全 鑫 胡亞婕 范雯萱 張熙蕊 周萬(wàn)慧 張 萌 張博熙 徐 彬 楊玉英 李士澤

(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，動(dòng)物醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，黑龍江省牛病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大慶163319)

生物體常常因暴露在寒冷、炎熱和紫外線脅迫的環(huán)境下產(chǎn)生一系列的非特異性反應(yīng)[1]。當(dāng)機(jī)體因寒冷環(huán)境刺激時(shí)產(chǎn)生的反應(yīng)稱為冷應(yīng)激。冷應(yīng)激對(duì)神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)[2]、生殖系統(tǒng)[3]和心血管系統(tǒng)[4]等許多器官有著廣泛的影響，并且與去甲腎上腺素釋放增加[5]、精子成熟受阻[6]、心功能不全[7]、機(jī)體能量消耗增加[8]、免疫功能障礙[9]以及抗氧化能力降低[10]都呈現(xiàn)顯著相關(guān)性。

有研究表明，冷暴露會(huì)使畜禽生長(zhǎng)發(fā)育減慢，降低生長(zhǎng)性能和飼料利用率，從而影響畜牧業(yè)發(fā)展。冷暴露也會(huì)明顯增加全身能量消耗，引起大量的代謝變化[11]，包括攝入量、肝臟葡萄糖的生成以及外周組織葡萄糖利用都有所增加[12]。肝臟作為體內(nèi)重要的能量代謝器官，在許多生理過(guò)程中發(fā)揮著解毒、血漿蛋白合成、葡萄糖平衡以及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)利用和循環(huán)作用[13]。有報(bào)道稱，在急劇的低溫暴露下大鼠肝糖原迅速減少，由此會(huì)導(dǎo)致能量消耗和細(xì)胞凋亡[14-15]。因此，本研究旨在探討在冷暴露下，檢測(cè)小鼠生長(zhǎng)性能、血清生化指標(biāo)、肝臟組織染色和Western Blot檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白的表達(dá)，從不同角度探索慢性冷暴露對(duì)小鼠肝臟功能的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 主要試劑

蘇木精-伊紅(HE)染色試劑盒及碘酸雪夫氏(PAS)染色試劑盒購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司。

RIPA裂解液、BCA試劑盒、苯甲基磺酰(PMSF)、十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳緩沖液(SDS-PAGE)、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液、10×TBST均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)有限公司；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液(ECL)、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購(gòu)自于美國(guó)默克密理公司；斯瑪特生化檢測(cè)試劑盤購(gòu)自成都斯瑪特科技有限公司。

抗體：Bcl-2相關(guān)X(Bax)抗體(60267-1g)、B細(xì)胞淋巴瘤-2(Bcl-2)抗體(60178-1g)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)抗體(66470-2-lg)、β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(66009-1-lg)均購(gòu)于武漢三鷹生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 主要儀器

全自動(dòng)生化分析儀購(gòu)自成都斯瑪特科技有限公司；電泳槽、轉(zhuǎn)模儀、ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)均購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與飼養(yǎng)管理

本研究選用8周齡雄性C57BL/6小鼠32只(購(gòu)自中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院試驗(yàn)動(dòng)物中心)，體重(22±1) g，隨機(jī)分為2組：冷暴露組[(4±1) ℃]和對(duì)照組[(24.0±0.5) ℃]，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4只小鼠。

于人工氣候室適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行試驗(yàn)，在試驗(yàn)期間，小鼠采食SPF級(jí)輻照鼠糧(沈陽(yáng)市前民動(dòng)物實(shí)驗(yàn)飼料廠)，記錄體重。遵循晝夜交替規(guī)律，照明強(qiáng)度為100 lx，提供光照和黑夜均為12 h，并人工設(shè)定每天08:00和20:00為開燈和關(guān)燈時(shí)間。氣候室溫度為(24±0.5) ℃，相對(duì)濕度為(40±5)%。小鼠在(4±1) ℃溫度下連續(xù)冷暴露3周，每天刺激3 h。冷暴露結(jié)束將小鼠安樂(lè)死，采集血液樣品靜置4 ℃冰箱中，肝臟樣品置于-80 ℃冰箱中以便開展后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 生長(zhǎng)性能

在冷暴露期間測(cè)定每天采食量，并計(jì)算平均日采食量，測(cè)定冷暴露之前和冷暴露結(jié)束之后的體重，計(jì)算平均日增重。

1.4 血清生化指標(biāo)

血液樣本靜置在4 ℃冰箱中，在24 h內(nèi)，將血液樣品1 2000 r/min離心20 min分離血清，取100 μL血清放入生化試劑盤中進(jìn)行生化16項(xiàng)的檢測(cè)：白蛋白(ALB)、總蛋白(TP)、球蛋白(GLB)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)、鈣(Ca)、無(wú)機(jī)磷(PHOS)、尿素氮(UN)、總膽紅素(TB)、肌酐(Crea)含量及天門冬氨基氨酸轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、淀粉酶(AMY)、肌酸激酶(CK)活性及尿酐比(B/C)、白球比(A/G)。

1.5 肝臟組織HE染色

肝臟組織放入4%的甲醛溶液中進(jìn)行固定24 h、脫水、透明并進(jìn)行石蠟包埋，常規(guī)4 μm切片。二甲苯脫蠟、酒精水化、HE染色5 min，隨后進(jìn)行脫水二甲苯透明、封片，光學(xué)顯微鏡觀察糖原分布變化。

1.6 肝臟組織PAS染色及肝糖原含量

采樣、固定、切片同HE染色。二甲苯脫蠟、酒精水化、高碘酸-雪夫染色8 min、蘇木素染色2～3 min，隨后進(jìn)行脫水二甲苯透明、封片，光學(xué)顯微鏡觀察。肝糖原含量是染色完用Image J 1.8.0軟件檢測(cè)光密度所得出的。

1.7 組織蛋白提取及Western Blot檢測(cè)

從-80 ℃冰箱中取出小鼠肝臟組織80 mg，進(jìn)行研磨、裂解、離心，抽取上清液并做好標(biāo)記。Western Blot檢測(cè)相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度，使蛋白濃度相同，并充分混勻煮沸使蛋白質(zhì)變性。按照SDS-PAGE凝膠配制試劑說(shuō)明書，配制分離膠和濃縮膠。電泳結(jié)束后，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜上，配制5%脫脂乳室溫封閉1 h，用1×TBST溶液洗PVDF膜3次，每次10 min。按照抗體說(shuō)明書用TBST稀釋抗體，孵育過(guò)夜。次日洗膜3次，每次10 min。二抗室溫下孵育1 h，然后洗膜3次，每次10 min。將ECL按說(shuō)明書比例配制，使用ChemiDoc XRS+化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)，進(jìn)行曝光顯影觀察。目的條帶灰度值分析使用Image J 1.8.0軟件系統(tǒng)。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用GraphPad Prism 8.0.2軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行樣本t檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié) 果

2.1 冷暴露對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，冷暴露組平均日采食量極顯著升高(P<0.01)，平均日增重量顯著降低(P<0.05)。

*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)，NS表示差異不顯著(P>0.05)。圖4同。

2.2 冷暴露對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

如表1所示，與對(duì)照組相比，冷暴露組血清ALB、TP、GLB、TB、TG、GLU、GA、UN、Crea含量，ALT、CK、AMY活性，A/G及B/C差異不顯著(P>0.05)；血清AST活性顯著降低(P<0.05)，血清PHOS含量極顯著降低(P<0.01)。

2.3 小鼠肝臟組織學(xué)觀察

HE染色結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，冷暴露組出現(xiàn)較多的空泡樣變，肝細(xì)胞排列不均且形態(tài)異常，甚至消失，細(xì)胞間分界不明顯，提示肝細(xì)胞受損。

PAS染色結(jié)果如圖3所示，與對(duì)照組相比，冷暴露組出現(xiàn)較多的肝細(xì)胞變性，排列不均大小不等，提示肝細(xì)胞受損。與對(duì)照組相比，冷暴露組小鼠肝糖原含量減少 ，說(shuō)明小鼠體內(nèi)肝糖原在慢性冷暴露下發(fā)生改變。

2.4 冷暴露對(duì)小鼠肝臟中相關(guān)凋亡蛋白表達(dá)的影響

如圖4所示，與對(duì)照相比，冷暴露組Bcl-2/Bax的比值極顯著升高(P<0.01)，Bax/β-actin、Bcl-2/β-actin、Caspase-3/β-actin的比值差異不顯著(P>0.05)。

表1 冷暴露對(duì)小鼠血清生化指標(biāo)的影響

圖2 冷暴露小鼠肝臟HE染色

圖3 冷暴露小鼠肝臟PAS染色及肝糖原含量

Bcl-2:B細(xì)胞淋巴瘤-2 B-cell lymphoma-2; Bax:Bcl-2相關(guān)X蛋白 Bcl-2 associated X protein；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；β-actin：β-肌動(dòng)蛋白。

3 討 論

在畜禽養(yǎng)殖方面，冷暴露對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能、發(fā)育和免疫功能都有不利影響，這對(duì)養(yǎng)殖業(yè)造成一定的經(jīng)濟(jì)損失。有研究表明，較低的溫度會(huì)導(dǎo)致攝食量的增加[16]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，冷暴露組平均日采食量極顯著增加。與對(duì)照組相比，冷暴露組平均日增重顯著降低，與Birkelo等[17]研究結(jié)果一致。在冷應(yīng)激條件下，飼糧提供的大部分能量被用來(lái)維持動(dòng)物身體的需要和保持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，調(diào)節(jié)體溫和脂肪沉積，從而導(dǎo)致平均日采食量的增加和平均日增重的降低。有研究表明，輕度冷應(yīng)激時(shí)奶牛年平均產(chǎn)奶量會(huì)下降[18]。當(dāng)雛雞遭遇冷應(yīng)激后會(huì)引起下痢腸道菌群紊亂，導(dǎo)致生長(zhǎng)發(fā)育遲緩[19]。冷應(yīng)激抑制了科爾沁牛免疫球蛋白的合成[20]。本研究中，小鼠在慢性冷暴露環(huán)境下，能量代謝增加，肝糖含量減少，Bcl-2/Bax比值極顯著增加，以適應(yīng)冷暴露來(lái)抵抗肝細(xì)胞免受細(xì)胞凋亡。但長(zhǎng)期處在冷暴露的環(huán)境下會(huì)影響動(dòng)物的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)。因此，在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中除了改善動(dòng)物的居住環(huán)境，還應(yīng)加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，適當(dāng)在飼糧中添加維生素添加劑、氨基酸添加劑以及中草藥添加劑來(lái)提高動(dòng)物的抗應(yīng)激能力，減少冷應(yīng)激對(duì)機(jī)體的損傷。

肝臟中AST和ALT可作為評(píng)價(jià)肝臟功能狀況的指標(biāo)之一。有前人研究表明，當(dāng)環(huán)境溫度降低時(shí)，血清AST活性會(huì)明顯降低，但隨著溫度的進(jìn)一步下降，血清AST活性會(huì)略有上升。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，冷暴露組血清AST活性顯著降低，與Liang等[21]研究結(jié)果一致，說(shuō)明在慢性冷暴露下，肝臟出現(xiàn)大量的代謝變化會(huì)使肝臟受到一定的損傷。在動(dòng)物體內(nèi)能夠代謝氨基酸降解的酶主要是AST和ALT，而溫度變化會(huì)影響酶活性，酶的作用會(huì)使體內(nèi)蛋白質(zhì)流失而減少，能量代謝增加，從而保障動(dòng)物適應(yīng)寒冷環(huán)境。而本試驗(yàn)中血清ALT活性沒有顯著的變化，可能是由于肝臟的代償能力受冷暴露的影響較小，還需要進(jìn)一步的探究。從組織染色結(jié)果來(lái)看，與對(duì)照組相比，冷暴露組肝臟出現(xiàn)較多的空泡樣變和肝細(xì)胞變性，此現(xiàn)象說(shuō)明冷暴露下，肝細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)組織形態(tài)的變化和負(fù)荷范圍內(nèi)的損傷。肝臟在維持機(jī)體血清GLU和脂質(zhì)平衡方面起著核心作用，正常情況下，機(jī)體主要靠GLU通過(guò)糖酵解途徑獲取能量，生成的中間代謝物又能為蛋白質(zhì)和脂肪代謝提供原料，使糖、脂肪、蛋白質(zhì)關(guān)系密切相關(guān)。肝臟功能障礙可以引起肝臟糖、脂代謝紊亂[22]。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，冷暴露組小鼠血清GLU含量上升但差異不顯著。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)雛雞在寒冷的條件下，血漿中GLU含量會(huì)升高[23]。當(dāng)在低溫環(huán)境下，西門塔爾雜交犢牛血清GLU含量升高了84.5%[24]。荷斯坦奶牛在面對(duì)冷應(yīng)激時(shí)，血清GLU含量也同樣升高[25]。在研究育肥豬通過(guò)季節(jié)性冷刺激后，發(fā)現(xiàn)育肥豬的血清胰島素、GLU含量與冷刺激時(shí)間長(zhǎng)短有關(guān)。短期冷刺激使血清中胰島素含量降低而GLU含量增加[26]。而Yao等[27]和Liu等[28]研究結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果相反。TG主要功能是存儲(chǔ)能量，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，冷暴露組血清TG含量下降但不顯著，這表明在冷暴露下，刺激腎上腺素導(dǎo)致GLU含量不穩(wěn)定，糖原含量減少，需要攝入食物和加速能量代謝[29]，被迫動(dòng)用機(jī)體其他功能甚至脂肪沉積的能量，分解體內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)，產(chǎn)生大量GLU使血糖含量增加。與對(duì)照組相比，冷暴露組血清Crea含量沒有顯著變化，與靳二輝等[30]和郝世秋等[31]的研究結(jié)果相反，這表明冷暴露時(shí)機(jī)體保護(hù)腎臟組織和功能免受損傷。磷在維持機(jī)體正常機(jī)能方面有著重要作用。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，冷暴露組血清PHOS含量極顯著降低，與張道敬[32]研究結(jié)果一致，由于機(jī)體適應(yīng)了環(huán)境溫度的變化，使得內(nèi)分泌穩(wěn)定，磷的含量極顯著降低。也有研究表明，在急性冷應(yīng)激狀態(tài)下，血清磷的含量顯著上升，因?yàn)樵诩毙岳鋺?yīng)激下內(nèi)分泌發(fā)生改變，激素水平升高，磷的含量顯著上升。以上血清生化指標(biāo)變化結(jié)果表明，慢性冷暴露可引起小鼠血清中AST活性和PHOS含量顯著改變，肝臟發(fā)生病理?yè)p傷，使機(jī)體在轉(zhuǎn)氨酶水平和代謝水平發(fā)生變化。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的一種程序性死亡的形式，它可以清除體內(nèi)不需要和功能喪失的細(xì)胞，如胚胎發(fā)育期間或維持內(nèi)環(huán)境的平衡[33]。Bcl-2、Bax和Caspase等是較為常見與細(xì)胞凋亡有關(guān)的蛋白，其中Bcl-2蛋白家族參與了線粒體膜通透性的調(diào)節(jié)，是凋亡系統(tǒng)的主要參與者之一。Bcl-2蛋白家族可分為促凋亡蛋白(Bax、Bak)和抗凋亡蛋白(Bcl-2)等，這2組間的比率可作為判定細(xì)胞凋亡標(biāo)準(zhǔn)，在一定程度上起著重要作用。Bax蛋白在接收到特定信號(hào)后發(fā)生構(gòu)象變換并進(jìn)入線粒體，在線粒體中促進(jìn)細(xì)胞色素C釋放到細(xì)胞中[33]。Caspase-3有重要的樞紐作用，是驅(qū)動(dòng)者也是運(yùn)行者[34]。2種凋亡途徑最終都是通過(guò)激活Caspase家族中的成員因子，共同協(xié)作調(diào)控凋亡的產(chǎn)生[35]，它直接參與調(diào)亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程，并受到環(huán)境變化、DNA損傷等多種因素誘導(dǎo)。當(dāng)冷應(yīng)激時(shí)肝臟會(huì)處于高度的代謝狀態(tài)，會(huì)引起肝臟發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)，啟動(dòng)應(yīng)激狀態(tài)保護(hù)機(jī)制，刺激細(xì)胞凋亡程序[36]。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，在低溫狀態(tài)下會(huì)使內(nèi)皮細(xì)胞中抗凋亡蛋白表達(dá)上調(diào)[37]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，冷暴露組Bcl-2/Bax比值極顯著增加，與溫宇婷等[38]研究結(jié)果一致，也有研究得出，應(yīng)激引起B(yǎng)cl-2/Bax比值降低[39]，可能是由于冷暴露程度不夠引起細(xì)胞發(fā)生反應(yīng)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，冷暴露能夠使用Bcl-2/Bax比值增加，Bcl-2/Bax比值極顯著增加，可對(duì)肝細(xì)胞起到保護(hù)作用，減少細(xì)胞凋亡，這表明在慢性冷暴露狀態(tài)下對(duì)小鼠肝臟損傷作用與細(xì)胞凋亡的途徑有關(guān)。

4 結(jié) 論

綜上所述，慢性冷暴露會(huì)使小鼠的生長(zhǎng)性能受阻，血清AST活性和PHOS含量下降，糖原含量減少，肝臟健康受到一定的損傷。肝臟Bcl-2/Bax比值極顯著增加在一定程度上可對(duì)肝細(xì)胞起到保護(hù)作用，減少細(xì)胞凋亡，這些檢測(cè)指標(biāo)可以作為檢測(cè)慢性冷暴露的一個(gè)參考指標(biāo)，同時(shí)為畜牧業(yè)的生產(chǎn)提供一定的解決方案。