梁英，曹春暉，范麗敏，田傳遠

（1.中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點實驗室，山東 青島 266003；2.天津科技大學(xué)海洋資源化學(xué)與食品技術(shù)教育部重點實驗室，天津 300450）

全球?qū)η鍧嵞茉吹男枨蟛粩嘣鲩L，生物質(zhì)能源受到越來越多的關(guān)注。球等鞭金藻（Isochrysisg albana）H24 是常見的富油微藻，富含飽和脂肪酸（SFA,Saturated Fatty Acids）和單不飽和脂肪酸（MUFA），有利于制備生物柴油[1,2]。球等鞭金藻富含的二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）等n-3多不飽和脂肪酸（PUFA）成分具有諸多生理功能，被認(rèn)為對心腦血管疾病和神經(jīng)突觸形成等起重要作用[3,4]。近年來范麗敏[5]和梁英等[6]報道了棕鞭藻（Ochrosphaero neopolitana）H32 的脂肪酸組成。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)能準(zhǔn)確反映植物對光能的利用和光系統(tǒng)II（PSII）的狀況。營養(yǎng)鹽脅迫可以提高微藻的油脂含量，氮限制是其中有效的方法。氮缺乏導(dǎo)致光合作用產(chǎn)生的代謝通量在脅迫條件下轉(zhuǎn)化為脂類生物合成，脂肪酸組成發(fā)生改變是微藻應(yīng)對脅迫的一種機制[7-17]。微擬球藻（Nannochloropsissp.）的脂含量在氮饑餓條件下由39.1%升至68.5%[8]。富油新綠藻（Neochloris oleoabundans）在氮限制條件下脂肪酸含量由氮充足時的53.2 mg/L 增加至91.2 mg/L，同時單不飽和脂肪酸（MUFA）的含量達到最大值[11]。然而，直接限氮會影響細(xì)胞的正常生長，生物量降低。Na2WO4毒性低，對環(huán)境和生物體沒有危害，是農(nóng)業(yè)上常用的硝酸還原酶抑制劑，可導(dǎo)致氮限制。沈雄等[18]發(fā)現(xiàn)，鎢酸鈉限氮和直接限氮對微擬球藻的脂肪酸組成的影響結(jié)果一致。本文通過研究2 株海洋金藻在不同濃度Na2WO4培養(yǎng)基中生物量和脂質(zhì)積累的變化，探索進一步提高微藻油脂含量的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

球等鞭金藻（Isochrysisg albana）MACC/H24 和棕鞭藻（Ochrosphaero neopolitana）MACC/H32 實驗在1 000 mL 三角燒瓶中進行。

1.2 方法

將指數(shù)生長期的藻種接種到2f 培養(yǎng)基中，終體積為850 mL（0 mmol/L、0.5 mmol/L、1.5 mmol/L、2.5 mmol/L、5.0 mmol/L），每個處理設(shè)3 個重復(fù)，培養(yǎng)過程中光強為100 μmol·m-2s-1，連續(xù)光照、充氣，溫度25℃，鹽度31，Na2WO4脅迫培養(yǎng)時間為5 d。

采用血球計數(shù)板法測定細(xì)胞密度，根據(jù)戴榮繼等[19]方法測定葉綠素含量。用Water-PAM 葉綠素?zé)晒鈨x（Walz 公司生產(chǎn)）測定葉綠素?zé)晒鈪?shù)[20]。Fm：最大熒光；Fv：可變熒光；Fv/Fm：PSII 最大光化學(xué)效率（量子產(chǎn)量）；rETR：電子傳遞速率；qP：光化學(xué)淬滅。取指數(shù)生長末期的樣品，經(jīng)離心和凍干后，按改進的Bligh-Dyer 法測定總脂含量[21]。

將收獲的微藻冷凍干燥后，按Lepage 和Roy[22]的方法進行甲酯化，用1 mL 正己烷萃取分層后，取最上層黃色液體即脂肪酸甲酯供脂肪酸分析。采用美國Agilent6890N 氣相色譜儀、5973 型質(zhì)譜儀測定脂肪酸含量，其中氫火焰離子化檢測器（FID）和HP-5 彈性石英毛細(xì)管色譜柱。程序升溫，進樣口溫度為250℃，進樣1 μL，F(xiàn)ID 檢測器溫度為300℃，載氣為高純氦氣，流速為1.2 mL/min。質(zhì)譜條件為EI 離子源，離子源溫度為230℃，接口溫度為280℃，質(zhì)量掃描范圍m/z 50～600 u，掃描周期2.69次/s，電離能量為70 eV。以面積歸一劃法得到各脂肪酸組分的相對百分含量。

1.3 統(tǒng)計分析

應(yīng)用Sigmaplot12.0 軟件作圖，應(yīng)用SPSS16.0 軟件進行單因子方差分析（ANOVA）和SNK 多重比較分析，P＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na2WO4 濃度對球等鞭金藻H24 的生長、總脂含量和脂肪酸組成的影響

不同Na2WO4濃度的限氮處理顯著影響球等鞭金藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)值（P＜0.05）（圖1）。在整個鎢酸鈉脅迫培養(yǎng)周期中（5 d），各濃度組的Fv/Fm 值均呈上升趨勢，其中空白對照組的Fv/Fm 顯著低于其他處理組（P＜0.05）。培養(yǎng)第4 d 時2.5 mmol/L和第5 d 時5 mmol/L Na2WO4組的Fv/Fm 值最高（P＜0.05）。rETR 和qP 值先上升后平穩(wěn)，各組間不存在顯著差異。

圖1 Na2WO4 濃度對球等鞭金藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.1 Chlorophyll fluorescence parameters of Isochrysis galbana H24 exposed to different concentrations of Na2WO4

Na2WO4濃度顯著影響球等鞭金藻的細(xì)胞密度、葉綠素含量和總脂含量（P＜0.05），各組間差異顯著（表1）?？瞻讓φ战M的最終細(xì)胞密度和葉綠素含量最大，葉綠素含量隨Na2WO4濃度的升高而下降。在0～5 mmol/L 之間球等鞭金藻的總脂含量隨Na2WO4濃度的增加而明顯增加（23.09%～31.91%）。

表1 不同Na2WO4 濃度下球等鞭金藻的最終細(xì)胞密度、葉綠素和總脂含量Tab.1 The final cell density,chlorophyll content,and total lipid content of Isochrysis galbana H24 exposed to different concentrations of Na2WO4

Na2WO4濃度顯著影響球等鞭金藻的18∶1（n-9）、SFA、MUFA 和PUFA 含量（P＜0.05）（表2）。球等鞭金藻的14∶0、16∶0、18∶1（n-9）和DHA 含量高，其中18∶1（n-9）含量隨Na2WO4濃度升高呈明顯的先下降后上升趨勢，5.0 mmol/L 濃度組最大（34.54%）；SFA 和MUFA 含量隨Na2WO4濃度升高而增加，均在5.0 mmol/L 時達到最大值（分別為37.59%和42.65%）。隨著Na2WO4濃度由0 mmol/L上升至5 mmol/L，PUFA 含量由19.42%增加至36.23%。添加Na2WO4對球等鞭金藻其他脂肪酸含量沒有影響。

表2 不同Na2WO4 濃度下球等鞭金藻的脂肪酸組成（占總脂肪酸的百分比）Tab.2 The main fatty acid compositions（% of total fatty acids）of Isochrysis galbana H24 exposed to different concentrations of Na2WO4

2.2 Na2WO4 濃度對棕鞭藻H32 生長、總脂含量和脂肪酸組成的影響

不同Na2WO4濃度的限氮處理顯著影響棕鞭藻H32 的Fv/Fm、rETR 和qP 值（P＜0.05）（圖2）。在整個脅迫培養(yǎng)周期中（5 d），各處理組的Fv/Fm、rETR和qP 均呈下降趨勢，其中5.0 mmol/L Na2WO4濃度組各參數(shù)值下降幅度最大，顯著低于其他處理組。第1 d，2.5 mmol/L Na2WO4處理組的Fv/Fm 值最高，第2 d，空白對照組的Fv/Fm 顯著高于其他各處理組，表明脅迫初期低Na2WO4濃度下棕鞭藻Fv/Fm 值較高。脅迫后期低Na2WO4濃度組（1.5 mmol/L）的rETR 和qP 顯著高于其他處理組（第4～5 d）（P＜0.05）。

圖2 Na2WO4 對棕鞭藻葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.2 Chlorophyll fluorescence parameters of Ochromonas neopolitana H32 exposed to different concentrations of Na2WO4

Na2WO4濃度顯著影響棕鞭藻H32 的細(xì)胞密度、葉綠素含量和總脂含量（表3），各處理組之間差異顯著（P＜0.0 5）。空白對照組和低Na2WO4處理組（0.5 mmol/L）的最終細(xì)胞密度最大。5.0 mmol/L Na2WO4組的H32 葉綠素含量最高，但與0～1.5 mmol/L 鎢酸鈉處理組間差異不顯著（P＞0.05）。H32的總脂含量在0～5.0 mmol/L 間隨Na2WO4濃度的增加而增加（20.40%～25.55%）。

表3 不同Na2WO4 濃度下棕鞭藻的最終細(xì)胞密度、葉綠素含量和總脂含量Tab.3 The final cell density,chlorophyll content,and total lipid content of Ochromonas neopolitana H32 exposed to different concentrations of Na2WO4

除DHA 外，Na2WO4濃度顯著影響H32 的其他主要脂肪酸含量（P＜0.05）（表4）。棕鞭藻H32 有著較高含量的EPA、DHA、18∶1（n-9）和SFA，其中1.5 mmol/L Na2WO4組的14:0 含量最高（17.80%），5.0 mmol/L 組的16∶0、16∶1（n-7）和SFA 含量最高（分別為14.69%、8.90%和32.15%）。18∶1（n-9）和MUFA 含量呈現(xiàn)先下降后上升趨勢，空白對照組中為最大值（分別為37.33%和44.98%）。H32 的EPA和PUFA 含量在0～2.5 mmol/L 間隨Na2WO4濃度的增加而增加，0 mmol/L 時分別為4.15%和25.15%，至2.5 mmol/L 時上升到最大值（分別為10.72%和31.96%），之后則呈下降趨勢。

表4 不同Na2WO4 濃度下棕鞭藻的脂肪酸組成（占總脂肪酸的百分比）Tab.4 The main fatty acid compositions（% of total fatty acids）of Ochromonas neopolitana H32 exposed to different concentrations of Na2WO4

3 討論

鎢酸鈉可以降低硝酸還原酶的活性，表現(xiàn)為氮限制[23]。氮限制會使光合作用機構(gòu)的損傷和細(xì)胞生長滯后[24]。Song 等[25]就報道了氮缺乏的球等鞭金藻細(xì)胞數(shù)量、葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm、φPSII 和rETR 均顯著下降。Young 和Beardall[26]也發(fā)現(xiàn)，鹽藻（Dunaliella tertiolecta）的Fv/Fm 在缺氮介質(zhì)中顯著下降。在本研究中，2 株海洋的細(xì)胞密度和葉綠素含量均在Na2WO4培養(yǎng)基中明顯下降，與以上研究結(jié)果一致。但2 株金藻的葉綠素?zé)晒鈪?shù)對Na2WO4脅迫的反應(yīng)不同，其中棕鞭藻在高濃度Na2WO4中Fv/Fm 顯著降低，與以上研究結(jié)果一致；球等鞭金藻則在中、高濃度Na2WO4中Fv/Fm 升高，與Song 等[25]的結(jié)果并不一致。

缺氮能促進微藻生成脂質(zhì)，細(xì)胞此時代謝失衡，生長受到抑制，剩余能量以脂類形式儲存[15,27]，同時伴隨著脂質(zhì)代謝相關(guān)酶活性（如ACCase）的變化，以及大多數(shù)控制脂肪酸合成的相關(guān)基因表達的改變[28]。Lacour 等[9]報道了一株等鞭金藻（Isochrysis sp.）在氮饑餓條件下中性脂含量提高了45%。缺氮還可以顯著增加線粒體交替氧化酶（AOX）途徑的活性和脂肪酸的積累，使球等鞭金藻的脂肪酸生產(chǎn)率提高23%[16]。Livne 和Sukenik[29]也報道了球等鞭金藻在氮饑餓下的脂質(zhì)積累現(xiàn)象。類似的結(jié)果還見于微擬球藻（Nannochloropsis sp.）[8,30]、巴夫杜氏藻（Dunaliella parva）[17]以及富油新綠藻[11]等。本試驗結(jié)果與上述報道一致，球等鞭金藻和棕鞭藻的總脂含量在Na2WO4限氮脅迫條件下顯著增加，5.0 mmol/L Na2WO4時總脂含量達最大值，分別比空白對照組提高了38.21%和25.24%。然而由氮饑餓產(chǎn)生的脂質(zhì)貯存也具有很強的物種或品系特異性[31]。

氮濃度能夠影響植物去飽和酶基因的表達，影響脂肪酸組成。氮饑餓對脂肪酸組成的影響甚至大于對脂肪酸含量的影響[32,33]。Huerlimann 等[33]報道，在缺氮條件下大溪地等鞭金藻I.aff.galbana 的C16∶0、C18∶1（n-9）和MUFA 含量顯著提高，而PUFA 含量顯著下降，DHA 含量不變。Wang 等[14]報道了湛江等鞭金藻（I.zhangjiangensis）在氮限制條件下SFA 和MUFA 含量明顯增加，PUFA 含量降低。微擬球藻（Nannochloropsissp.）和扁藻（Tetraselmis suecica）的脂肪酸組成在氮充足和氮饑餓條件下也有顯著差異[8]。類似的趨勢還見于Benvenuti 等[30]、Griffiths 等[10]和Simionato 等[34]的報道。本實驗結(jié)果與以上研究一致，2 株金藻均在中-高Na2WO4濃度下14∶0、16∶0 和18∶1（n-9）含量顯著升高，SFA 和MUFA 含量增加，PUFA 含量顯著下降，DHA含量沒有明顯變化。

本研究結(jié)果表明，在指數(shù)生長末期添加Na2WO4限氮可以兼顧生物量和總脂含量[27]，并可改善脂肪酸組成。2 株海洋金藻生長和積累脂質(zhì)的適宜鎢酸鈉濃度均為5 mmol/L，可建議應(yīng)用于生產(chǎn)。而2 株金藻含有較高的DHA 成分，也可考慮開發(fā)定向培養(yǎng)技術(shù)，進一步強化DHA 的生成。