趙 歡，龐義存*，趙 郡，邢慧敏，馬曉琳，霍翠敏

(1.河北醫(yī)科大學第三醫(yī)院婦產(chǎn)科，河北 石家莊 050051;2.河北省石家莊婦幼保健院產(chǎn)七科，河北 石家莊 050006；3.河北省第八人民醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050024)

卵巢癌是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一，卵巢癌具有早期癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)晚，確診時多為中晚期，治療效果不佳，五年生存率低，預后差等特點[1]。尤其耐藥及復發(fā)率高這兩個問題一直以來是卵巢癌診治方面面臨的一大課題。研究表明，卵巢癌的發(fā)病、轉移、耐藥、復發(fā)等機制是一個多因素參與的復雜過程[2]。鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase 1，SPHK1)是調(diào)控細胞內(nèi)鞘脂類分子代謝的關鍵限速酶，位于細胞質，它可以催化細胞內(nèi)鞘脂類分子代謝，生成1-磷酸鞘氨醇(sphingosine1-phosphate，S1P)[3]。S1P可與細胞內(nèi)的靶分子結合，還可以與相關轉運體蛋白特異性結合運輸至細胞外間隙，即腫瘤微環(huán)境，再與S1P受體(sphingosine1-phosphate receptors，S1PRs)特異性結合，以自分泌或旁分泌的形式促進細胞的活化、增殖和遷移，并抑制其凋亡[3-7]。國內(nèi)外的研究表明，SPHK1在結直腸癌、膀胱癌、甲狀腺癌等惡性實體腫瘤中高表達，其表達的增高意味著腫瘤惡性程度增高和患者預后不良。SPHK1基因參與腫瘤的多種惡性生物學行為，與腫瘤干細胞的形成有關，影響腫瘤耐藥性[3-7]。關于SPHK1在上皮性卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展、轉移、耐藥中作用方面的研究尚較少。NANOG是一個多能潛化因子，據(jù)報道，在一些腫瘤中，NANOG陽性的細胞具有很強大分化潛能、自我更新能力以及更強的化療耐藥性[8-12]。NANOG在一些腫瘤當中被認為是腫瘤干細胞標記物。本研究旨在通過體外實驗，探討SPHK1對上皮性卵巢癌細胞生物學行為改變的作用及其相關機制，通過本研究，可為臨床工作中上皮性卵巢癌的早期診斷、耐藥治療、靶向治療等提供新的依據(jù)。

1 材 料 與 方 法

1.1材料及主要試劑 SKOV3，人卵巢漿液性囊腺癌(購自中科院上海細胞庫)，選用10%FBS RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。BCA蛋白濃度測定試劑盒(Pierce公司，美國)，Pierce ECL化學發(fā)光試劑盒(Thermo Fisher Scientific公司，美國)，SYBRPremix Ex Taq Ⅱ(Takara公司)，LipofectamineTM2000(Invitrogen公司，美國)，Matrigel膠(BD公司，美國)，SPHK1兔抗人單克隆抗體(武漢三鷹)，NANOG兔抗人單克隆抗體(Abcam公司，美國)，E-cadherin兔抗人單克隆抗體(Abcam公司，美國)，β-actin 鼠抗人多克隆抗體(Servicebio公司，武漢)。引物由上海生工公司合成。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及siRNA轉染 SKOV3細胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基中(含鏈霉素100 mg/L、青霉素100 U/mL和10% 胎牛血清)，置于含5% CO2的培養(yǎng)箱中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。取對數(shù)生長期的貼壁生長細胞，常規(guī)0.25%胰蛋白酶+ 0.02% 乙二胺四乙酸消化后可傳代，或收取細胞進行后續(xù)實驗。

SPHK1 siRNA以及陰性對照siRNA(NC siRNA)購自上海吉瑪公司，序列如下：SPHK1-siRNA,sense：5′-GUGCACCCAAACUACUUCU-TT-3′，antisense：5′-AGAAGUAGUUUGGGUGC-ACTT-3′。NC-siRNA，sense：5′-UUCUCCGAAC-GUGUCACGUTT-3′，antisense：5′-ACGUGACA-CGUUCGGAGAATT-3′。轉染前24 h，制備單細胞懸液并計數(shù)，將細胞鋪入六孔板中，使轉染時細胞匯合度達到60%，第2天進行細胞轉染。細胞分為陰性對照組(NC siRNA)、SPHK1 siRNA轉染組。轉染步驟參考lipofectamineTM 2000的試劑說明進行。轉然后收集細胞用于后續(xù)的研究。

1.2.2CCK8(proliferation assay) 在siRNA轉染SKOV3細胞24 h后,將SKOV3細胞分為2組: SPHK1 siRNA組、NC組。分別將2組細胞制成細胞懸液,并將細胞接種于96孔板中(單位劑量為3×103個/孔),設置3個復孔;分別培養(yǎng)24、48 h后,加入10 μL/孔的CCK試劑(終劑量為5 g/L),避光培養(yǎng)4 h，使用多功能酶標儀來檢測450 nm波長處的各孔的吸亮度(optical density，OD)值。

1.2.3順鉑對SKOV3細胞的最大半數(shù)抑制濃度(IC50)測定 為了檢測DDP對SKOV3細胞增殖的影響,再分別將SPHK1 siRNA組、NC組兩組的對數(shù)生長期細胞消化制備成細胞懸液,按照3×103個/孔的單位劑量接種于96孔板,設置5個復孔。待細胞貼壁后,各組分別加入(0.8、1.5、2、3、4)mg/L的DDP作用24、48、72 h后,吸去培養(yǎng)液,更換為無血清培養(yǎng)基，加入10 μL/孔的CCK8試劑(終劑量為5 g/L),避光培養(yǎng)4 h。按上述方法再次計算SKOV3細胞在不同劑量DDP的作用下的存活率,應用SPSS20.0軟件計算DDP的IC50值。

1.2.4平板克隆形成實驗 細胞轉染后24 h，1.5 mL胰蛋白酶消化，加入10%FBS完全培養(yǎng)基制作單細胞懸液。將NC siRNA組以及SPHK1 siRNA組細胞均勻接種于6孔板，每孔1 000個細胞，每組設定3個復孔。以上細胞放置于含5% CO2的細胞培養(yǎng)箱，37 ℃恒溫培養(yǎng)14 d，每日觀察細胞生長情況，間隔2～3 d細胞換液。終止培養(yǎng)后，甲醛2 mL固定細胞30 min，PBS清洗2遍后，加適量10% Giemsa染色15 min，空氣干燥。細胞團中細胞數(shù)≥50個判定為克隆形成，通過光學顯微鏡觀察和肉眼計數(shù)計算細胞克隆形成情況，依照公式(克隆形成率=克隆數(shù)/接種細胞數(shù)×100%)計算細胞克隆形成率。

1.2.5Western blot 根據(jù)測定的蛋白樣品的實際濃度，計算不同組別樣品的上樣體積，加入5×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)上樣緩沖液，98 ℃水浴15 min后置于冰中。SDS-PAGE電泳分離上樣蛋白質，在凝膠上鋪PVDF膜，并放于兩層濾紙之間，行印跡電泳(恒流200 mA，90 min)蛋白轉膜。TBST漂洗PVDF膜(10 min)，置于5%封閉液中37 ℃恒溫2 h。棄封閉液，加1∶500一抗，4 ℃恒溫過夜。TBST洗膜3次，加過氧化物酶標記的二抗1 mL，37 ℃恒溫作用1.5 h，TBST洗膜10 min 3次。PVDF膜加入等體積的均勻混合的化學發(fā)光試劑A和B，作用1 min(暗室環(huán)境)，Epson V300 Photo凝膠成像系統(tǒng)顯色，AlphaEaseFC 4.0軟件分析條帶灰度，應用以下公式計算蛋白相對表達量：蛋白相對表達量=待檢樣品蛋白的灰度值/內(nèi)參的灰度值。

1.2.6qRT-PCR檢測 常規(guī)提取RNA，并采用分光亮度計測定其濃度及純度，按照說明書步驟應用TAKARA 試劑盒進行逆轉錄為cDNA，按照takara試劑盒說明配置擴增體系。引物序列如下:SPHK1 forward,5′-GTGGTCGCCTTCCGCTTGG-3′，reverse,5′-GCTCCACGCAACCGCTGAC-3′;NANOG forward,5′-GCCTCCAGCAGATGCAA-GAACTC-3′，reverse,5′-CCAGGTCTGGTTGCT-CCACATTG-3′,MDR1 forward,5′-GATTGCT-CACCGCCTGTCCAC-3′，reverse,5′-CGTGCCA-TGCTCCTTGACTC-TG-3′,GADPH forward,5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′，reverse,5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′。基因表達采用2-△△Ct公式計算。

1.3統(tǒng)計學方法 應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。計量資料比較采用t檢驗，應用Probit分析藥物的IC50。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1SPHK1基因轉染效率鑒定 qRT-PCR結果顯示，SKOV3細胞轉染SPHK1 siRNA后，較對照組的mRNA下降約71%(P<0.05)。Western blot檢測結果顯示，SPHK1蛋白的表達在SPHK1 siRNA組較陰性對照組也出現(xiàn)明顯下降(圖1)。上述結果表明所用SPHK1 siRNA序列可以有效干擾SPHK1的表達，陰性序列對SPHK1蛋白表達無明顯影響，因此應用可采用該SPHK1 siRNA及NC siRNA完成后續(xù)試驗。

圖1 siRNA干擾SKOV3細胞中SPHK1基因及蛋白表達

2.2SPHK1對卵巢癌細胞SKOV3增殖能力的影響 CCK8結果表明，在轉染24 h時，SPHK1 siRNA組與NC組的OD值差異無統(tǒng)計學意義(P=0.953)，而在48 h,SPHK1 siRNA組的增殖活力較對照組出現(xiàn)下降,差異有統(tǒng)計學意義(P=0.021)(圖2)。

圖2 SPHK1基因表達對SKOV3細胞增殖能力的影響

2.3SPHK1對順鉑敏感性影響 分別予以不同濃度(0.8、1.5、2、3、4) mg/L的順鉑作用于SKOV3細胞24、48、72 h。不同濃度順鉑作用于兩組細胞后48 h，隨順鉑濃度的增加，對于SKOV3細胞的生長抑制作用逐漸加強，隨著作用時間的延長，同一濃度的順鉑對于細胞生長的抑制作用也逐漸加強，這表明順鉑對于SKOV3細胞的作用呈時間和濃度依賴性。在下調(diào)SPHK1基因表達后，順鉑作用24 h，對SKOV3細胞無明顯抑制作用。在48 h及72 h，SKOV3細胞對同一時間點同一濃度的順鉑敏感性強于NC組，SPHK1 siRNA組細胞在順鉑作用48 h和72 h的IC50低于NC組[48 h：(2.53±0.119) mg/Lvs.(3.82±0.127) mg/L，P=0.007；72 h：(0.74±0.059) mg/Lvs.(1.55±0.050) mg/L，P=0.006],差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖3)。

2.4SPHK1對卵巢癌細胞克隆形成能力的影響 應用siRNA干擾SPHK1表達后，細胞克隆形成率出現(xiàn)下降，由(26.6±1.08)%降至(17.3±1.16)%，差異有統(tǒng)計學意義(圖4)。這表明SPHK1基因下調(diào)會引起SKOV3細胞的克隆形成能力下降(P=0.019)。

圖3 SPHK1基因表達對SKOV3細胞鉑耐藥的影響

2.5SPHK1對相關分子表達的影響 應用siRNA干擾SPHK1表達后，通過qRT-PCR檢測結果顯示，干細胞相關因子NANOG表達下降約30%，(P=0.007)耐藥相關因子MDR1表達下降約52%，差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.014)。同時應用Western blot方法進行相應基因的蛋白表達情況發(fā)現(xiàn)NANOG(P=0.010)、MDR1(P=0.021)的表達隨SPHK1基因的下調(diào)出現(xiàn)下降，這與mRNA的改變是一致的(圖5)。這表明SPHK1基因的下調(diào)可引起干細胞相關因子NANOG及耐藥相關因子MDR1的下降。

3 討 論

上皮性卵巢癌的發(fā)病率雖不是女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤最高者，但其病死率卻居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之首[13-14]，最根本的原因是該類腫瘤具有發(fā)現(xiàn)晚，且易出現(xiàn)化療耐藥及復發(fā)等特點。研究表明，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉移以及耐藥是一個多種因素參與的復雜過程，這些過程中涉及多個信號通路及其相關因子[15]。鞘脂是調(diào)控細胞生物學功能中的一項重要的調(diào)控子，可以調(diào)節(jié)多種生物學如細胞凋亡、細胞增殖、細胞代謝等過程。S1P是鞘脂代謝的最終產(chǎn)物，同樣可參與以上各種細胞過程的調(diào)節(jié)，S1P是一種信號分子，通過細胞內(nèi)外機制發(fā)揮作用[16]。近年來的研究發(fā)現(xiàn)SPHK1在某些腫瘤中表達升高，并且參與腫瘤細胞的形成，但其在上皮性卵巢癌中的相關研究還不多見[17]。

腫瘤干細胞理論認為腫瘤由不同細胞亞群的細胞構成，其中的腫瘤干細胞指的是一小部分特殊類型的細胞亞群，它們具有無限自我更新能力、無限增資能力、多潛能分化能力、較高的致瘤性、對放化療耐受能力強[18-19]。不同種類的腫瘤具有不同的干細胞標記物，目前的研究表明上皮性卵巢癌的干細胞標記物可包括CD44、CD133、ALDH、NANOG等。其中NANOG是一個多能潛化因子，其與腫瘤細胞的自我更新及放化療耐藥密切相關。

卵巢癌化療一線方案是以鉑類為基礎的化療方案[20],研究表明鉑耐藥是多因素、多水平、多基因參與的復雜過程，盡管對腫瘤的耐藥機制的認識在不斷加深，并且隨著化療的規(guī)范，對于藥物的劑量以及應用方案的調(diào)整在隨之不斷進行，但是鉑類藥物耐藥仍不少見[21],為臨床卵巢癌治療效果造成了負面作用。多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR)是晚期上皮性卵巢癌化療失敗的主要原因之一。這種耐藥性與分子活性和藥物泵的表達、腫瘤細胞的異常pH、DNA損傷修復能力、藥物排毒、凋亡途徑以及許多基因的甲基化有關[22-24]。MDR可以降低腫瘤細胞中化療藥物的濃度，從而降低這些腫瘤細胞對藥物的敏感性，在細胞發(fā)生耐藥性后，能夠對不同化學藥物的各種結構無關的機制作出反應并表現(xiàn)出交叉耐藥性，從而導致腫瘤細胞抵抗化療藥物。相關研究發(fā)現(xiàn)耐藥基因MDR1在上皮性卵巢癌中的表達水平明顯高于交界性腺瘤和良性腺瘤，MDR1基因產(chǎn)物P-糖蛋白(MDR1/P-gp)是引起腫瘤細胞發(fā)生多重耐藥的主要機制之一[25]。MDR1/P-gp作為一種主動轉運底物的外排泵，其過度表達可以導致化療藥物從腫瘤細胞中的外排增強，降低腫瘤細胞內(nèi)有效化療藥物的濃度，從而使腫瘤細胞對化療藥物表現(xiàn)出抵抗性。本研究通過siRNA對上皮性卵巢癌細胞SKOV3中的SPHK1基因進行干擾，降低SPHK1基因的表達,對SKOV3細胞的一些細胞功能及相關因子的表達進行了測定。結果表明，SPHK1的降低會導致細胞增殖能力的下降，也會引起腫瘤細胞克隆形成能力的降低。應用CCK8進行細胞增殖能力試驗，反應了細胞的群體增殖能力，而克隆形成實驗，反應的則是獨立細胞的自我更新及增殖能力。本研究還對下調(diào)SPHK1基因后上皮性卵巢癌的鉑耐藥性進行了檢測，結果表明，SPHK1基因的下調(diào)會引起SKOV3細胞對鉑類藥物的敏感性增加。除此之外，對SPHK1基因下調(diào)后腫瘤干細胞標記物NANOG以及多重耐藥基因MDR1基因及蛋白的表達情況進行了檢測，試圖初步探討其內(nèi)在機制。結果表明下調(diào)SPHK1基因的表達會引起腫瘤干細胞標記物NANOG以及多重耐藥基因MDR1的表達降低。本研究結果表明，SPHK1基因對于上皮性卵巢癌的惡性生物學行為起到促進作用，其可能通過調(diào)節(jié)腫瘤干細胞的形成以及通過作用于多重耐藥基因而實現(xiàn)的，SPHK1可能成為上皮性卵巢癌發(fā)展及鉑耐藥的一個預測因子，也可能作為上皮性卵巢癌治療及鉑耐藥逆轉的一個新的靶點。

本研究對SPHK1與卵巢癌細胞的增殖性、克隆形成能力及耐藥性之間的關系及其內(nèi)在可能存在的機制進行了初步的探討，但是尚有許多不足之處，如：SPHK1基因與上皮性卵巢癌的侵襲性、遷移性等其他生物學行為的關系尚未進行探討；SPHK1基因與腫瘤的關系有待更多的組織學研究以及體內(nèi)實驗研究；SPHK1基因是如何影響上皮性卵巢癌腫瘤干細胞形成的，尚需進一步探索。