孫 婷，張 磊

［中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液學(xué)研究所），實(shí)驗(yàn)血液學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，細(xì)胞生態(tài)海河實(shí)驗(yàn)室，天津市血液病基因治療研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病基因治療重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院干細(xì)胞醫(yī)學(xué)中心，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)系，天津，300020；

1 研究背景

血友病B 是由于編碼凝血因子9（FⅨ）的基因突變導(dǎo)致FⅨ缺少而引起的一種單基因遺傳病，主要表現(xiàn)為全身各部位的自發(fā)性出血或損傷后出血不止。 根據(jù)患者血液中缺少的凝血因子的活性可以分為輕度（5%～40%）、中度（1%～5%）、重度（＜1%）。血友病的治療在過去幾十年經(jīng)歷了從全血、血漿到重組凝血因子替代治療的發(fā)展。 當(dāng)前無抑制物的血友病B 患者的標(biāo)準(zhǔn)治療方式為定期規(guī)律性替代治療（即預(yù)防治療），但需終生頻繁輸注，為患者帶來沉重負(fù)擔(dān)［1］。 基因治療是基于血友病發(fā)病機(jī)制而產(chǎn)生的一種新型治療方法，通過基因治療有可能實(shí)現(xiàn)單次輸注、快速平穩(wěn)持久提升凝血因子活性的目標(biāo)，為患者帶來巨大臨床獲益。

基因治療一般分為兩種：一種是通過基因編輯技術(shù)對(duì)缺陷基因本身直接進(jìn)行原位校正，另一種是通過轉(zhuǎn)運(yùn)載體將具有正常功能的基因拷貝引入受體細(xì)胞，以補(bǔ)償或補(bǔ)充突變基因。 腺相關(guān)病毒（adenoassociated virus，AAV）具有低整合能力、低免疫源性和高組織向性的特征，能夠在不整合進(jìn)入宿主細(xì)胞基因組的情況下在特定組織中特異性高表達(dá)目標(biāo)蛋白，是血友病基因治療的理想載體。 2003 年和2006年Manno 等分別發(fā)表了第1 例肌肉注射AAV 治療血友病B 和第1 例靜脈輸注AAV 治療血友病B 的臨床研究，證明了AAV 載體的安全性并實(shí)現(xiàn)了外源性FⅨ的體內(nèi)表達(dá)［2-3］。 2011 年首次通過靜脈注射肝臟靶向AAV 載體治療血友病B 的Ⅰ期臨床試驗(yàn)取得良好預(yù)期療效［4］，長期隨訪療效顯著，安全性高［5］。 2017 年優(yōu)化載體血友病B 患者基因治療中等劑量注射即可取得穩(wěn)定的FⅨ表達(dá)，且無嚴(yán)重不良事件發(fā)生［6］。 但是，2021 年發(fā)表在blood 上的一項(xiàng)旨在研究BAX335 治療血友病B 療效的研究中僅1／8 例入組患者獲得持續(xù)表達(dá)，推測可能是由于CpG 序列引起的免疫反應(yīng)所造成了轉(zhuǎn)基因表達(dá)的喪失［7］。 我國在血友病基因治療領(lǐng)域也進(jìn)行了長期、深入的探究：血友病B 臨床試驗(yàn)最早由復(fù)旦大學(xué)的薛京倫教授團(tuán)隊(duì)發(fā)起，其后中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院的楊仁池教授團(tuán)隊(duì)進(jìn)行了肌肉注射血友病B基因治療的研究，湖南大學(xué)的陳方平教授嘗試灌腸給藥的方式進(jìn)行血友病B 基因治療。 目前已有多項(xiàng)中國血友病基因治療研究在ClinicalTrials 注冊(cè)。

雖然關(guān)于血友病B 基因治療已取得了階段性的成果，但該方法仍面臨許多亟待解決的問題。 病毒感染的肝細(xì)胞引起細(xì)胞免疫，導(dǎo)致無癥狀的轉(zhuǎn)氨酶升高，通常與FⅨ表達(dá)下降甚至完全喪失有關(guān)。本研究使用的載體BBM-H901 采用了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的AAV843 血清型衣殼，具有強(qiáng)肝臟靶向性和低中和抗體分布的特征，能夠特異性高效感染人肝臟細(xì)胞。 此外，BBM-H901 載體所攜帶的表達(dá)元件含有LXP2.1 肝特異性啟動(dòng)子，能夠顯著提高外源基因在肝臟的表達(dá)，允許以更低的載體劑量進(jìn)行輸注，減少載體相關(guān)副作用，并且本研究中肝臟靶向AAV 攜帶的FⅨ基因具有低CpG 含量，能夠降低免疫反應(yīng)。 既往的臨床試驗(yàn)常采用載體輸注后使用以糖皮質(zhì)激素為主的免疫抑制藥物來抑制AAV 衣殼誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)所引起的基因表達(dá)下降或喪失，但是這種方法療效并不肯定［6-8］。 本研究開創(chuàng)性地采用了在AAV 載體輸注前預(yù)防性使用糖皮質(zhì)激素的方案，以期獲得更加平穩(wěn)持久的因子活性和臨床療效。 在臨床前研究中，給FⅨ敲除的血友病B 小鼠靜脈注射BBM-H901，1 周后FⅨ活性顯著升高至97.4%（5.0×1011vg／kg）和338.96（1.0×1012vg／kg），因子活性維持至實(shí)驗(yàn)觀察終點(diǎn)（28 周）。 在臨床前研究的基礎(chǔ)上，我們使用BBM-H901 開展了此項(xiàng)血友病B 基因治療的Ⅰ期臨床試驗(yàn)。

2 研究概述

2.1 研究方案 本研究是一項(xiàng)預(yù)防性使用糖皮質(zhì)激素的肝臟靶向AAV 治療血友病B 的單中心、單臂、Ⅰ期、前瞻性臨床試驗(yàn)，共納入10 例FⅨ活性≤2%且AAV843 中和抗體滴度＜1 ∶5 的成年男性血友病B 患者。 載體輸注前預(yù)防性使用糖皮質(zhì)激素，載體輸注后觀察隨訪52 周（主觀察期），后進(jìn)行長期擴(kuò)展隨訪。 主要終點(diǎn)為安全性和耐受性終點(diǎn)，次要終點(diǎn)為AAV 載體BBM-H901 的動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)，并采用單細(xì)胞測序?qū)κ茉囌卟煌瑫r(shí)間點(diǎn)的免疫狀態(tài)進(jìn)行實(shí)時(shí)追蹤檢測。 （圖1）。

圖1 研究流程簡圖

2.1.1 BBM-H901 可快速持久平穩(wěn)提升FⅨ活性，且無嚴(yán)重不良反應(yīng) 10 例受試者累計(jì)隨訪達(dá)705周，無嚴(yán)重不良事件和FⅨ抑制物報(bào)告。 靜脈注射BBM-H901 后24 小時(shí)內(nèi)，載體DNA 在受試者血清中快速減少至少3 logs（圖2C）。 載體DNA 在血漿和唾液中檢測陰性的時(shí)間點(diǎn)為BBM-H901 注射后28 天，在精液中檢測陰性的時(shí)間點(diǎn)為56 天。 在第0天（d0）和整個(gè)隨訪期的尿液標(biāo)本中均未檢測到載體DNA。

BBM-H901 注射后1 天即可檢測到載體衍生的FⅨ表達(dá)，注射后1 周，載體衍生FⅨ：C 迅速達(dá)到平均57.1 IU／dL（SD 20.2）（圖2B），截止至中位隨訪時(shí)間58 周，F(xiàn)Ⅸ：C 平均值＞36.9 IU／dL （SD 20.5）（圖2A）。 整個(gè)隨訪期，4 例受試者凝血因子活性穩(wěn)定，4 例凝血因子活性維持在正常水平，2 例轉(zhuǎn)氨酶有所升高的受試者凝血因子活性有所下降。 受試者靶關(guān)節(jié)的中位數(shù)、年化出血率以及FⅨ濃縮物輸注量在基因治療后均明顯下降，臨床療效顯著（圖2D、2E、2F）。 同時(shí)，本研究提示，轉(zhuǎn)氨酶曲線下面積與療效相關(guān)。

圖2 基因治療前后的因子活性、載體脫落和臨床參數(shù)

2.1.2 單細(xì)胞測序揭示預(yù)防性使用糖皮質(zhì)激素可減輕BBM-H901 引起的免疫反應(yīng) 本研究在強(qiáng)的松前（d-7）、輸注載體前（d0）、輸注載體后7 天（d7）、強(qiáng)的松停藥后14 天（stopGC）的時(shí)間點(diǎn)對(duì)受試者的血液樣本進(jìn)行了單細(xì)胞RNA 測序，擬通過分析療效滿意組（SE：FⅨ：C＞40 IU／dL）和療效欠佳組（IE：FⅨ：C＜40 IU／dL）患者激素使用和基因治療前后的免疫狀態(tài)，從單細(xì)胞層面發(fā)現(xiàn)對(duì)提高基因治療安全性和獲得更加持久穩(wěn)定因子活性有指導(dǎo)意義的信息。 單細(xì)胞測序發(fā)現(xiàn)療效欠佳組患者的細(xì)胞免疫水平顯著增高，而本研究開創(chuàng)性地使用糖皮質(zhì)激素預(yù)防性治療，可以明顯下調(diào)細(xì)胞毒T 細(xì)胞的比例，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T 細(xì)胞（Treg）活化，顯著抑制抗原遞呈細(xì)胞（APC）的功能。

2.2 研究意義

本研究評(píng)估了肝臟靶向AAV 載體BBM-H901在中國血友病B 患者基因治療中的安全性和有效性。 整個(gè)研究期內(nèi)無3 至4 級(jí)不良反應(yīng)事件發(fā)生，2例受試者發(fā)生可能與載體BBM-H901 相關(guān)的不良事件（2 級(jí)發(fā)熱和轉(zhuǎn)氨酶升高），在積極干預(yù)后好轉(zhuǎn)。和既往的研究相似，所有受試者均產(chǎn)生了針對(duì)載體衣殼的高滴度結(jié)合抗體和中和抗體，這意味著每個(gè)參與者只有一次接受基于AAV 的基因治療的機(jī)會(huì)，除非新型的AAV 衣殼與已使用的血清型沒有交叉反應(yīng)，或?qū)砟苎邪l(fā)出其他有效的干預(yù)措施。 本研究中的10 例中國血友病B 患者輸注BBM-H901 后均無FⅨ抑制物產(chǎn)生，這也是基因治療的一項(xiàng)重要安全性特征。

盡管之前的許多肝臟靶向血友病基因治療也成功實(shí)現(xiàn)了載體來源的FⅨ表達(dá)并有效減少了患者的出血和血制品輸注，但是載體病毒感染的肝臟細(xì)胞引起的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)所導(dǎo)致的安全性問題和因子表達(dá)減低甚至喪失仍是基因治療所面臨的一大挑戰(zhàn)。 基因序列中CpG 含量過高可能會(huì)誘發(fā)免疫反應(yīng)［7］，本研究所采用的基因表達(dá)盒具有低CpG 特征，能夠有效減低免疫反應(yīng)。 既往的研究均在載體輸注后使用免疫抑制劑（主要是糖皮質(zhì)激素）預(yù)防或治療免疫反應(yīng)所引起的轉(zhuǎn)氨酶升高和因子活性下降，但并不完全有效。 本研究首次在載體輸注前預(yù)防性使用糖皮質(zhì)激素，并通過臨床參數(shù)檢測和探索性的單細(xì)胞數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，預(yù)防性使用糖皮質(zhì)激素可以有效抑制基因治療所引起的T 細(xì)胞免疫反應(yīng)及其與APCs 之間的細(xì)胞通訊，有利于獲得更加持久平穩(wěn)的因子活性。 本研究也觀察到一些與糖皮質(zhì)激素預(yù)防相關(guān)的不良事件，但所有不良事件均為1級(jí)或2 級(jí)，比較輕微。 因此，這種載體輸注前短期預(yù)防性使用糖皮質(zhì)激素的潛在價(jià)值需要進(jìn)一步探索。

與其他B 型血友病基因治療試驗(yàn)相比，本研究中載體基因表達(dá)速度更快［4，6，7，9］，載體輸注后1 天內(nèi)即觀察到載體基因表達(dá)，并在1 周內(nèi)快速達(dá)到峰值。 并且本研究在AAV 輸注后1 年實(shí)現(xiàn)了FⅨ：C持久穩(wěn)定的高水平表達(dá)，7 例受試者的FⅨ：C 大于30 IU／dL，4 例患者的FⅨ：C 大于50 IU／dL 或更高。持久而穩(wěn)定的高FⅨ：C 能夠有效預(yù)防出血、改善靶關(guān)節(jié)和減低外源性FⅨ產(chǎn)品注射需求，受試者臨床獲益顯著。 但是由于本研究的時(shí)間周期相對(duì)較短，這樣一個(gè)相對(duì)較短的時(shí)間內(nèi)無法清楚地觀察到關(guān)節(jié)病變或假腫瘤等臨床參數(shù)的改善，因此仍需在未來數(shù)年進(jìn)行長期監(jiān)測以評(píng)估載體基因持續(xù)表達(dá)時(shí)間和臨床獲益。 此外該研究為單中心研究，未來需要開展納入更多患者的多中心研究以全面評(píng)估該療法的安全性和有效性。

綜上，該研究是中國首個(gè)肝臟靶向AAV 血友病B 基因治療臨床試驗(yàn)，也是亞洲首個(gè)基因治療藥物的臨床研究成果，證實(shí)BBM-H901 在中國血友病B患者中是安全的，并且能夠有效表達(dá)載體基因，提高患者體內(nèi)載體來源FⅨ活性。 我們探索性的單細(xì)胞RNA 測序分析也表明，預(yù)防性使用糖皮質(zhì)激素降低了接受基因治療的血友病B 患者體內(nèi)APCs、CD4+T細(xì)胞和CD8+T 細(xì)胞的基線數(shù)量，并促進(jìn)了Treg 激活。 因此，這種預(yù)防性給予糖皮質(zhì)激素的方案也可能有助于減弱其他血友病基因治療患者的免疫反應(yīng)，提高基因治療的安全性和保障載體來源凝血因子的表達(dá)活性。

作者貢獻(xiàn)聲明孫婷負(fù)責(zé)撰寫文章，張磊負(fù)責(zé)修改文章語言并監(jiān)督此項(xiàng)目

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