程萬里，劉鑫 ，任文俊，2，汪俊其 ，張立人，王平

1 昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院胸外科，昆明 650101；2 云南省第一人民醫(yī)院心臟大血管外科

肺癌是世界上癌癥相關(guān)死亡的主要疾?。?］。近年肺腺癌的發(fā)展日益嚴(yán)重，多數(shù)發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期［2］，失去手術(shù)根治機(jī)會。表皮生長因子受體（EGFR）是一種酪氨酸激酶受體，作為HER 家族受體中的一員，它是由具有酪氨酸激酶活性的C 端細(xì)胞內(nèi)催化區(qū)域、N 端細(xì)胞外配體結(jié)合位點(diǎn)和疏水性跨膜結(jié)構(gòu)域組成［3］。EGFR 激活突變在肺癌發(fā)生和細(xì)胞增殖過程中有非常重要的作用［4-5］，由于EGFR 突變的發(fā)生，酪氨酸激酶抑制劑（TKI）成為晚期肺腺癌患者治療主導(dǎo)藥物［6］，EGFR-TKI 也被批準(zhǔn)為 EGFR突變患者的一線治療藥物［7］，治療效果雖好，但存在耐藥性［8］。因此，有必要探尋提高藥物敏感性的有效調(diào)節(jié)劑以及監(jiān)測耐藥發(fā)生的生物標(biāo)志物。

微小RNA（miRNA）是一類由內(nèi)源基因編碼的短小非編碼RNA 分子，大部分miRNA 長度為19～22 個(gè)核苷酸［9］。有研究［10-13］表明，miRNA 可作為促癌或抑癌基因，靶向作用于耐藥、細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，調(diào)控多種因子的表達(dá)，參與腫瘤的發(fā)展和耐藥。據(jù)報(bào)道，miRNA 對肺腺癌EGFR 信號通路以及相關(guān)細(xì)胞因子的正常表達(dá)有重要調(diào)節(jié)作用，特異性miRNA 的失調(diào)可能是癌細(xì)胞化療耐藥性產(chǎn)生的主要因素。上述這些研究均表明miRNA 參與肺腺癌耐藥的發(fā)展過程，因而，明確miRNA 在肺腺癌EGFR-TKI 耐藥中的具體作用，為探索EGFR-TKI 耐藥的克服、藥物敏感性的提升、耐藥發(fā)生的監(jiān)測以及新型藥物開發(fā)提供了全新思路。肺腺癌EGFR-TKI 耐藥機(jī)制主要有EGFR 表達(dá)異常、EGFR 基因突變、酪氨酸激酶受體擴(kuò)增、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）等。近年，miRNA 在肺腺癌EGFRTKI 耐藥的不同機(jī)制中作用的研究已取得一定成果，現(xiàn)作以下綜述。

1 miRNA在EGFR表達(dá)異常致肺腺癌EGFR-TKI耐藥中的作用及其機(jī)制

靶向化療是晚期肺腺癌的關(guān)鍵治療，EGFR 的異常表達(dá)則嚴(yán)重影響EGFR-TKI 藥物的敏感性，成為肺腺癌患者預(yù)后的巨大障礙。有研究者用過表達(dá)miR-7 轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與未轉(zhuǎn)染的癌細(xì)胞比較，高表達(dá)miR-7 的細(xì)胞存活率明顯下降，再通過Western blotting 法檢測發(fā)現(xiàn)EGFR 的表達(dá)受miR-7的負(fù)向調(diào)節(jié)，miR-7 下調(diào)導(dǎo)致EGFR-TKI 的敏感性降低從而產(chǎn)生耐藥性［14］。miR-7 的負(fù)向調(diào)節(jié)在化療耐藥中起到了重要作用，通過檢測miR-7 的表達(dá)可監(jiān)測耐藥的發(fā)生，及時(shí)調(diào)整患者治療。有研究者發(fā)現(xiàn)，miR-608、miR-4513 以及 miR-1262 在 EGFR-TKI治療肺腺癌細(xì)胞（PC9 和H1299）時(shí)發(fā)揮不同作用，miR-608 和miR-1262 的表達(dá)顯著增強(qiáng)了EGFRTKI 在肺腺癌細(xì)胞中的抗增殖作用，而miR-4513的表達(dá)則明顯提升癌細(xì)胞的耐藥性，造成這種差異的主要因素是miRNA 等位基因單核苷酸多態(tài)性（SNP），miR-608 SNP rs4919510、miR-1262 SNP rs12740674 和 miR-4513 SNP rs2168518，通 過 介導(dǎo)miRNA 的表達(dá)，導(dǎo)致EGFR 通路相關(guān)因子表達(dá)失衡而出現(xiàn)上述情況15-16］。一項(xiàng)研究［17］表明，miRNA與腫瘤免疫微環(huán)境（TIME）也有著密切關(guān)系。利用病理學(xué)檢查EGFR-TKI 耐藥肺癌組織發(fā)現(xiàn)CD8 陽性T細(xì)胞浸潤水平明顯降低，體外實(shí)驗(yàn)顯示miR-1的上調(diào)可抑制CD8陽性T細(xì)胞的遷移、浸潤水平，改變了TIME 的特征，促進(jìn)了腫瘤EGFR-TKI 耐藥的發(fā)生和發(fā)展。表明miRNA 可通過調(diào)控TIME 特征進(jìn)而影響化療藥物的敏感性，miRNA 抑制劑和TIME 特征預(yù)測可能為EGFR-TKI 耐藥的克服和監(jiān)測提供了新策略。ZHANG 等［18］在研究肺腺癌中 NOTCH 信號與EGFR-TKI 耐藥關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，NOTCH 成員中的NOTCH3 在肺腺癌EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞株（HCC827 GR6）中上調(diào)，NOTCH3 又可調(diào)控下游膠原蛋白1A1（COL1A1）的表達(dá)，二者同時(shí)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖。miR-150 已被證實(shí)為NOTCH3 的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，miR-150 直接靶向調(diào)控NOTCH3 的表達(dá)，通過 miR-150/NOTCH3/COL1A1 軸 參 與 EGFR-TKI 耐藥。另外，在肺腺癌miR-630/YAP1/ERK 通路中，低表達(dá)的miR-630反饋性調(diào)節(jié)YAP1去靶向，并通過反饋通路中的ERK 因子使絲氨酸75 位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，降低促凋亡蛋白Bad 的表達(dá)，導(dǎo)致EGFR-TKI 的抗腫瘤敏感性下降［19］。這些證據(jù)均表明miRNA 在EGFR異常致肺腺癌EGFR-TKI耐藥中起重要作用。

2 miRNA在EGFR基因突變致肺腺癌EGFR-TKI耐藥中的作用及其機(jī)制

據(jù)研究［20-21］報(bào)道，在接受EGFR-TKI 治療的肺腺癌患者中超過半數(shù)會出現(xiàn)二次突變。在一、二代EGFR-TKI 藥物治療中多數(shù)患者會出現(xiàn)T790M 的突變，原因是EGFR 基因20 外顯子第790 位點(diǎn)上的蘇氨酸（T）突變?yōu)榧琢虬彼幔∕），增加了催化區(qū)域與三磷酸腺苷（ATP）的親和力，因此ATP和EGFR-TKI之間形成競爭性結(jié)合關(guān)系，影響EGFR-TKI 的結(jié)合導(dǎo)致敏感性降低或消失。另外，第三代EGFR-TKI 藥物是通過第797 位點(diǎn)上的半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合發(fā)揮抗腫瘤作用。由于二次突變，EGFR 797位半胱氨酸（C）被絲氨酸（S）取代，嚴(yán)重降低了EGFR-TKI 的結(jié)合率而出現(xiàn)耐藥。因此，肺腺癌患者在使用第三代藥物治療時(shí)所面臨的主要阻礙是EGFR C797S 突變［22-23］。一項(xiàng)研究［24］發(fā)現(xiàn)，具有 EGFR T790M 突變的兩組小鼠肺癌細(xì)胞：Ⅰ組EGFR-TKI 敏感兩株細(xì)胞（PC-9 和H3255），Ⅱ組EGFR-TKI 不敏感兩株細(xì)胞（（RPC-9 和H1975），用陽離子脂質(zhì)體使 miR-7 的質(zhì)粒表達(dá)后發(fā)現(xiàn)兩組癌細(xì)胞生長均被顯著抑制。此外，miR-7 的 3'- UTR 還可與 EGFR 的 mRNA 結(jié)合，降低EGFR 表達(dá)，對癌細(xì)胞的抑制作用進(jìn)一步加強(qiáng)。說明miR-7對T790M 突變的耐藥有著顯著的克服作用。就EGFR T790M 突變的肺腺癌患者而言，開發(fā)miR-7相關(guān)藥物可能使其治療更具針對性。有研究［25］發(fā)現(xiàn)，miR-138-5p 在 EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞株表達(dá)明顯下調(diào)，進(jìn)一步在EGFR T790M 突變的肺腺癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-138-5p，可恢復(fù)EGFR-TKI的治療敏感性，說明高表達(dá)水平的miR-138-5p 可能是克服EGFR T790M 突變致肺腺癌細(xì)胞株對EGFRTKI耐藥的關(guān)鍵因素。

3 miRNA 在酪氨酸激酶受體擴(kuò)增致肺腺癌EG?FR-TKI耐藥中的作用及其機(jī)制

近年，在應(yīng)用EGFR-TKI 治療的患者中，酪氨酸激酶受體基因擴(kuò)增所導(dǎo)致的二次耐藥也扮演著重要角色。酪氨酸激酶受體是一種跨膜蛋白，具有自主磷酸化活性，胞外區(qū)與肝細(xì)胞生長因子（HGF）配體結(jié)合發(fā)生受體二聚化，誘導(dǎo)ErbB3 磷酸化、PI3K/Akt通路激活，使下游通路持續(xù)活化導(dǎo)致EGFR-TKI 的抑制作用失效。HGF 不僅促進(jìn)酪氨酸激酶受體擴(kuò)增，還可與其結(jié)合調(diào)節(jié)下游SAE2 和circRNA CCDC66 的表達(dá)，誘導(dǎo)肺腺癌耐藥［26-27］。另外有研究［28］發(fā)現(xiàn)，酪氨酸激酶受體擴(kuò)增的同時(shí)部分EGFR T790M 也處于突變狀態(tài)，二者之間存在“合作關(guān)系”共同發(fā)揮耐藥作用。有研究者在治療酪氨酸激酶受體-TKI耐藥的過程中發(fā)現(xiàn)，miR-205/ERRFI1（ERRB受體反饋抑制因子1）軸是酪氨酸激酶受體-TKI 耐藥的新型中介。酪氨酸激酶受體-TKI 耐藥的維持需要EGFR 的活化。miR-205 可下調(diào)ERRFI1 的表達(dá)，下調(diào)的ERRFI1 又進(jìn)一步導(dǎo)致EGFR 通路的活化，出現(xiàn)酪氨酸激酶受體-TKI 耐藥表型［29］。說明miR-205 對耐藥的發(fā)生起到了重要推動(dòng)作用。有研究［30］表明，在 HGF 誘導(dǎo)的 EGFR-TKI 耐藥細(xì)胞系HCC827 和 PC-9 中，利用 miR-34a 聯(lián)合 EGFR-TKI 共同作用時(shí)，發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶受體靶點(diǎn)可被抑制，對HGF 介導(dǎo)的耐藥有抑制作用，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。這表明miR-34a 在酪氨酸激酶受體突變中具有重要作用，miR-34a 聯(lián)合化療藥物可增加化療藥物的敏感性，提升肺腺癌患者的治療效果。

4 miRNA 在 EMT 致肺腺癌 EGFR-TKI 耐藥中的作用及其機(jī)制

EMT 表型改變是肺腺癌患者EGFR-TKI 耐藥的另一種重要表現(xiàn)。EMT 是腫瘤上皮組織向紡錘狀間葉組織轉(zhuǎn)化［31］，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞的黏附性消退，間質(zhì)成分表達(dá)增加。EMT 在肺腺癌耐藥中的機(jī)制雖未完全明確，但在EMT 過程中可通過檢測其相關(guān)蛋白增加或減少來提示腫瘤EMT 發(fā)生。研究［32］表明，在肺腺癌EMT 發(fā)生過程中EGFR-TKI耐藥患者組織中EMT 相關(guān)蛋白表達(dá)會有所變化，上皮細(xì)胞消退時(shí)連接蛋白表達(dá)量下調(diào)如E-鈣黏合蛋白，而間質(zhì)蛋白表達(dá)增加如間質(zhì)波形蛋白，這些蛋白的表達(dá)變化可能為腫瘤 EMT 發(fā)生提供線索。LI 等［33］研究發(fā)現(xiàn)，致癌基因miR-181b-5p 可靶向作用于E-鈣黏合蛋白使其表達(dá)下調(diào)，促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。同時(shí)，miR-181b-5p 通過上述靶向作用還可介導(dǎo)EMT 的發(fā)生。有研究者發(fā)現(xiàn)，一種神經(jīng)內(nèi)分泌因子VGF 在肺腺癌細(xì)胞亞群中高表達(dá)，VGF 表達(dá)使EGFR-TKI 的敏感性下降而引起耐藥，當(dāng)沉默VGF 時(shí)EGFR-TKI 的敏感性又重新恢復(fù)，VGF 還可誘導(dǎo)EMT，從而增加肺腺癌細(xì)胞的遷移和侵襲行為［34］。另外，有研究者發(fā)現(xiàn)，3%～10%的EGFR 突變肺腺癌患者在接受EGFR-TKI 治療后會轉(zhuǎn)化為小細(xì)胞肺癌（SCLC），肺腺癌轉(zhuǎn)化為SCLC 的機(jī)制未完全闡明，但已證實(shí)RB1、TP53以及PIK3CA 突變占主導(dǎo)作用［35］。有研究者研究miR-92a 時(shí)發(fā)現(xiàn)，miR-92a 具有促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移功能，此功能是耐藥發(fā)生的主要因素。miR-92a 通過抑制同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）的表達(dá)，使 PTEN 失去作為 PI3K/AKT 通路負(fù)調(diào)控因子作用，激活PI3K/AKT，誘導(dǎo)EMT 發(fā)生，引起肺腺癌細(xì)胞EGFR-TKI 耐藥［36］。這些研究均說明miRNA 的調(diào)控在EMT 致肺腺癌EGFR-TKI 耐藥中的重要作用，這也為提高肺腺癌患者的療效和耐藥監(jiān)測提供了新的可能性。

5 miRNA 在其他原因致肺腺癌EGFR-TKI 耐藥中的作用及其機(jī)制

PTEN 為一抑癌基因的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，可抑制下游PI3K/AKT 通路激活，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。當(dāng)PTEN 發(fā)生甲基化、等位基因缺失等突變時(shí)，下游PI3K/AKT 通路磷酸化水平升高，則失去抑癌作用，導(dǎo)致肺腺癌 EGFR-TKI 發(fā)生耐藥［37］。研究顯示，癌基因miR-21 表達(dá)量越高，EGFR-TKI 耐藥現(xiàn)象越明顯，二者之間呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究［38］表明，過表達(dá)的miR-21 可靶向抑制PTEN 的表達(dá)，導(dǎo)致下游PI3K/AKT 信號通路激活，誘導(dǎo)肺腺癌EGFR-TKI 耐藥的發(fā)生。另一項(xiàng)研究［39］發(fā)現(xiàn)，miR-214在EGFR-TKI耐藥細(xì)胞系（HCC827/GR）中顯著上調(diào)，通過雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)驗(yàn)證了PTEN 是miR-214的直接靶點(diǎn)，高表達(dá)的miR-214 直接靶向作用PTEN，使PTEN/PI3K/AKT信號通路失調(diào)而介導(dǎo)EGFR-TKI耐藥。這些證據(jù)表明miRNA 的表達(dá)水平可影響PTEN 的抑癌作用，導(dǎo)致相關(guān)下游通路激活而發(fā)生耐藥?；蛟S開發(fā)有效的miR-21和miR-214抑制劑藥物，將大幅度提升PTEN突變肺癌患者EGFR-TKI的療效。

胰島素樣生長因子1 受體（IGF-1R）激活突變后，可通過激活PI3K/AKT 信號通路介導(dǎo)肺腺癌腫瘤細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡以及增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗藥 性［40］。MA 等［41］將 miR-497mimic 轉(zhuǎn) 染 至 EGFRTKI 耐藥的人肺腺癌細(xì)胞系（A549/GR）中，發(fā)現(xiàn)IGF-1R 和磷酸化AKT1表達(dá)水平降低，EGFR-TKI的抗癌效果顯著提高。說明高表達(dá)的miR-497 可抑制IGF-1R 蛋白的表達(dá)，阻斷通路下游的AKT1 激活。提示通過提高miR-497 的表達(dá)水平可逆轉(zhuǎn)肺腺癌IGRF-1R 突變患者的耐藥以及提升EGFR-TKI 敏感性。另一項(xiàng)研究［42］表明，miR-200b可抑制IGF-1R的表達(dá)，降低PI3K/AKT 和MAPK 信號通路的活性，增強(qiáng)EGFR-TKI 的抑制腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡作用?？梢姡谄渌?qū)е碌腅GFR-TKI 耐藥中，miRNA 的表達(dá)也發(fā)揮出至關(guān)重要的調(diào)控作用，也為提高EGFR-TKI治療療效提供了思路。

綜上所述，miRNA 可調(diào)控多種肺腺癌EGFR -TKI 耐藥途徑。miRNA 在肺腺癌EGFR-TKI 耐藥機(jī)制中通過自身的表達(dá)水平，打破EGFR-TKI 耐藥機(jī)制平衡，因此了解其在獲得性耐藥中潛在的分子機(jī)制，是提升EGFR-TKI 療效的關(guān)鍵。 miRNA 本身可成為藥物開發(fā)的靶點(diǎn)，通過miRNA 干擾方法調(diào)節(jié)體內(nèi)miRNA 的表達(dá)量可對EGFR-TKI耐藥關(guān)鍵因子如EGFR、酪氨酸激酶受體、HGF、EMT、PTEN、IGF-1 等以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行調(diào)控，達(dá)到逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞EGFR-TKI 抗藥性目的；另外，通過檢測目標(biāo)miRNA在體內(nèi)的表達(dá)變化，使監(jiān)測肺腺癌EGFR-TKI 耐藥發(fā)生成為可能。目前miRNA 在肺腺癌EGFR-TKI耐藥中的研究仍處于起步階段，miRNA 在肺腺癌耐藥中的具體機(jī)制還未完全闡明，依然面臨著諸多挑戰(zhàn)。作為化療藥物有效的調(diào)節(jié)劑和監(jiān)測耐藥發(fā)生的生物標(biāo)志物，miRNA 的可行性、安全性、有效性以及低成本高效益還均需大量的研究去驗(yàn)證。