李瀟凡 耿丹丹 畢瑜林 江勇 王志秀 常國(guó)斌 陳國(guó)宏 白皓

（1.揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展研究院 教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州 225009）

microRNA（miRNA）是一類在進(jìn)化上較為保守的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA 分子，包含大約20-22個(gè)核苷酸，是基因表達(dá)的重要調(diào)控因子［1-2］。自發(fā)現(xiàn)以來，人們對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了大量的研究，截至2021年12月，miRNA 數(shù)據(jù)庫（miRBase，http://mirbase.org/）的最新版本包含了近300 個(gè)物種中超過38 000 個(gè)潛在miRNA 的信息。隨著人們對(duì)miRNAs 的結(jié)構(gòu)特征和成熟機(jī)制認(rèn)識(shí)逐漸深入，它們?cè)诩?xì)胞中的主要功能和相關(guān)蛋白因子的范圍被確定。目前，科學(xué)界公認(rèn)其功能是在細(xì)胞質(zhì)中負(fù)調(diào)控基因表達(dá)［1］，即編碼miRNA 的基因通過細(xì)胞核中的RNA 聚合酶Ⅱ或Ⅲ轉(zhuǎn)錄為包含5′帽子結(jié)構(gòu)和3′端polyA 尾的miRNA 的前體（pri-miRNA）［3］，隨后pri-miRNA 由RNAse III 酶Drosha 和輔助因子DGCR8 共同組成的復(fù)合體進(jìn)一步加工以形成莖環(huán)或發(fā)夾結(jié)構(gòu)前體miRNA（pre-miRNA）［4-5］，并通過exportin-5［6］從細(xì)胞核運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)，后通過Dicer酶和RNA 結(jié)合蛋白TRBP 進(jìn)一步加工成miRNA 雙鏈。miRNA 雙鏈解開后，引導(dǎo)鏈與Argonaute（AGO）蛋白形成RNA 誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），其中成熟的miRNA 通過靠近5′端的種子區(qū)與同源mRNA 3′端的堿基配對(duì)結(jié)合，進(jìn)而抑制靶標(biāo)mRNA 翻譯或者影響mRNA穩(wěn)定性，對(duì)轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)水平進(jìn)行負(fù)調(diào)控，該過程主要由AGO 的合作伙伴-功能蛋白GW182 介導(dǎo)完成［7］，而雙鏈的另一條鏈則立即降解，這就是miRNA 在生物體內(nèi)的經(jīng)典作用機(jī)制。

如今越來越多的證據(jù)闡明了miRNA 在細(xì)胞核中的亞細(xì)胞定位［8］，并研究了其在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中的各種新功能是通過非經(jīng)典作用機(jī)制進(jìn)行調(diào)控［9］，主要包括miRNA 前體可編碼多肽、miRNA 可與其他功能蛋白相結(jié)合、miRNA 可直接激活TLR 受體蛋白、miRNA 可提高蛋白表達(dá)水平、miRNA 靶向調(diào)控線粒體相關(guān)基因mRNA 以及miRNA 可直接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程等6 種非經(jīng)典作用機(jī)制。本文針對(duì)近年來miRNA 的6 種非經(jīng)典作用機(jī)制進(jìn)行總結(jié)，旨在能夠更加深入和系統(tǒng)地理解miRNA 的非經(jīng)典作用模式，為解析miRNA 在生物體內(nèi)復(fù)雜的分子調(diào)控機(jī)制提供新的思路和方法。

1 miRNA 前體pri-miRNA 編碼調(diào)節(jié)肽miPEPs

成熟的miRNA 是由編碼基因（MR 基因）轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過一系列加工后所得。在轉(zhuǎn)錄過程中，primiRNA 易被剪切為pre-miRNA，且存在時(shí)間較短，因此有關(guān)于miRNA 的機(jī)制研究主要集中于miRNA成熟體方向。近期研究表明，miRNA 的前體primiRNA 可能具有潛在的編碼功能。pri-miRNA 序列的5′UTR 包含短的開放閱讀框架（small open reading frames，smORFs），能被翻譯成大小4-60 個(gè)氨基酸的功能短肽（microRNA-encoded peptides，miPEP），過表達(dá)或外用miPEP 可通過增強(qiáng)其相關(guān)MR 基因的轉(zhuǎn)錄，影響相應(yīng)miRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，對(duì)成熟miRNA 進(jìn)行正向調(diào)控［10-11］。一般情況下miPEP 通過被動(dòng)擴(kuò)散和胞吞作用相關(guān)過程進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，合成的miPEP（無額外的修飾和加工）也能產(chǎn)生相同的自動(dòng)調(diào)節(jié)效果，這與通常作為配體被相關(guān)受體識(shí)別的前體衍生肽不同［12-14］。

2015年，Lauresergues 等［15］首次發(fā)現(xiàn)蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的pri-miR176 和擬南芥的primiR165a 能分別編碼短肽miPEP176 和miPEP165a，這兩個(gè)短肽增加了相應(yīng)miRNA 的積累和靶基因的下調(diào)，導(dǎo)致側(cè)根發(fā)育遲緩并能刺激主根生長(zhǎng)。目前通過人工合成miPEP，在大豆、葡萄等農(nóng)業(yè)作物上miPEP 的調(diào)節(jié)功能都得到了驗(yàn)證［11，16］。由于在人類、動(dòng)物和植物中miRNA 序列都很保守，因此研究pri-miRNAs 在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中是否編碼miPEP具有重要的價(jià)值。目前已證明在人類細(xì)胞中可以編碼miPEP-200a 和miPEP-200b［17-18］。2020年，Niu等［19］研究報(bào)道人樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DCs）中miR-155 可以編碼多肽miPEP-155，其可以特異性地與DC 細(xì)胞的互作蛋白HSC70 的ATPase 功能域綁定，降低炎癥環(huán)境中DC 細(xì)胞MHC-Ⅱ的表達(dá)和轉(zhuǎn)運(yùn)水平，調(diào)控其抗原提呈功能。

如今多項(xiàng)研究表明動(dòng)植物細(xì)胞中的pri-miRNA具有潛在的編碼功能，能編碼出具有調(diào)控功能的短肽miPEP，miPEP 其能影響相應(yīng)的miRNA 的轉(zhuǎn)錄水平，可通過增強(qiáng)其相關(guān)MR 基因的轉(zhuǎn)錄，對(duì)成熟miRNA 進(jìn)行正向調(diào)控。

2 miRNA 可與多種功能蛋白相結(jié)合

幾十年來，RNA 互作結(jié)合蛋白（RBPs）在前體mRNA（pre-mRNA）剪接、mRNA 移動(dòng)、mRNA分解和翻譯中的作用均被廣泛研究［20-22］。一般認(rèn)為，成熟的miRNA 與AGO 蛋白復(fù)合體組成一個(gè)RISC 復(fù)合物，結(jié)合并調(diào)節(jié)含有相關(guān)順式調(diào)控元件的靶標(biāo)mRNA 的表達(dá)［23］。在此過程中，AGO2 蛋白及其家族蛋白（AGO1、AGO3 和AGO4）被認(rèn)為是專門處理和裝載具有獨(dú)特結(jié)構(gòu)特征的miRNA 的RBP［24］。近期研究表明，有少數(shù)功能蛋白（miRBPs）與AGO2 蛋白功能相似，也可以與成熟的miRNA結(jié)合［25-26］。

2012年有研究報(bào)道，在HeLa 細(xì)胞中miRNA的表達(dá)量是AGO 家族蛋白的13 倍，而miRNA 與mRNA 的結(jié)合量是AGO 家族蛋白的7 倍［27］，這種“過量”miRNA 分子在細(xì)胞中的作用仍不清楚，而維持miRNA 的濃度和穩(wěn)定性已被證明涉及許多RNA結(jié)合蛋白，例如HuR 和AUF1［28］。這些研究結(jié)果表明除AGO 蛋白家族外，miRNA 還可與其他功能蛋白結(jié)合發(fā)揮非經(jīng)典調(diào)控途徑。Mukherjee 等［29］研究發(fā)現(xiàn)，HuR 可以從AGO2 中競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合mir-122，并在自身泛素化作用下從結(jié)合狀態(tài)中脫離，來調(diào)節(jié)mir-122 的胞外輸出。Eiring 等［30］研究發(fā)現(xiàn)，mir-328 除了發(fā)揮正常負(fù)調(diào)控功能，還可以競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合hnRNP E2 蛋白來阻礙其與CEBPA 蛋白的mRNA 結(jié)合，導(dǎo)致了CEBPA 核轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量上升。除了競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，也有一些研究支持miRNA 與AGO 和miRBPs三者之間存在合作性結(jié)合：如UF1 與let-7 的直接結(jié)合有助于其在體外以單分子水平轉(zhuǎn)移至AGO2［31-32］，HuR 可以增加let-7 與AGO2 的結(jié)合量［31］。Song等［33］研究發(fā)現(xiàn)mir-346 的中間序列基序（CCGCAU）可以與GRSF1 相結(jié)合，再與hTERT 3′UTR 結(jié)合時(shí)形成“鼓包環(huán)”，促進(jìn)hTERT mRNA 向核糖體的聚集從而上調(diào)hTERT 的表達(dá)，以獨(dú)立于AGO2 調(diào)節(jié)的方式促進(jìn)翻譯。另外，除了成熟的miRNA，premiRNA 也可以與功能蛋白相結(jié)合［34］。

可以看出，成熟miRNA 和pri-miRNA、premiRNA 能與多種功能蛋白相結(jié)合，并存在多種結(jié)合方式，如可逆性結(jié)合、競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合和合作性結(jié)合等，發(fā)揮非經(jīng)典調(diào)控途徑，展現(xiàn)出miRNA 調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)的雙重控制能力。

3 miRNA 可作為信號(hào)分子直接激活TLR 受體蛋白

如今普遍認(rèn)為，miRNA 能夠感知Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR），特別是核內(nèi)受體TLR7 可以被大腦中存在的miRNA 直接激活，miRNA 作為信號(hào)分子在不影響受體蛋白量的情況下發(fā)揮作用。早期研究報(bào)道，細(xì)胞外的let-7 能激活TLR7，并通過神經(jīng)元TLR7 誘導(dǎo)神經(jīng)變性［35］。游離的細(xì)胞外miRNA let-7b 可以激活小鼠巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞中的TLR7 信號(hào)，誘導(dǎo)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor，TNF-α）的產(chǎn)生導(dǎo)致神經(jīng)元死亡，這種效應(yīng)在TLR7 缺乏的細(xì)胞中并不存在［35］。

目前研究表明，游離miRNA 進(jìn)入細(xì)胞并到達(dá)核內(nèi)體誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)主要受兩方面因素影響：一方面是miRNA 需要被包裹在某些類型的載體里以保護(hù)它們?cè)诘竭_(dá)核內(nèi)體的過程中免受降解，有研究發(fā)現(xiàn)，猿猴免疫缺陷病毒誘導(dǎo)的腦炎模型腦中的細(xì)胞外囊泡（EVs）中miR-21 水平升高，并且miR-21可以通過TLR7 發(fā)出信號(hào)誘導(dǎo)神經(jīng)毒性［35］。通過將miRNAs 與陽離子脂質(zhì)體如1,2-二油酰-3-三甲基銨- 丙烷（DOTAP）、lipofectamine 或LyoVec 相絡(luò)合來模擬EVs 的作用，將細(xì)胞暴露于這些絡(luò)合物中，能發(fā)現(xiàn)miRNAs 位于TLR7/8 附近的核內(nèi)體中。研究表明在巨噬細(xì)胞中，與DOTAP 復(fù)合的miR-21和miR-29a 通過小鼠TLR7 和人TLR8 發(fā)出信號(hào)，誘導(dǎo)TNF-α 和IL-6 的產(chǎn)生［28］，而未與DOTAP 結(jié)合的游離miRNA 在體外不會(huì)誘導(dǎo)TNF-α 的產(chǎn)生。另一方面研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 序列特定位置的某些核苷酸會(huì)影響TLR 的激活［28］。Wu 等［36］認(rèn)為具有特定序列基序和長(zhǎng)度的細(xì)胞外miRNA 是有效的TLR7 激活劑，可以觸發(fā)先天免疫反應(yīng)。其中U 和C 對(duì)TLR7 活化起到關(guān)鍵作用，并鑒定出兩個(gè)由10 個(gè)核苷酸組成的miRNA 序列UGCUUAUAGU 和GUGCUUAUAG，可以刺激TNF-α 的產(chǎn)生，這是已知激活TLR7 的最短ssRNA 序列。

TLR7 是導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害擴(kuò)散的途徑中的一個(gè)基本要素，miRNA 的這種作用機(jī)制與腫瘤—免疫系統(tǒng)的通訊有關(guān)，在腫瘤生長(zhǎng)和擴(kuò)散中起到關(guān)鍵作用，具有重要的研究意義。

4 miRNA 可上調(diào)蛋白表達(dá)水平

基因表達(dá)調(diào)控是一個(gè)復(fù)雜而有序的過程，包括有多種水平的調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控起著不可忽視的作用。在該過程中，miRNA 主要作為抑制劑來影響mRNA 穩(wěn)定性及翻譯效率，下調(diào)蛋白表達(dá)水平。但最近的一些研究揭示了miRNA 在翻譯過程中對(duì)mRNA 穩(wěn)定性及翻譯效率起到積極作用，達(dá)到上調(diào)蛋白表達(dá)水平的效果［37-38］。

研究發(fā)現(xiàn)，位于一些mRNA 3′UTR AU 富含元件（AU-rich element，ARE）是能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)mRNA 穩(wěn)定性的元素之一，它兼具介導(dǎo)相關(guān)因子mRNA 衰變及增強(qiáng)某些mRNA 穩(wěn)定性的作用。Vasudevan 等［39］首先發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞周期停滯時(shí)，miRNAs 可以通過招募AGO 和FXR1 到靶標(biāo)mRNAs的ARE 區(qū)域來激活翻譯。而let-7 可以和人工合成的mircxcr 4 在細(xì)胞周期阻滯中協(xié)同促進(jìn)靶標(biāo)mRNA的翻譯上調(diào)，但在細(xì)胞增殖過程中抑制翻譯，即其翻譯調(diào)控隨細(xì)胞周期的變化在抑制和激活之間波動(dòng)。與此相似，AGO2-miR369-3p 復(fù)合物可以結(jié)合TNF-α ARE 招募FXR1，從而刺激TNF-α 的翻譯［39］，而miR-125b 可以通過防止ARE 降解來增強(qiáng)κB-Ras2 mRNA 的穩(wěn)定性和表達(dá)［40］。除了與3′UTR 的ARE的結(jié)合之外，miRNA 還可以通過與mRNA 的5′UTRs相互作用來促進(jìn)mRNA 翻譯。如miR-10a 通過與核糖體蛋白mRNA 的5′UTRs 相互作用來增強(qiáng)mRNA的翻譯［41］；miR-346 除了與3′UTR 結(jié)合激活翻譯之外［42］，還可以通過靶向RIP140 mRNA 的5′UTR 來提高RIP140 蛋白水平［43］；miR-483-5p 也被證明可以通過與IGF2mRNA 的5′UTR 結(jié)合來促進(jìn)IGF2 轉(zhuǎn)錄［44］。此外，在實(shí)際生產(chǎn)中有研究結(jié)論表明miRNA可能在mRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)過程中起到作用，如ggamiR-222a 能上調(diào)兩個(gè)蛋氨酸合酶基因Odosp_3416 和BF9343_2953 的表達(dá)，增加蛋氨酸濃度［45］，在植物中，干旱脅迫條件下miRNA-156能上調(diào)花青素基因表達(dá)，形成多酶復(fù)合物，該復(fù)合物將在粗面的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（RER）的胞質(zhì)面合成更高水平的花青素，從而提高抗干旱脅迫能力［46］。

miRNA 在發(fā)揮抑制劑作用的同時(shí)，也能夠在翻譯過程中起到上調(diào)靶向mRNA 表達(dá)作用，其可以通過招募功能蛋白到靶標(biāo)mRNAs 3′UTR 的ARE 區(qū)域或5′UTRs 來激活翻譯，上調(diào)蛋白表達(dá)水平。

5 miRNA 靶向調(diào)控線粒體相關(guān)基因mRNA

Mitochondrial microRNA（mitomiRs）指位于線粒體內(nèi)部的miRNA，它們絕大部分由核基因組編碼并轉(zhuǎn)移至線粒體的miRNA，在線粒體內(nèi)轉(zhuǎn)錄并調(diào)節(jié)線粒體基因表達(dá)。還存在少部分由線粒體基因組直接編碼合成的miRNA［47-48］，這些mitomiRs 的功能與細(xì)胞質(zhì)定位的miRNA 存在差異。

對(duì)于核來源mitomiRs，普遍認(rèn)為核編碼的miRNA 成熟后進(jìn)入線粒體抑制線粒體轉(zhuǎn)錄物的翻譯［47，49］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-181c 作為核來源miRNA定位于新生大鼠心室肌細(xì)胞線粒體中，可以與來自線粒體基因組的細(xì)胞色素c 氧化酶亞基1（mt-COX1）mRNA 的3′UTR 相結(jié)合，過表達(dá)miR-181c 可以顯著降低mt-COX1 蛋白水平［50］。Fan 等［51］研究發(fā)現(xiàn)，核來源的miR-2392 可以穿梭到線粒體中并與mtDNA雜交，下調(diào)調(diào)控癌癥中氧化磷酸化、代謝重編程和化學(xué)抗性的基因。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在肌肉分化過程中，miR-1 可以通過與特異性mRNA 堿基互補(bǔ)配對(duì)來促進(jìn)線粒體基因組轉(zhuǎn)錄物的翻譯，在該過程中miR-1 只需要與AGO2 結(jié)合，功能蛋白GW182并沒有參與［52］。隨著研究進(jìn)一步深入，發(fā)現(xiàn)這些mitomiRs 在缺乏線粒體DNA 的細(xì)胞中不表達(dá)，如在針對(duì)人正常前列腺上皮細(xì)胞（PNT1A）的野生型（WT）和mtDNA 缺失型（Rho0）細(xì)胞中mitomiRs 的表達(dá)水平研究發(fā)現(xiàn)，mitomiRs 在Rho0 型PNT1A 細(xì)胞中的表達(dá)水平顯著低于其在WT 型PNT1A 細(xì)胞中的表達(dá)水平［53］。對(duì)于線粒體來源的miRNA 研究相對(duì)較少，目前在人類和哺乳動(dòng)物中已檢測(cè)到線粒體來源miRNA［53-54］，在人類和小鼠的線粒體基因組也存在編碼類似miRNAs 的mitomiRs［55］。尚未檢測(cè)到線粒體內(nèi)存在由miRNAs 介導(dǎo)的翻譯抑制過程中必須的功能蛋白GW182，這與前文中的研究結(jié)果相照應(yīng)［52-53］，miRNA 加工蛋白Drosha 和DGCR8 也未檢測(cè)出；Dicer 酶同樣被證實(shí)不存在于線粒體中［53］，該結(jié)論在小鼠心肌細(xì)胞也被證實(shí)［56］。但Vargas等［57］研究報(bào)道pre-miR-338 和Dicer 酶可以在SCG神經(jīng)元軸突線粒體中共定位。

多項(xiàng)研究表明線粒體功能障礙與心腦血管疾病及癌癥等有關(guān)，miRNA 在細(xì)胞特異性表達(dá)表明他們有可能參與線粒體相關(guān)疾病，這無疑為線粒體ncRNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究指明了方向，有助于更全面的理解線粒體生物學(xué)，未來對(duì)mitomiRs 分布和功能的具體機(jī)制的研究可以確定新的藥物遞送途徑和線粒體生物標(biāo)志物，有助于更好地理解線粒體功能障礙相關(guān)疾病的診療和治療方法。

6 miRNA 可直接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程

在miRNA 經(jīng)典調(diào)控途徑中，成熟的miRNA 通常在細(xì)胞質(zhì)中形成RISC，與靶標(biāo)mRNA 的3′UTR堿基配對(duì)，靶點(diǎn)選擇主要由miRNA 5′UTR 序列決定，對(duì)細(xì)胞質(zhì)中的蛋白質(zhì)合成進(jìn)行抑制［58-59］。有不同研究表明，miRNA 包含的額外序列元素可以改變它們的亞細(xì)胞定位進(jìn)而調(diào)控它們的轉(zhuǎn)錄后行為，即miRNA 也可以在細(xì)胞核中發(fā)揮作用，來自高通量測(cè)序的數(shù)據(jù)甚至預(yù)測(cè)了核miRNA 的基因組DNA 結(jié)合位點(diǎn)，這可能在miRNA 轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究中發(fā)揮作用［60］。

在細(xì)胞核中已證實(shí)存在miRNA 作用機(jī)制所需的成分，比如AGO2 和Dicer 酶，但在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)之間的機(jī)制不同。其中，核RISC 蛋白分子量158 kD，相較于核RISC 平均3 MD 的分子量要小很多，成分有所缺失，僅由AGO2 和一個(gè)短RNA 形成［61］。因此普遍認(rèn)為AGO2/miRNA 復(fù)合物可以在細(xì)胞核外構(gòu)成，形成的RISC 復(fù)合物可進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)［62］。核-細(xì)胞質(zhì)運(yùn)輸也由Exportin-1 介導(dǎo)［63］，由miRNA 序列中特定核定位信號(hào)（AGUGUU基序、5′-UUGCAUGU-3′和5′-AGGUUGKSUG-3′基序等）指導(dǎo)富集［64-65］，再由核孔蛋白泵入到細(xì)胞核內(nèi)進(jìn)行修飾［66］，與靶基因啟動(dòng)子區(qū)域相互作用直接激活轉(zhuǎn)錄過程，如在AGO2 和GW182 作為支架參與的情況下，miR-589可結(jié)合環(huán)氧化酶-2（COX-2）啟動(dòng)子并激活基因轉(zhuǎn)錄［67］；miR-744 和miR-1186 通過靶向cyclinB1 基因啟動(dòng)子上調(diào)Ccnb1 基因的表達(dá)［68］，這種小RNA 參與的通過結(jié)合啟動(dòng)子區(qū)域在轉(zhuǎn)錄水平激活基因的現(xiàn)象被稱為RNA 激活（RNAa）。此外miRNA 也可以靶向負(fù)調(diào)控其他非編碼RNA 的前體RNA，如miR-709 可以與pri-miR-15a 和pri-miR-16-1 結(jié)合，阻止它們的進(jìn)一步加工以調(diào)節(jié)小鼠細(xì)胞的凋亡［69］。miR-122 可以通過與核蛋白結(jié)合來阻止pri-miR-21 的成熟［70］，近年來有研究發(fā)現(xiàn)，NamiRNAs（核激活miRNAs）能夠激活增強(qiáng)子，如miR-24 可以改變?cè)鰪?qiáng)子位點(diǎn)的染色質(zhì)狀態(tài)，使組蛋白修飾H3K27ac 富集在miR-24 靶向的增強(qiáng)子區(qū)域，該過程依賴增強(qiáng)子的完整性；miR-26a-1 在400 kb 的窗口中被蛋白質(zhì)編碼基因ITGA9 和VILL 包圍，過表達(dá)的情況下能激活其轉(zhuǎn)錄［71］。綜上可以看出miRNA 與增強(qiáng)子相互作用能調(diào)節(jié)基因表達(dá)和細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，然而miRNA 增強(qiáng)子相互作用機(jī)理和功能的分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步挖掘。

除卻自細(xì)胞核轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)發(fā)揮作用的經(jīng)典調(diào)控途徑，部分miRNA 還可以依照自身額外的序列改變亞細(xì)胞定位從而調(diào)控自身的轉(zhuǎn)錄后行為，即在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程，發(fā)揮非經(jīng)典調(diào)控作用。

7 問題與展望

本文重點(diǎn)闡述了6 種miRNA 非經(jīng)典作用機(jī)制及其研究進(jìn)展，在實(shí)際研究中仍有其他的非經(jīng)典調(diào)控途徑被科學(xué)家們所關(guān)注，如miRNA 可以與細(xì)胞核中的pri-miRNA 結(jié)合來阻止它們的進(jìn)一步加工［69，72］，但其作用機(jī)制仍需深入研究，是今后miRNA 研究的一個(gè)重要方向；還有研究發(fā)現(xiàn)在細(xì)胞內(nèi)同一條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路上，miRNA 可以同時(shí)通過其種子區(qū)序列和非種子區(qū)序列與靶基因/轉(zhuǎn)錄因子的3′端結(jié)合［73-74］，這種功能機(jī)制可以達(dá)到更加有效且穩(wěn)定的基因調(diào)控作用，對(duì)以miRNA 為靶點(diǎn)的多種疾病治療提供了新的思路和方法。另外，通過對(duì)miRNA 的亞細(xì)胞定位，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)［75］和無細(xì)胞質(zhì)膜的小室（如SGs）［76］中都檢測(cè)到了miRNA，這些miRNA 可能是調(diào)節(jié)特定生物過程和腫瘤發(fā)生所必需的，對(duì)研究細(xì)胞適應(yīng)性具有重要意義。然而，由于相關(guān)研究較少，位于不同亞細(xì)胞區(qū)室的miRNA 的組織、運(yùn)輸和功能在很大程度上是未知的，在本文中并未詳細(xì)闡述。

近年來，miRNA 在許多重要生物過程中得到了研究者的廣泛關(guān)注。miRNA 的結(jié)構(gòu)、基因組編碼、表達(dá)和成熟方式等方面的許多具體特征已被闡明，參與的事件范圍在經(jīng)典調(diào)控途徑的基礎(chǔ)上逐步擴(kuò)大，這為我們揭示了一片新的圖景（圖1）?？梢钥闯龆鄶?shù)非經(jīng)典調(diào)控機(jī)制都涉及到miRNA 的亞細(xì)胞定位，其中miRNA 前體可編碼多肽、miRNA 可直接激活TLR 受體蛋白、miRNA 靶向調(diào)控線粒體相關(guān)基因mRNA 以及miRNA 可直接調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄過程都與miRNA的亞細(xì)胞定位有關(guān)。自從發(fā)現(xiàn)miRNA以來，由于技術(shù)限制，它們的亞細(xì)胞定位在很大程度上被忽視。盡管在分離純亞細(xì)胞組分和基于免疫熒光的精確定位分析方面仍存在一些技術(shù)困難，但積累的研究為miRNA 的亞細(xì)胞定位和新的miRNA 調(diào)控機(jī)制提供了廣闊的視野，測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步已經(jīng)確定大量miRNA 富集于細(xì)胞核和多種細(xì)胞器中，他們的高豐度表明了miRNA 在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)中存在重要功能作用。

圖1 miRNA 非經(jīng)典作用機(jī)制Fig.1 Unconventional miRNA functions

但受制于目前多數(shù)動(dòng)植物基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白質(zhì)等信息的匱乏以及技術(shù)手段的限制，調(diào)控機(jī)制的某些關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)和細(xì)節(jié)仍沒有得到答案，比如在primiRNA 編碼調(diào)節(jié)肽miPEPs 中，miPEP 如何執(zhí)行他們的生物學(xué)功能，與其對(duì)應(yīng)的pri-miRNAs 的上調(diào)是否有特異性；pri-miRNA 的細(xì)胞質(zhì)翻譯和miRNA 的核成熟能否同時(shí)發(fā)生，pri-miRNA 如何協(xié)調(diào)其編碼和非編碼過程；在miRNA 作為信號(hào)分子進(jìn)入細(xì)胞并到達(dá)內(nèi)體誘導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的機(jī)制并不清楚，誘導(dǎo)miRNA激活TLR7 激活的基序尚未確定；mitomiRs 易位進(jìn)入線粒體調(diào)控的具體機(jī)制還存在爭(zhēng)議，mtDNA 編碼的miRNAs 是否存在非典型的生物發(fā)生機(jī)制依然存疑，無法證明這些miRNA 是否來自mtDNA 編碼，還是污染副產(chǎn)物，或是線粒體中存在另一套R(shí)NA 干擾機(jī)制。另外，大多數(shù)調(diào)控機(jī)制僅停留在研發(fā)階段，植物研究多集中在擬蘭芥和苜蓿等模式植物上，其他植物上少見報(bào)道，而動(dòng)物上使用人類和小鼠細(xì)胞系進(jìn)行研究，未進(jìn)行到臨床試驗(yàn)階段（表1）。相信實(shí)驗(yàn)技術(shù)的精進(jìn)和研究的深入，miRNA 及其他小RNA 分子參與的表達(dá)調(diào)控機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)會(huì)逐步明晰，這將有利于我們進(jìn)一步了解生物體內(nèi)部的運(yùn)作機(jī)制，為研究miRNA 在調(diào)控基因表達(dá)和功能中的作用及其機(jī)制打開了新的窗口，釋放其在人類和動(dòng)植物上重大的應(yīng)用潛能。