何元?jiǎng)P

文山州食品藥品檢驗(yàn)研究院，云南 文山 663099

丹參益心膠囊的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)為國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS-10732(ZD-0732)-2002-2012Z，由三七、燈盞細(xì)辛、回心草、紫丹參、制何首烏、延胡索等六味藥材經(jīng)提取制成的復(fù)方制劑。具有活血化瘀，通絡(luò)止痛，用于瘀血阻滯所致冠心病、心絞痛[1]。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中含量測(cè)定項(xiàng)以人參皂苷Rg1的含量作為控制指標(biāo)，每粒含三七以人參皂苷Rg1計(jì)，不得少于4.5 mg。

三七為五加科植物三七Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根莖，主含人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2和三七皂苷R1、R4等20余種皂苷成分，其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1是含量最高的成分，三七皂苷R1又是三七的特征成分。文獻(xiàn)報(bào)道[2-7]多采用HPLC法測(cè)定其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1的含量。本文采用HPLC法同時(shí)測(cè)定丹參益心膠囊中的三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1三者的總量，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該方法精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性均能滿足要求。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津2010系列高效液相色譜儀，包括控制器SCI-10Avp、檢測(cè)器SPD-10Avp、泵LC-10Avp、梯度單元FCV-10Avp、柱溫箱CTO-10ASvp。

1.2 材料 三七皂苷R1(批號(hào)：110745-201921)、人參皂苷Rg1(批號(hào)：110703-201933)、人參皂苷Rb1(批號(hào)：110704-202028)均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院。水為重蒸餾水，乙腈、甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純。丹參益心膠囊(云南特安吶制藥股份有限公司產(chǎn)品，批號(hào)詳見(jiàn)表7)。

2 方法

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取對(duì)照品三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1適量，加甲醇定容，制成含三七皂苷R10.2 mg/mL、人參皂苷Rg10.5 mg/mL、人參皂苷Rb10.4 mg/mL的混合溶液，搖勻，既得。

2.2 供試品的制備 取裝量差異項(xiàng)下的本品內(nèi)容物，混勻，研細(xì)，取1g，精密稱定，置錐形瓶中，加入甲醇30 mL，超聲處理(功率250 W，頻率 33 kHz)30 min，放冷，濾過(guò)，并用適量甲醇洗滌濾紙，收集濾液，水浴蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，用水飽和的正丁醇振搖提取4次，每次20 mL,合并正丁醇提取液，用正丁醇飽和的氨試液振搖洗滌兩次，每次25 mL,棄去氨液，正丁醇液用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次20 mL,棄去水液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状际谷芙獠⑥D(zhuǎn)移至25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 取不含三七的供試品(即空白樣品，按丹參益心膠囊制法制備的不含三七樣品，由云南特安吶制藥股份有限公司提供)。再按上述供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.4 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)[8]色譜柱：Kromasil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測(cè)波長(zhǎng)：203 nm；流動(dòng)相：乙腈(A)-水(B)梯度洗脫(表1)；流速：1 mL/min；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。以分離度、峰的對(duì)稱性、保留時(shí)間等為評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果表明，在此條件下，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1三者之間及與其他組分能較好地分離。如圖1、圖2所示。

3 含量測(cè)定

3.1 專屬性試驗(yàn) 分別精密吸取混合對(duì)照品溶液、陰性對(duì)照溶液各20 μL，進(jìn)樣，記錄色譜圖(如圖1、圖3所示)。在該色譜條件下的分離效果較好，陰性樣品在于對(duì)照品出峰相應(yīng)的保留時(shí)間處未見(jiàn)明顯色譜峰，表明本品中三七以外的其他成分對(duì)三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1的測(cè)定無(wú)干擾。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫表

1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1

1.三七皂苷R1；2.人參皂苷Rg1；3.人參皂苷Rb1

圖3 陰性對(duì)照溶液HPLC圖譜

3.2 線性關(guān)系考察 精密吸取上述取混合對(duì)照品溶液0.25 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、4 mL、8 mL、10 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。分別精密吸取上述供試品試液各20 μL，進(jìn)樣，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為X軸，以峰面積(萬(wàn))為Y軸，進(jìn)行線性回歸計(jì)算。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1相關(guān)系數(shù)分別為0.9999、0.9999、0.9999，線性范圍分別為0.10～4.0 μg、0.25～10.0 μg、0.20～8.0 μg。見(jiàn)表2。

表2 線性試驗(yàn)結(jié)果表

3.3 精密度試驗(yàn) 取同一濃度對(duì)照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，每次20 μL，測(cè)定其峰面積，結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1峰面積的RSD分別為1.2%、0.8%、0.8%(n=5)。見(jiàn)表3。

表3 精密度試驗(yàn)表

3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批供試品，照研究所得方法重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算粒含量。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1含量的平均值分別為3.69 mg/g、15.41 mg/g、10.00 mg/g，RSD分別為2.6%、1.4%、2.3%(n=5)。見(jiàn)表4。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)表

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一濃度供試品溶液，分別于0 h、1 h、2 h、4 h、6 h、8 h進(jìn)樣，測(cè)定其峰面積。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1峰面積的平均值分別為1116762、6538092、2538085，RSD分別為1.9%、1.6%、1.9%(n=5)。供試品溶液在8 h內(nèi)基本穩(wěn)定。見(jiàn)表5。

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

3.6 加樣回收試驗(yàn) 稱取已知含量的本品粉末6份，每份0.8 g，置錐形瓶，分別加入混合對(duì)照品溶液(含三七皂苷R1為1.23 mg/mL、人參皂苷Rg1為3.02 mg/mL、人參皂苷Rb1為2.85 mg/mL)1 mL，照供試品溶液制備方法，至“加甲醇30 mL……”起，同法操作。精密吸取供試品溶液20 μL,測(cè)定峰面積值，計(jì)算回收率。結(jié)果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Rb1的回收率分別為99.7%、99.8%、97.6%，RSD分別為1.6%、1.1%、1.1%(n=6)。見(jiàn)表6。

表6 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

表6(續(xù))

3.6樣品測(cè)定 取裝量差異相下本品，照供試品溶液配制方法，測(cè)定了10批丹參益心膠囊產(chǎn)品，并計(jì)算三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、和人參皂苷Rb1總含量。結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 樣品測(cè)定表

4 討論

4.1 HPLC法測(cè)定 三七中皂苷類成分含量的報(bào)道較多，本研究建立的方法前處理甲醇超聲提取即可，操作簡(jiǎn)單；通過(guò)方法學(xué)考察，本法準(zhǔn)確、易重現(xiàn)、可操作性強(qiáng)；在方法學(xué)考察的基礎(chǔ)上，共測(cè)定了10批樣品，測(cè)定結(jié)果具有一定的代表性。

4.2 含量限度的擬定 《中國(guó)藥典》2020年版一部中“三七”含量測(cè)定項(xiàng)下按干燥品計(jì)算，含人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1及三七皂苷R1的總量不得少于5.0%。根據(jù)其含量限度，并扣除水分計(jì)算，本品規(guī)格0.4 g/粒，以處方中1000粒投料三七1250 g，以轉(zhuǎn)移率90%計(jì)算，丹參益心膠囊中3種皂苷的總量應(yīng)不得少于22.5 mg/g。現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅以人參皂苷Rg1含量作為限度，不能有效控制其產(chǎn)品質(zhì)量。該方法以3種皂苷的總量作為丹參益心膠囊的含量測(cè)定方法，有利于產(chǎn)品質(zhì)量的控制。