)的患者OS 更長（Logrank P=0.03），其余基因兩組患者DFS 或OS 預(yù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。最終確定P4HB、ERGIC1、RP11-498C9.2、HNRNPF 為 PCa 組織預(yù)后相關(guān)基因。

3 討論

RNA 測序目前是分子生物學(xué)領(lǐng)域最常用的工具，為研究者們提供了極大的便利，這推動(dòng)了對PCa 早期診斷和治療靶點(diǎn)的研究。但是目前，PCa進(jìn)展中的病因和早期事件仍不清楚，并且多種因素可能促成其發(fā)展。本研究對PCa 組織樣本基因進(jìn)行了WGCNA 分析，獲得了與PCa 關(guān)聯(lián)最強(qiáng)的基因模塊，并且通過富集分析顯示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路在該模塊中被顯著富集，與文獻(xiàn)報(bào)道［6］一致。

隨后，我們進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)了與PCa 患者相關(guān)的14個(gè)關(guān)鍵基因，且與正常癌旁組織相比，均在PCa組織中高表達(dá)。其中，P4HB 是一種自噬相關(guān)基因，自噬對腫瘤既有抑制作用也有促進(jìn)作用，正常情況下，可在腫瘤早期抑制細(xì)胞癌變，但形成腫瘤后，自噬會維持促進(jìn)腫瘤的發(fā)展［7］。有研究［8］報(bào)道，P4HB的敲低顯著抑制了膀胱癌細(xì)胞的侵襲和增殖，P4HB的沉默抑制了體內(nèi)肝細(xì)胞癌發(fā)生［9］，我們在PCa 組織中也發(fā)現(xiàn)P4HB 高表達(dá)，下調(diào)P4HB 是否會影響PCa 的發(fā)展還有待研究。ERGIC1 是一種循環(huán)膜蛋白，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)密切相關(guān)，其表達(dá)異常會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能障礙，進(jìn)而可能對癌細(xì)胞造成影響［10］，例如，可能會發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ERS）障礙，而腫瘤會根據(jù)ERS不同的調(diào)節(jié)作用而發(fā)生抑制或增殖等變化［11］。ERGIC1 對不同腫瘤影響也不同，低表達(dá)可能對胃癌的發(fā)生和進(jìn)展起到促進(jìn)作用［12］，但在PCa 中沉默ERGIC1 對腫瘤有抑制作用［13］。RP11-498C9.2 是RP11家族的一位成員，其家族不同成員對惡性腫瘤有不同影響，上調(diào)RP11-468E2.5可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖［14］，下調(diào) RP11-295G20.2 可抑制體內(nèi)肝細(xì)胞癌生長［15］，敲低 RP11-567G11.1 可減弱腎細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力［16］，本研究中RP11-498C9.2在PCa 組織中高表達(dá)，具體機(jī)制需做進(jìn)一步分析。HNRNPF 屬于異質(zhì)核核糖核蛋白（hnRNPs）亞家族，在基因表達(dá)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要作用，hnRNPs與癌癥相關(guān)［17］，HNRNPF也可能與致癌過程有關(guān)［18］，有研究［19-20］發(fā)現(xiàn)，HNRNPF 在膠質(zhì)瘤、膀胱癌中過表達(dá)，敲低HNRNPF 可抑制膠質(zhì)瘤和膀胱癌細(xì)胞的增殖，HNRNPF 與 PCa 也有一定聯(lián)系，在 PCa 中高表達(dá)［21］，本研究結(jié)果與其相同。Rab3D，是 Rab3 亞型中的一個(gè)，該亞型在乳腺、結(jié)腸、食道、皮膚和腦腫瘤中起致癌作用，上調(diào)Rab3D 會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖［22］。HID1可編碼一種與運(yùn)輸相關(guān)的蛋白質(zhì)，有研究發(fā)現(xiàn)HID1 與無功能垂體腺瘤有關(guān)［23］，而在乳腺癌，宮頸癌，肺癌，甲狀腺癌和胃腸道癌細(xì)胞系中表達(dá) 喪 失［24］。 EIF2AK1 是 一 種 EIF2S1 激 酶 ，介 導(dǎo)EIF2S1 磷酸化，與子宮內(nèi)膜癌發(fā)生相關(guān)［25］。SYNGR2 是突觸腦蛋白家族成員，可參與區(qū)分良性和惡性甲狀腺腫瘤［26］。已有研究［27-31］發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXA1、CANT1、MARCKSL1、NME1、HPN 以及 ST14 與 PCa的發(fā)病和進(jìn)展有關(guān)，參與了不同機(jī)制影響PCa 的發(fā)生發(fā)展，而其余關(guān)鍵差異表達(dá)基因與其他癌癥有一定關(guān)系，但與PCa 的關(guān)系尚不清楚，可進(jìn)行深入探索。

最后，我們篩選出了4 個(gè)與PCa 預(yù)后相關(guān)的基因。其中，P4HB與PCa的DFS相關(guān)，其高表達(dá)的患者預(yù)后較好，有研究［32］也發(fā)現(xiàn)P4HB與PCa的DFS顯著相關(guān)，高表達(dá)的患者預(yù)后更佳，但在其他癌癥研究中，其高表達(dá)的患者預(yù)后更差［33-34］，這可能與自噬的雙向作用相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，ERGIC1 高表達(dá)的PCa患者預(yù)后更佳，與文獻(xiàn)［11］報(bào)道一致。在本研究中，RP11-498C9.2 低表達(dá) PCa 患者的DFS 預(yù)后較差，RP11-468e2.5、RP11-783K16.13、RP11-631N16.4、RP11-1109F11.5、RP11-228B15.4、RP11-496I9.1 及RP11-95O2.5 高表達(dá)的組織 DFS 延長［35］，目前還沒有RP11-498C9.2 與PCa 間關(guān)系的研究報(bào)道。HNRNPF及其家族hnRNPs在不同癌癥中預(yù)后不同，大多數(shù)hnRNPs 與腎上腺皮質(zhì)癌、肝細(xì)胞癌和肺腺癌的較差生存率相關(guān)，與腎透明細(xì)胞癌和胸腺瘤的預(yù)后更好也有關(guān)［19］，而在本研究中，HNRNPF高表達(dá)PCa患者OS更短。

總之，本研究通過公共數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)了14 個(gè)PCa的關(guān)鍵差異表達(dá)基因，其中P4HB、ERGIC1、RP11-498C9.2 及 HNRNPF 與 PCa 預(yù)后相關(guān)，為 PCa 的研究提供了新的方向，也有助于確定潛在的新藥靶點(diǎn)。