裴超，陳穎，尚勝男，李旭東，楊雪冰

（1.河南師范大學水產學院，河南 新鄉(xiāng) 453007；（2.河南省水產技術推廣站，河南 鄭州 450008）

隨著我國水產養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和高密度養(yǎng)殖的發(fā)展，水產動物疾病的發(fā)生也在增加，尤其是細菌性疾病造成的水產動物損失約占全部病害損失的50%以上[1]。氣單胞菌是一類革蘭氏陰性直桿菌，廣泛存在于水體、土壤等自然環(huán)境中[2]，是引起水產養(yǎng)殖動物細菌性疾病的常見病原，包括嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophilae）、維氏氣單胞菌（A.veronii）、溫和氣單胞菌（A.sobria）、豚鼠氣單胞菌（A.caviae）和殺鮭氣單胞菌（A.salmonicida）等，能引起魚類敗血癥、腸炎、打印病、鱉類穿孔病和腐皮病等嚴重疾病，給水產養(yǎng)殖業(yè)造成重大經濟損失[3]。目前主要還是靠抗生素和人工合成的抗菌藥物治療水產養(yǎng)殖動物細菌性疾病。但是長期應用某種特定的抗菌藥物，極易引起病原菌對該種藥物的耐藥性，因此實時檢測養(yǎng)殖區(qū)內病原菌耐藥性的變化十分必要，有利于養(yǎng)殖者有針對性地選擇病原菌敏感藥物，達到理想的治療效果[4-9]。河南省沿黃河地區(qū)包括洛陽、鄭州、新鄉(xiāng)、開封等地，是河南省池塘養(yǎng)殖的主要區(qū)域，主要養(yǎng)殖鯉（Cyrinus carpio）和斑點叉尾（Ictalurus punctatus）。本研究通過檢測河南省沿黃河地區(qū)養(yǎng)殖魚類體內氣單胞菌耐藥性的最新情況，并結合近幾年的連續(xù)監(jiān)測數據分析細菌耐藥性的變化，可為該養(yǎng)殖區(qū)的合理用藥提供依據。

1 材料與方法

1.1 供試藥物

采用南京菲恩醫(yī)療科技公司生產的藥敏分析試劑板測試分離到的菌株的藥物敏感性。供試藥物為我國目前允許使用的主要水產抗菌類藥物，包括恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、磺胺間甲氧嘧啶鈉、磺胺甲惡唑+甲氧芐啶（復方新諾明），藥物濃度梯度如表1 所示。

1.2 菌株分離鑒定

2020 年4—10 月分別從河南省鄭州市中牟縣、滎陽市王村、洛陽市孟津縣白鶴鎮(zhèn)、洛陽市孟津縣會盟鎮(zhèn)、新鄉(xiāng)市延津縣和開封市龍亭區(qū)、開封市祥符區(qū)等養(yǎng)殖池塘采集黃河鯉，均重（1.15±0.53）kg，共48 尾），和斑點叉尾均重（0.83±0.46）kg，共71尾。體表用75%酒精消毒后，用灼燒過的接種環(huán)從肝臟和腎臟處穿刺，在LB 培養(yǎng)基上進行劃線培養(yǎng)，28℃培養(yǎng)24 h 后，挑取單菌落至LB 培養(yǎng)基中，擴大培養(yǎng)后，繼續(xù)用劃線培養(yǎng)法純化3 次。純化后的菌體用細菌基因組提取試劑盒（TakaRa）提取DNA，采用16S rDNA 序列鑒定菌株種類。DNA 擴增正向引物為5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物5’-GGTTACC TTGTTACGACTT-3’。PCR 反應條件為：95℃5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃1.5 min，33 個循環(huán)，72℃終延伸10 min。PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳確定片段大小符合預期后，送上海生工生物工程公司測序。測序結果進行BLAST（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）搜索，通過序列比對結果確定菌株種類。

1.3 抗菌藥物最小抑菌濃度的測定

采用藥敏分析試劑板（南京菲恩醫(yī)療科技公司）測試藥敏，試劑板中藥物濃度設置如表1。挑取純化后的單個菌落于5 mL 生理鹽水中，制成OD625=0.5 的菌懸液，吸取200 μL 菌懸液加入無菌生理鹽水中，至終體積為20 mL?；靹蚝竺總€微孔加200 μL，陰性對照孔加入200 μL 無菌生理鹽水。放入28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～28 h 后讀取結果。通過肉眼判定，試劑板孔底澄明孔對應的最低藥物濃度即為藥物的最小抑菌濃度MIC。能夠抑制50%的菌株生長所需要的最小藥物濃度即為該藥物的MIC50；能夠抑制90%的菌株生長所需要的最小藥物濃度即為該藥物的MIC90。每個菌株對各藥物敏感性重復測試3 次，取一致性最高的結果為最終結果，若3 次測得的結果均不一致，則重復測3 次，直至取得一致結果。藥物敏感性的測定以及耐藥率的計算依據美國國家臨床實驗室標準化委員會（Clinical and laboratory standards institute，CLSI）的標準進行判定[10]。數據結果采用SPSS 軟件進行分析，每種藥物從2016—2020 年的5 次測定作為一組數據，不同藥物組之間進行比較。各組數據進行方差齊性檢驗和方差分析（Analysis of Variance,ANOVA）后，采用最小顯著性差異法（Least-Significant Difference,LSD）比較不同藥物組間MIC50、MIC90和耐藥率的差異顯著性。

表1 所使用的藥物及藥物濃度梯度設置Tab.1 The drugs and concentration gradient in the test

2 結果與分析

2.1 氣單胞菌的分離鑒定

表2 氣單胞菌分離株信息Tab.2 The information on the isolated Aeromonas strains

2.2 氣單胞菌對抗菌藥物的感受性

針對分離到的34 株氣單胞菌，測定7 種水產常用藥物對每株菌的MIC，然后根據各菌株的MIC分布，得到每種藥物能夠抑制半數菌株生長的最小抑菌濃度MIC50，和抑制90%菌株數的最小抑菌濃度MIC90。恩諾沙星和鹽酸多西環(huán)素MIC50數值最小，均為0.78 mg/L，依次為氟苯尼考（1.56 mg/L）、硫酸新霉素（3.13 mg/L）、甲砜霉素（6.25 mg/L）；MIC50數值最大的藥物為磺胺間甲氧嘧啶鈉（512 mg/L）和復方新諾明（256 mg/L）。MIC90數值最小的藥物為恩諾沙星、硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素，均為12.5 mg/L，其次是甲砜霉素和氟苯尼考，為200 mg/L，最大的是磺胺間甲氧嘧啶鈉和復方新諾明，為512 mg/L。氣單胞菌對磺胺間甲氧嘧啶鈉耐藥率最高，為58.8%；對甲砜霉素、氟苯尼考的耐藥率也較高，分別為32.4%和29.4%；對復方新諾明和恩諾沙星的耐藥率為23.5%和20.6%；對鹽酸多西環(huán)素和硫酸新霉素最為敏感，耐藥率分別為8.8%和11.8%。氣單胞菌對各種抗菌藥物感受性如表3 所示。

表3 氣單胞菌對各種抗菌藥物的感受性分布（n=34）Tab.3 The sensitivity of Aeromonas strains to antibacterial drugs

2.3 氣單胞菌對抗菌藥物感受性的年度變化

在2016—2020 年間，每年都對沿黃河養(yǎng)殖區(qū)的氣單胞菌進行分離鑒定，并對各抗菌藥物對氣單胞菌的MIC50和MIC90進行測定，按年份的統(tǒng)計結果見表4，年度變化示意圖見圖1 和圖2。恩諾沙星和甲砜霉素對氣單胞菌的MIC50較低（分別為9.0和11.9）且呈現略微下降趨勢,恩諾沙星MIC90相對穩(wěn)定，維持在25 mg/L 左右；而甲砜霉素MIC90在2017 和2018 年從200 mg/L 下降到100 mg/L 后，在2019 和2020 年又回升到了200 mg/L；硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素的MIC50和MIC90在2018 年出現一個高峰值，均為100 mg/L；氟苯尼考的MIC50五年來相對穩(wěn)定，保持在1.56 mg/L 到3.13 mg/L 之間，但是MIC90處于上升狀態(tài)，增幅較大，從6.25 mg/L增加到200 mg/L；磺胺間甲氧嘧啶和復方新諾明的MIC50和MIC90一直處于較高狀態(tài)，高于128 mg/L。各藥物組的MIC50無顯著差異性（P＞0.05），而甲砜霉素和氟苯尼考MIC90明顯高于恩諾沙星、硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素（P＜0.05）。甲砜霉素和氟苯尼考之間，恩諾沙星、硫酸新霉素和鹽酸多西環(huán)素之間無顯著差異性（P＞0.05）。

圖1 2016—2020 年抗菌藥物對氣單胞菌的MIC50Fig.1 The MIC50 of antibacterial drugs to Aeromonas from 2016 to 2020

圖2 2016—2020 年氣單胞菌對抗菌藥物的MIC90Fig.2 The MIC90 of antibacterial drugs to Aeromonas from 2016 to 2020

表4 抗菌藥物對氣單胞菌的MIC 和耐藥率年度變化Tab.4 The annual changing of antibacterial drugs MIC and resistance rate to Aeromonas

耐藥率年度變化顯示，在2016—2018 年，氣單胞菌對硫酸新霉素、磺胺間甲氧嘧啶和復方新諾明的耐藥率極高，在80%～100%之間，顯著高于其他四種藥物（P＜0.05），2019 年和2020 年氣單胞菌對這三種藥物的耐藥率有所下降，但對磺胺間甲氧嘧啶仍有約60%的耐藥性；氣單胞菌對恩諾沙星和鹽酸多西環(huán)素的耐藥率在2018 年有明顯升高，達到53.8%，之后呈下降趨勢；氣單胞菌對甲砜霉素和氟苯尼考的耐藥率較為穩(wěn)定，維持在20%～40%之間（圖3）。硫酸新霉素、磺胺間甲氧嘧啶和復方新諾明三種藥物之間，以及恩諾沙星、甲砜霉素、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素四種藥物之間，耐藥率無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 氣單胞菌的分離

本文采用16S rDNA 序列測定的方法，分離和鑒定了沿黃河養(yǎng)殖區(qū)鯉和斑點叉尾體內的氣單胞菌。從分離數量來看，維氏氣單胞菌數量占80%，是目前魚類體內的主要氣單胞菌類型，這與已報道的其他地區(qū)的分離結果相類似，表明該菌是目前最流行的氣單胞菌[11]。維氏氣單胞菌是養(yǎng)殖水體中常見的條件致病菌，感染魚體致病后可以導致魚體出現體表出血、潰爛、鰭條腐爛、突眼、腹水等癥狀。魚體中維氏氣單胞菌的流行可能與養(yǎng)殖密度過高、過度投喂、水質惡化等因素相關。以往對水產動物病原的分離調查，常常以發(fā)病水產動物為主要研究對象，而發(fā)病以后再進行病原鑒定和藥敏試驗往往會花費較多的時間，耽誤最佳的治療時機。本研究分析了正常養(yǎng)殖魚體中的氣單胞菌種類，證明最常見的是維氏氣單胞菌，這為平時做好有針對性的疾病預防和早期診斷治療提供了參考依據。

3.2 藥物敏感性變化分析

2020 年各菌株的MIC50結果顯示，氣單胞菌對恩諾沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和鹽酸多西環(huán)素較為敏感，這與已報道的其他地區(qū)氣單胞菌的耐藥性結果相一致[12-14]。氟苯尼考的MIC50數值較低且年度變化不明顯，但MIC90明顯升高，說明氟苯尼考對一部分菌株仍然十分有效，但是，正在有越來越多的菌株對氟苯尼考有了耐藥性，耐藥率的統(tǒng)計結果也顯示近兩年氣單胞菌對氟苯尼考的耐藥率較前幾年有所上升，國內其他地區(qū)也存在類似情況。例如北京地區(qū)魚源嗜水氣單胞菌對氟苯尼考也存在耐藥菌株，耐藥率約為15%[15]。MIC90數據和耐藥率結果顯示，很大一部分菌株也已經對甲砜霉素產生了耐藥性。氣單胞菌對氟苯尼考和甲砜霉素耐藥性的增加，可能是這兩種藥物平時養(yǎng)殖中常用，選擇壓力導致細菌產生了耐藥基因并進行傳播擴散。氣單胞菌對抗菌藥物的年度變化表明，恩諾沙星的MIC50和MIC90一直比較穩(wěn)定，但數值偏高，因此氣單胞菌對恩諾沙星的耐藥率也較高，在2018年出現了一個約50%的耐藥峰值；硫酸新霉素、鹽酸多西環(huán)素、甲砜霉素的殺菌效果會有浮動變化，硫酸新霉素在2016—2018 年、鹽酸多西環(huán)素在2018 年，抑菌效果很差，這可能與當年及之前年份較多的使用這兩種藥物有關，使細菌對這兩種藥物的耐藥性出現了一個明顯的升高。

本實驗中大部分菌株對磺胺類藥物不敏感，氣單胞菌對磺胺間甲氧嘧啶和復方新諾明的敏感性較差，盡管近兩年對這兩類磺胺類藥物的耐藥率有所下降，但仍處于較高水平。北京、廣州等地的魚源氣單胞菌也對磺胺類藥物有很高的耐藥性[10,16]，這表明氣單胞菌對磺胺類藥物的耐藥性存在普遍性，這可能與平時養(yǎng)殖中長期大量使用磺胺類有關。

普查水產動物致病菌的耐藥性有利于掌握水產動物致病菌對各種抗生素藥物敏感性的變化，根據致病菌的藥敏特性有針對性地用藥，避免濫用藥物，減少致病菌耐藥性的產生，有利于減少魚類體內的藥物殘留，維持水產養(yǎng)殖的可持續(xù)健康發(fā)展。本研究能為河南省內的水產養(yǎng)殖者，特別是缺乏細菌藥敏檢測條件的養(yǎng)殖地區(qū)合理使用抗菌藥物提供參考，在選擇用藥時，恩諾沙星、氟苯尼考、鹽酸多西環(huán)素、硫酸新霉素等為首選抗菌藥物，盡量不要選擇磺胺類藥物。有檢測條件的地區(qū)還是應該進行細菌藥敏檢測，根據檢測結果再選擇合適的藥物，確保藥物的使用合理有效。

3.3 結論

河南省沿黃河水產養(yǎng)殖區(qū)氣單胞菌耐藥率整體水平已經較高，尤其是對磺胺類、甲砜霉素、氟苯尼考等常用藥物的耐藥性，已經成為水產養(yǎng)殖病害防治過程中需要重點注意的問題。應繼續(xù)進行水產養(yǎng)殖病原菌耐藥性檢測，指導養(yǎng)殖者用藥，倡導生態(tài)養(yǎng)殖，減少抗菌藥物的濫用和過度使用，保證科學合理的臨床用藥及水產品質量安全。