張小妮 翁伊純 范奕浩 王曉娟 趙佳宇 張?jiān)讫?/p>

（東華大學(xué)化學(xué)化工與生物工程學(xué)院，上海 201620）

線(xiàn)粒體是真核細(xì)胞的氧化供能中心，進(jìn)行生物氧化和能量轉(zhuǎn)換時(shí)常伴隨著“活性氧”的產(chǎn)生，活性氧會(huì)造成線(xiàn)粒體內(nèi)膜通透性加強(qiáng)，膜內(nèi)外離子濃度的失衡，這種活性氧產(chǎn)生與抗氧化系統(tǒng)失衡狀態(tài)被稱(chēng)為線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激（mitochondrial oxidative stress，Mito-OS）［1］。 活 性 氧 簇（reactive oxygen species，ROS）包括超氧陰離子自由基（O2-）、羥基自由基（OH-）和過(guò)氧化氫（H2O2）等，ROS介導(dǎo)的氧化應(yīng)激會(huì)造成線(xiàn)粒體的結(jié)構(gòu)改變和功能障礙，即線(xiàn)粒體損傷［2］。此外，ROS還可以激活各種轉(zhuǎn)錄因子，例如細(xì)胞色素C轉(zhuǎn)移酶、BAX、Caspase 等［3］。線(xiàn)粒體功能障礙會(huì)破壞細(xì)胞、組織和器官功能，進(jìn)而引發(fā)衰老或多種疾病，如癌癥、心血管疾病、神經(jīng)退行性疾病以及肝腎疾病等，因此，線(xiàn)粒體已成為診治疾病的一個(gè)新靶點(diǎn)［4-5］。

探究線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激機(jī)理及其相關(guān)疾病發(fā)生機(jī)制，探索氧化損傷預(yù)防措施和開(kāi)發(fā)抗氧化應(yīng)激治療候選藥物等過(guò)程，穩(wěn)定可靠的氧化應(yīng)激細(xì)胞或動(dòng)物模型是必需條件。目前，氧化應(yīng)激細(xì)胞模型主要通過(guò)H2O2誘導(dǎo)構(gòu)建；而動(dòng)物模型主要包括兩類(lèi)：一是非特異性模型，即針對(duì)動(dòng)物組織器官造成全身性氧化損傷的模型，如D-半乳糖模型［6］、輻照模型［7］、臭氧損傷模型［8］等；另一類(lèi)為特異性模型，即針對(duì)動(dòng)物某個(gè)組織器官造成靶向損傷，如溴化苯模型［9］、阿霉素模型［10］、四氧嘧啶模型［11］、尼古丁損傷模型［12］和谷氨酸模型［13］等。為了確保模型的穩(wěn)定性，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)尤為重要，現(xiàn)有氧化應(yīng)激的評(píng)價(jià)指標(biāo)主要有直接和間接兩種類(lèi)型：直接指標(biāo)主要針對(duì)氧自由基的產(chǎn)生量，Sánchez等［14］曾利用自由基分析儀檢測(cè)仔豬斷奶應(yīng)激引起的血清中O2-、H2O2、NO等自由基的產(chǎn)生量；間接指標(biāo)則針對(duì)抗氧化劑的質(zhì)量濃度或活性，包括總氧化能力（T-AOC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（GSH-Px）、還原型谷胱甘肽（GSH）、過(guò)氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽還原酶（GR）等。然而，上述評(píng)價(jià)方法都是基于氧化應(yīng)激導(dǎo)致的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化、動(dòng)物表型變化或特征代謝產(chǎn)物生成情況等進(jìn)行的，無(wú)法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)態(tài)變化情況，并存在一定的不穩(wěn)定因素。

綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的問(wèn)世為生命科學(xué)領(lǐng)域點(diǎn)亮了一盞明燈，隨后錢(qián)永健等科學(xué)家們開(kāi)發(fā)出多種不同顏色的熒光蛋白，借助融合蛋白構(gòu)造“熒光分子探針”為蛋白質(zhì)定位、示蹤及其相互作用等研究提供技術(shù)支持。但單色熒光蛋白在空間定位和示蹤方面存在不足。Terskikh等［15］采用易錯(cuò)PCR方法改造紅色熒光蛋白drFP583，篩選到一種四聚體的突變體，命名為DsRed1-E5，熒光顏色可隨時(shí)間推移由綠色（激發(fā)光和發(fā)射光最大波長(zhǎng)：483 nm和500 nm）不可逆地轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色（激發(fā)光和發(fā)射光最大波長(zhǎng)：558 nm和583 nm），由于DsRed1-E5初表達(dá)產(chǎn)物在激發(fā)光下顯示綠色熒光，隨著Tyr（67）不斷氧化。顏色轉(zhuǎn)變速率不受蛋白濃度、pH值和離子強(qiáng)度影響，但溫度、光照和氧濃度會(huì)影響其紅綠熒光比［16］。Hernandez等［17］首次構(gòu)建了一種靶向線(xiàn)粒體的熒光計(jì)時(shí)器“MitoTimer”，即將熒光蛋白DsRed1-E5與定位線(xiàn)粒體內(nèi)膜的細(xì)胞色素C氧化酶COX8A亞基融合，初步證實(shí)可用于檢測(cè)線(xiàn)粒體發(fā)生。

本文報(bào)道了一種真核細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激的熒光報(bào)告系統(tǒng)，命名為“線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)”（mitochondrial oxidative stress fluorescent timer，Mito-OS-Timer），并利用Mito-OS-Timer驗(yàn)證了FLCN基因表達(dá)異?？纱侔l(fā)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激，證明該系統(tǒng)可監(jiān)測(cè)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激的動(dòng)態(tài)變化情況，這為氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的評(píng)價(jià)建立了一種新方法，也為開(kāi)發(fā)動(dòng)物模型相關(guān)評(píng)價(jià)方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質(zhì)粒與細(xì)胞系 E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞、人胚胎腎細(xì)胞HEK 293T為本實(shí)驗(yàn)室備存。重組 質(zhì) 粒 pLVX-shRNA、pcDNA-3HA-FLCN、pCMVHalo-FLCN為本實(shí)驗(yàn)室備存，pLVX-MitoTimer購(gòu)于優(yōu)寶生物公司；pLVX-Mito-OS-Timer委托通用生物公司合成。

1.1.2 試劑與設(shè)備 DMEM培養(yǎng)基、2,7-二氯熒光乙酰乙酸鹽（2,7-Dichlorodi-hydrofluorescein diacetate，DCFH-DA）、魚(yú)藤酮和青霉素-鏈霉素購(gòu)自Sigma公司；QuaCellTM特級(jí)胎牛血清購(gòu)于上海益啟公司；GAPDH購(gòu)自Bioss公司；D-PBS、Lipo 8000TM轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)于碧云天公司；H2O2購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；質(zhì)粒中提試劑盒購(gòu)自Magen公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自Sigma公司；Western轉(zhuǎn)膜儀和凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad公司；倒置熒光顯微鏡購(gòu)自徠卡公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)于BD公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒pLVX-shFLCN構(gòu)建與擴(kuò)增 常規(guī)PCR方法擴(kuò)增FLCN基因，上游引物：5′- TATAGA ATTCATGAATGCCATCGTGGCTCTC-3′；下游引物：5′-ATATCTCGAGGTTCCGAGACTCCGAGG-3′，以 pCMVHalo-FLCN為模板。pLVX-shRNA載體與PCR擴(kuò)增片段用EcoR I和Xho I雙酶切后，T4 DNA連接酶進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選和擴(kuò)增的陽(yáng)性克隆，抽提重組質(zhì)粒并委托上海生工測(cè)序，經(jīng)BLAST分析正確的克隆-80℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

將含pLVX-shFLCN重組質(zhì)粒的陽(yáng)性克隆菌接種至含氨芐的3 mL LB培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)增，37℃，225 r/min過(guò)夜搖菌培養(yǎng)至約OD600=0.5，經(jīng)中提試劑盒抽提質(zhì)粒，以去除內(nèi)毒素后，Nano Drop檢測(cè)定量后備用。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HEK 293T細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板內(nèi)，DMEM培養(yǎng)基（10%胎牛血清，1∶1 000 Penicillin-Streptomycin），待細(xì)胞長(zhǎng)至60%左右，0.8 μL Lipo8000TM轉(zhuǎn)染試劑、25 μL Opti-MEM與500 ng pLVX-shFLCN重組質(zhì)?；靹?，室溫靜置5 min。加入到孔板中轉(zhuǎn)染4 h，換液并添加2 μg/mL強(qiáng)力霉素（doxycyclin，簡(jiǎn)稱(chēng)Dox）誘導(dǎo)表達(dá)，37℃，5% CO2培養(yǎng)48 h。

1.2.3 ROS水平檢測(cè) HEK 293T細(xì)胞培養(yǎng)于24孔板中，待細(xì)胞長(zhǎng)至約90%時(shí)，采用0、10、50、75、100 μmol/L H2O2避光處理，37℃，5% CO2避光培養(yǎng)6 h，D-PBS洗1次，加入 10 μmol/L DCFH-DA，室溫避光孵育20 min。D-PBS洗3次后，為減少熒光淬滅影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)立即倒置熒光顯微鏡（激發(fā)光/發(fā)射光=488/535 nm）10倍放大率下觀(guān)察熒光情況。在無(wú)細(xì)胞區(qū)域進(jìn)行背景熒光校正后獲取熒光圖。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)分析 6孔板培養(yǎng)HEK 293T細(xì)胞，待長(zhǎng)至70%以上，200 μL Opti-MEM培養(yǎng)基、3.2 μL Lipo8000與2 μg轉(zhuǎn)染質(zhì)?；靹?，室溫靜置5 min，將混合試劑滴加在孔板中，使細(xì)胞轉(zhuǎn)染質(zhì)粒4 h，更換完全DMEM培養(yǎng)基（10% FBS，1∶1 000 P/S）培養(yǎng)48 h。棄去培養(yǎng)基，D-PBS洗1次，300 μL胰蛋白酶消化1 min，加入400 μL培養(yǎng)基終止消化。將細(xì)胞液轉(zhuǎn)到1.5 mL EP管中1 900 r/min離心5 min，棄去上清，1 mL D-PBS重懸，1 900 r/min離心5 min，棄去上清，加入1 mL 4%多聚甲醛，室溫固定10 min，1 900 r/min離心5 min后吸出875 μL的4%多聚甲醛，向剩余溶液中加入375 μL的D-PBS重懸，將樣品用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析，選擇FITC和PE通道分別篩選綠色與紅色熒光信號(hào)。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與分析 采用倒置熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，由于紅綠熒光光譜有明顯疊加現(xiàn)象，因此計(jì)算結(jié)果時(shí)需要去除干擾值。通過(guò)分別轉(zhuǎn)染Mito-DsRed和Mito-GFP，確定紅綠熒光間相互干擾值。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)至少3次，所有值均為x-±s，然后采用GraphPad Prism 6分析制圖。

2 結(jié)果

2.1 熒光秒表Mito-OS-Timer系統(tǒng)的建立與評(píng)價(jià)

2.1.1 Mito-OS-Timer實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞模型的線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激狀態(tài) 線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激細(xì)胞模型建立首先采用常規(guī)H2O2誘導(dǎo)法，如圖1所示，經(jīng)0、10、50、100、200 和 300 μmol/L H2O2誘導(dǎo)線(xiàn)粒體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，ROS使用DCFH-DA檢測(cè)氧化應(yīng)激水平。為保證采集面積一致，細(xì)胞群體的采集指標(biāo)是視野熒光集合采集。用Image J分析獲得平均熒光強(qiáng)度（該區(qū)域熒光強(qiáng)度總和除以該區(qū)域面積）。據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，未添加H2O2處理的綠色熒光強(qiáng)度為18.7，隨著H2O2濃度的增加綠色熒光強(qiáng)度隨之增加，當(dāng)H2O2濃度達(dá)到300 μmol/L時(shí)熒光強(qiáng)度升高至22（圖1-B）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著H2O2濃度增加細(xì)胞線(xiàn)粒體內(nèi)產(chǎn)生的ROS水平增加，即成功的構(gòu)建了線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。

圖1 H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的評(píng)價(jià)Fig.1 Evaluation of H2O2-induced oxidative stress cell model

熒光秒表Mito-OS-Timer系統(tǒng)主要借助于可變色熒光蛋白DsRed1-E5紅綠熒光變化與活性氧濃度線(xiàn)性相關(guān)，并設(shè)計(jì)利用線(xiàn)粒體內(nèi)膜的ATP合酶亞基ATP5PB的定位區(qū)域編碼基因與DsRed1-E5基因融合，正如圖2-A所示，啟動(dòng)序列采用pLVX啟動(dòng)子模塊，Timer序列前插入Kozak序列，提升翻譯啟動(dòng)效率。Kozak序列通常位于真核生物mRNA 5′端帽子結(jié)構(gòu)下游的一段高度保守序列，通常為GCCACCAUGG，它與翻譯起始因子結(jié)合而介導(dǎo)mRNA翻譯起始，相當(dāng)于原核生物的SD序列。

將設(shè)計(jì)合成的pLVX-Mito-OS-Timer表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞，在強(qiáng)力霉素（doxycyclin）誘導(dǎo)下，Mito-OS-Timer融合基因表達(dá)并靶向線(xiàn)粒體，在激發(fā)光下顯示出綠色熒光，如圖2-B所示。細(xì)胞在不同濃度 H2O2（0、10、50、100、200、300 μmol/L）避光處理24 h后，采用倒置熒光顯微鏡觀(guān)察各組細(xì)胞熒光情況。線(xiàn)粒體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，線(xiàn)粒體內(nèi)產(chǎn)生大量的ROS，其會(huì)加快這種氧化速度，進(jìn)而加快紅綠熒光轉(zhuǎn)變速率。在這里使用不同濃度的H2O2使線(xiàn)粒體處于不同強(qiáng)度的氧化應(yīng)激狀態(tài)，Mito-OSTimer系統(tǒng)可跟蹤監(jiān)測(cè)氧化應(yīng)激強(qiáng)度的變化。如圖2-C、2-D所示，未誘導(dǎo)時(shí)，Mito-OS-Timer系統(tǒng)基本以綠色熒光為主，紅綠熒光比值為0.18，隨著H2O2濃度增加紅色熒光強(qiáng)度增加，融合起來(lái)的熒光圖變成黃色，H2O2濃度到300 μmol/L時(shí)基本上都轉(zhuǎn)變成紅色熒光，紅綠熒光比值增加到1.52。從上述結(jié)果可看出，隨著H2O2濃度的增加Mito-OS-Timer系統(tǒng)紅綠熒光比值增加，Mito-OS-Timer系統(tǒng)成功被構(gòu)建。

圖2 Mito-OS-Timer系統(tǒng)靶向監(jiān)測(cè)H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞模型的線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激動(dòng)態(tài)變化Fig.2 Mito-OS-Timer targets to monitor the dynamic changes of mitochondrial oxidative stress induced by H2O2 in cell models

2.1.2 Mito-OS-Timer監(jiān)測(cè)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)細(xì)胞模型的線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激動(dòng)態(tài)變化 雖然H2O2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激細(xì)胞建模是常規(guī)方法，但存在一定不穩(wěn)定因素，因此采用其他建模方法進(jìn)行驗(yàn)證。魚(yú)藤酮是一種線(xiàn)粒體呼吸鏈抑制劑，主要作用于線(xiàn)粒體呼吸鏈NADH脫氫酶處抑制電子的傳遞，阻止NADH的氧化，可促發(fā)線(xiàn)粒體產(chǎn)生氧化應(yīng)激。本實(shí)驗(yàn)采用不同濃度的魚(yú)藤酮（0、0.01、0.1、0.5、1和 5 μmol/L）誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生不同強(qiáng)度的線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激。未加魚(yú)藤酮時(shí)，Mito-OS-Timer系統(tǒng)的綠色熒光很強(qiáng)，紅綠熒光比為0.08，隨著加入魚(yú)藤酮濃度的增加，綠色熒光減弱，紅色熒光增加，當(dāng)達(dá)到5 μmol/L時(shí)，紅綠熒光比達(dá)到0.51（圖3-A、3-B）。

圖3 魚(yú)藤酮誘導(dǎo)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激細(xì)胞模型評(píng)價(jià)Mito-OS-Timer系統(tǒng)Fig.3 Evaluation of Mito-OS-Timer system in rotenone-induced mitochondrial oxidation cell model

為了驗(yàn)證結(jié)果的可靠性，進(jìn)一步采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry，F(xiàn)CM）檢測(cè)紅綠熒光比變化情況。未經(jīng)魚(yú)藤酮處理的細(xì)胞，其紅綠熒光比值為2.46，而魚(yú)藤酮處理后，紅綠熒光比值增加，如圖4-A、4-B所示，魚(yú)藤酮處理濃度在0.5-5 μmol/L時(shí)的紅綠熒光比增加較緩，但當(dāng)濃度超過(guò)5 μmol/L，由于過(guò)度誘導(dǎo)則使得細(xì)胞線(xiàn)粒體處于凋亡狀態(tài)，紅色熒光強(qiáng)度反而降低，紅綠熒光比值開(kāi)始下降。上述結(jié)果表明，隨著H2O2和魚(yú)藤酮處理濃度的增加，模型細(xì)胞內(nèi)的紅綠熒光比值增加，證實(shí)Mito-OS-Timer系統(tǒng)不僅能夠監(jiān)測(cè)線(xiàn)粒體的氧化應(yīng)激狀態(tài)，而且能實(shí)現(xiàn)動(dòng)態(tài)變化的可視化。

圖4 Mito-OS-Timer監(jiān)測(cè)魚(yú)藤酮誘導(dǎo)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Flow cytometry results of rotenone-induced mitochondrial oxidation in rotenone-induced cell models monitored by Mito-OS-Timer

2.2 Mito-OS-Timer系統(tǒng)檢測(cè)FLCN基因與線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激的信號(hào)調(diào)控關(guān)系

為了進(jìn)一步驗(yàn)證Mito-OS-Timer系統(tǒng)檢測(cè)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激的實(shí)效性，構(gòu)建了pLVX-shFLCN重組質(zhì)粒并進(jìn)行電泳鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖5-A、5-B，隨后與pcDNA-3HA-FLCN分別轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞并誘導(dǎo)表達(dá)，Western Blot檢測(cè)FLCN蛋白表達(dá)情況。如圖5-C所示，轉(zhuǎn)染pcDNA-3HA-FLCN質(zhì)粒的細(xì)胞中FLCN蛋白表達(dá)量比對(duì)照細(xì)胞（WT）中FLCN蛋白表達(dá)量明顯增加，轉(zhuǎn)染pLVX-shFLCN質(zhì)粒的細(xì)胞與對(duì)照細(xì)胞相比，F(xiàn)LCN表達(dá)量明顯減少。上述驗(yàn)證了FLCN高表達(dá)和沉默質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建成功。隨后，轉(zhuǎn)染了Mito-OS-Timer的細(xì)胞用作陰性對(duì)照，使Mito-OS-Timer分別與pLVX-shFLCN、pcDNA-3HAFLCN重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，利用Dox.誘導(dǎo)表達(dá)48 h，將轉(zhuǎn)染Mito-OS-Timer的細(xì)胞用0.1 μmol/L 魚(yú)藤酮處理作為陽(yáng)性對(duì)照。經(jīng)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果可看出，轉(zhuǎn)染了使FLCN基因過(guò)表達(dá)的pcDNA-3HA-FLCN重組質(zhì)粒的細(xì)胞，Mito-OS-Timer紅綠熒光強(qiáng)度和紅綠熒光比值與僅轉(zhuǎn)染Mito-OS-Timer的幾乎一樣，說(shuō)明FLCN基因過(guò)表達(dá)并不會(huì)使線(xiàn)粒體發(fā)生線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激，而轉(zhuǎn)染了使FLCN基因沉默的pLVX-shFLCN質(zhì)粒的細(xì)胞，Mito-OS-Timer紅綠熒光強(qiáng)度和紅綠熒光比值明顯增強(qiáng)（圖6-D-F），這表明FLCN基因沉默可促發(fā)細(xì)胞線(xiàn)粒體產(chǎn)生氧化應(yīng)激現(xiàn)象，這與以往報(bào)道相符，結(jié)果更具有可視化。

圖5 Mito-OS-Timer檢測(cè)FLCN基因表達(dá)與線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激動(dòng)態(tài)變化關(guān)系Fig.5 Relationship between FLCN gene expression and mitochondrial oxidative stress dynamic changes detected by Mito-OS-Timer

3 討論

本文報(bào)道了一種評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的熒光蛋白實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，即Mito-OS-Timer系統(tǒng)，具有線(xiàn)粒體靶向性和熒光顏色變化與活性氧濃度正相關(guān)等特性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，H2O2誘導(dǎo)和魚(yú)藤酮處理的氧化應(yīng)激細(xì)胞模型中，Mito-OS-Timer可借助ATP5PB序列靶向定位線(xiàn)粒體，其紅綠熒光比值與誘導(dǎo)劑濃度呈正相關(guān)，證實(shí)其可作為評(píng)估細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激程度的可視化工具。為了進(jìn)一步評(píng)價(jià)該系統(tǒng)的可行性，利用Mito-OS-Timer檢測(cè)并證實(shí)FLCN基因表達(dá)沉默可誘發(fā)細(xì)胞線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激發(fā)生，此結(jié)果與以往研究基本一致［18］。

氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）描述了體內(nèi)氧化和抗氧化作用失衡的一種狀態(tài)，由德國(guó)科學(xué)家Helmut Sies首次于1985年提出［19］。隨后，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)衰老和糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生與之相關(guān)而備受關(guān)注。近年研究表明，氧化應(yīng)激是一個(gè)由細(xì)胞內(nèi)多種細(xì)胞器參與的復(fù)雜生化過(guò)程，包括線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體等。因此，針對(duì)各種細(xì)胞器建立細(xì)胞或動(dòng)物模型探究相關(guān)疾病發(fā)病機(jī)理成為了一種研究策略。線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激細(xì)胞模型的構(gòu)建，通常采用H2O2誘導(dǎo)或呼吸鏈抑制劑處理等方法。本研究分別利用H2O2和魚(yú)藤酮兩種方法構(gòu)建了氧化應(yīng)激細(xì)胞模型。H2O2是一種性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定且容易獲得的氧化能力較強(qiáng)的活性氧，是構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷常用的誘導(dǎo)劑。魚(yú)藤酮有著小而疏水的結(jié)構(gòu)，能夠穿透細(xì)胞內(nèi)部并與NADH脫氫酶相結(jié)合，阻斷了電子由NADH向輔酶Q的傳遞。這種電子轉(zhuǎn)移的抑制干擾了電化學(xué)梯度，影響線(xiàn)粒體膜電位，產(chǎn)生的電子不能被正常傳輸，會(huì)造成超氧自由基和活性氧的大量積累，最終造成線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激［19］。但也有其他建模方法，例如：Zhang等［20］在非酒精脂肪肝病研究中通過(guò)抑制NFκB/Orai1信號(hào)通路的方法誘發(fā)氧化應(yīng)激，即正常大鼠肝細(xì)胞（BRL-3A）經(jīng)NEFA3、BTP2、Orai 1抑制劑處理，分光光度計(jì)測(cè)量胞內(nèi)還原谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）含量，Western Blot和qRT-PCR分析Orai 1等氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)情況，免疫熒光法檢測(cè)活性氧（ROS）水平，以明確氧化應(yīng)激的發(fā)生。正如上所述，常規(guī)的細(xì)胞模型評(píng)價(jià)方法都是直接或間接檢測(cè)氧自由基生成量或氧化應(yīng)激相關(guān)因子的表達(dá)情況，但這類(lèi)靜態(tài)指標(biāo)的檢測(cè)方法，操作過(guò)程繁瑣、實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性低且費(fèi)用較高［21］。相較于以往的研究，本研究所提出的Mito-OS-Timer系統(tǒng)能夠在細(xì)胞水平對(duì)整個(gè)氧化應(yīng)激過(guò)程進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，為研究細(xì)胞水平氧化應(yīng)激的發(fā)生提供了一種新的研究思路。

為了驗(yàn)證Mito-OS-Timer系統(tǒng)的實(shí)用性，基于本課題組前期工作設(shè)計(jì)了一個(gè)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激檢驗(yàn)?zāi)Ｐ?。人源腫瘤抑制因子Folliculin（簡(jiǎn)稱(chēng)FLCN）的突變或缺失會(huì)誘發(fā)Birt-Hogg-Dubé（BHD）綜合征［22］。Baba 等［23］發(fā)現(xiàn) FLCN 基因敲除小鼠腎臟腫瘤細(xì)胞中雷帕霉素復(fù)合體（the mammalian target of rapamycin，mTOR）信號(hào)被激活。mTOR持續(xù)激活可以增強(qiáng)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子1（peroxisome proliferator-activated receptor coactivator-1，PGC-1）的基因表達(dá)，從而增加線(xiàn)粒體基因表達(dá)和氧耗，進(jìn)而導(dǎo)致線(xiàn)粒體生物發(fā)生和活性氧（ROS）產(chǎn)生加劇，線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激程度加深［22］。Hasumi等［24］發(fā)現(xiàn)FLCN的缺乏促發(fā)PPARGC1A表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致線(xiàn)粒體功能異常，氧化代謝增強(qiáng)，推測(cè)可能是FLCN缺失腎細(xì)胞獲得生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)并驅(qū)動(dòng)增生轉(zhuǎn)化。這些研究表明，明確FLCN缺失或突變與線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激之間關(guān)聯(lián)對(duì)于揭示BHD綜合征未知的發(fā)病機(jī)制尤為重要。如圖5所示，證實(shí)下調(diào)FLCN基因表達(dá)水平會(huì)誘發(fā)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激發(fā)生，以一種可視化結(jié)果證實(shí)以往研究的正確性。

本文報(bào)道的Mito-OS-Timer系統(tǒng)雖可評(píng)價(jià)氧化應(yīng)激細(xì)胞模型，但是細(xì)胞模型不能準(zhǔn)確反應(yīng)疾病發(fā)生的病理特征，甚至可能獲得較為矛盾的結(jié)果，課題組正著手利用該系統(tǒng)構(gòu)建動(dòng)物模型評(píng)價(jià)體系，有望與高度敏感、高通量的生物發(fā)光成像技術(shù)相結(jié)合，為氧化應(yīng)激動(dòng)物模型提供可視化監(jiān)測(cè)方法。

4 結(jié)論

成功構(gòu)建了一種靶向監(jiān)測(cè)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激的熒光蛋白系統(tǒng)Mito-OS-Timer。結(jié)果表明其紅綠熒光顏色轉(zhuǎn)變速率與線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激程度呈正相關(guān)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激發(fā)生的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)可視化監(jiān)測(cè)。研究進(jìn)一步證實(shí)，F(xiàn)LCN基因的沉默能夠引起線(xiàn)粒體氧化應(yīng)激。該系統(tǒng)在細(xì)胞模型上成功應(yīng)用，但在動(dòng)物模型上的應(yīng)用有待進(jìn)一步研究。