趙玉琪, 周志林, 唐 君, 姚改芳, 胡康棣, 張 華

(1.合肥工業(yè)大學 食品與生物工程學院,安徽 合肥 230601; 2.江蘇徐淮地區(qū)徐州農業(yè)科學研究所,江蘇 徐州 221131)

0 引 言

絲氨酸羥甲基轉移酶(serine hydroxymethyltransferase,SHMT)是一種保守的磷酸吡哆醛依賴性酶[1],可以催化絲氨酸與甘氨酸之間的可逆轉換(絲氨酸+亞甲基四氫葉酸→甘氨酸+N5,N10-亞甲基四氫葉酸+水)[2],這一反應過程提供了一碳單位,而一碳單位是甲基生物合成、核苷酸生物合成以及葉酸和氨基酸代謝所必需的[3-4]。研究表明,SHMT參與植物生長發(fā)育以及脅迫的抗性響應,對高等植物的一碳代謝、光呼吸和氧化還原動態(tài)平衡也很重要[5-6]。例如,擬南芥中的一個SHMT基因突變導致植株在CO2環(huán)境下生長時表現出致死的光呼吸表型[7]。通過對水稻進行轉錄組分析,發(fā)現鹽脅迫條件下的SHMT3基因表達增強,同時,過量表達水稻SHMT3(OsSHMT3)的擬南芥轉基因植株表現出對鹽脅迫的耐受性,表明OsSHMT3在提高植物對鹽脅迫的耐受性中的關鍵作用[1]。此外,在高溫脅迫條件下,2個壇紫菜SHMT(PhSHMT)基因均表現為先上調后下調再上調的趨勢,表明SHMT基因可能在壇紫菜應答高溫脅迫過程中發(fā)揮作用[8]。同時,大豆SHMT基因的一個隱性突變可引起細胞死亡,在多種脅迫條件下導致萎黃和壞死組織的形成[9]。強光、鹽、干旱等非生物脅迫加重擬南芥atshm1、水稻osshm1突變體缺陷表型,深入研究顯示SHMT可以降低非生物脅迫導致的植物細胞內活性氧的水平,減輕了細胞內氧化損傷[10]。水稻中過表達OsSHMT1的植株表現出更高的光合效率和更高的生產力[11]。另外,SHMT可作為除草劑作用的新靶點,當編碼含有SHMT肽段的核苷酸序列缺失的植物會表現出生長遲緩或葉片萎黃[12]。此外,植物中SHMT活性已在不同的細胞器中檢測到,表明其在不同代謝途徑中發(fā)揮著廣泛的作用[13]。研究表明,豌豆和大麥的葉綠體中檢測到SHMT活性,開花植物中都存在質體定位的SHMT。擬南芥有7個編碼SHMT蛋白的基因,它們編碼的蛋白具有廣泛的亞細胞定位,AtSHM1～5的定位已確定,而AtSHM6和AtSHM7基因則需要進一步的證實[14]。研究發(fā)現,小麥幼葉中的所有SHMT活性都位于線粒體基質[15],OsSHM1蛋白定位于線粒體[5]。鑒于SHMT蛋白家族保守的生物學功能,系統(tǒng)研究植物中SHMT基因家族功能,對產酶相關化合物的代謝功能和對該基因的基因工程應用具有重要意義。

甘薯是一種具有復雜遺傳基礎的異源六倍體植物,由于缺乏系統(tǒng)的基因組信息以及遺傳資源的匱乏,導致甘薯復雜性狀的分子機制研究較為滯后。隨著栽培甘薯的2個二倍體野生近緣種基因組序列的完成,甘薯的分子生物學研究大大加快[16]。擬南芥是一種研究植物生理與分子生物學的模式植物,而番茄是研究果實發(fā)育的重要植物。SHMT作為一類非常重要而且保守的蛋白,該家族在甘薯潛在的功能尚不清楚。因此,本文通過蛋白同源檢索,對甘薯、番茄、擬南芥中的SHMT蛋白家族進行進化樹分析、motif分析、蛋白結構域分析、蛋白高級結構分析等,并對蛋白的理化性質及潛在的亞細胞定位進行分析,進一步驗證了這一蛋白家族在進化上的保守性,隨后通過數據挖掘,分析了番茄中SHMT基因家族在不同組織及果實發(fā)育不同階段的表達水平變化,此外,對模式植物擬南芥SHMT家族在不同脅迫下的應答進行分析,發(fā)現AtSHMT在響應脅迫中可能發(fā)揮作用。因此,本文通過多種生物信息學分析以及數據挖掘,為甘薯中SHMT基因家族功能的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 SHMT家族系統(tǒng)進化樹分析

利用擬南芥中已經報道SHMT家族成員AtMSA1(At1g36370)的蛋白序列,通過BLAST工具從phytozome在線網站下載擬南芥和番茄中的14條SHMT蛋白序列,其中擬南芥、番茄中各7條,利用Sweetpotato Genomics Resource網站檢索甘薯蛋白數據庫獲得7個潛在的SHMT蛋白序列。利用MEGA7.0軟件使用Neighbor-Joining法構建SHMT基因系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2 SHMT家族motif、結構及理化性質分析

利用MEME網站對甘薯、番茄、擬南芥SHMT蛋白序列進行motif分析。利用SMART網站對甘薯、番茄、擬南芥SHMT蛋白進行結構域分析。利用GSDS 2.0網站,將番茄、擬南芥、甘薯SHMT基因家族的cDNA序列與基因組DNA序列導入,分析SHMT基因家族的外顯子和內含子結構。利用EXPASY網站獲取甘薯、番茄、擬南芥21個SHMT蛋白的序列長度、等電點、分子量等理化參數。

1.3 SHMT蛋白家族定位和結構預測

利用NLS Mapper網站預測蛋白的核定位信號,隨后通過WoLF PSORT網站進一步預測21個SHMT蛋白的亞細胞定位。

利用甘薯、番茄、擬南芥SHMT蛋白家族序列,通過SOPMA和SWISS在線工具,對蛋白的二級結構和三級結構進行預測分析。

1.4 番茄中SHMT基因表達量

利用Solanaceae Genomics Network網站對番茄中的SHMT基因在番茄Micro Tom品種中不同組織和果實發(fā)育不同階段的基因表達進行數據挖掘,并利用基迪奧網站進行熱圖繪制。

1.5 AtSHMT基因在脅迫條件下的表達分析

利用網站Eplant對擬南芥中SHMT基因在脅迫條件下表達水平進行分析,脅迫條件包括冷害脅迫(4 ℃)、鹽脅迫(150 mmol/L NaCl)、熱脅迫(38 ℃下處理3 h,隨后在25 ℃恢復),并預測基因的潛在功能。

2 結果與分析

2.1 SHMT家族系統(tǒng)進化樹分析

將甘薯SHMT(itfSHMT)、番茄SHMT(SlSHMT)、擬南芥SHMT共21條SHMT蛋白序列利用MEGA7.0 軟件構建系統(tǒng)發(fā)育樹,結果如圖1所示,從圖1可以看出,21個SHMT蛋白在進化樹上形成4個分支,其中itfSHMT1、itfSHMT2、SlSHMT1、AtSHMT1、AtSHMT2、itfSHMT3、SlSHMT2在同一個分支上,說明這7個SHMT基因親緣性較高;AtSHMT3、itfSHMT4、SlSHMT3、SlSHMT4在同一個分支上;AtSHMT4、AtSHMT5、SlSHMT5、itfSHMT5在同一個分支上;AtSHMT6、AtSHMT7、SlSHMT6、SlSHMT7、itfSHMT6、itfSHMT7處于同一個分支。每一個分支上均具有來自甘薯、番茄、擬南芥的SHMT蛋白,表明來自不同物種中SHMT基因可能具有相似的基因功能。

圖1 甘薯、番茄和擬南芥中SHMT家族進化樹分析

2.2 SHMT家族motif分析

利用MEME網站分析甘薯、番茄、擬南芥中21個SHMT蛋白的motif結構。21個SHMT蛋白的保守motif分布如圖2所示,圖2中:不同顏色的色條代表不同的保守基序;下方數字表示蛋白的氨基酸數目。

圖2 甘薯、番茄、擬南芥中SHMT蛋白motif分析

從圖2可以看出，進化樹中分支1,即itfSHMT1、itfSHMT2、SlSHMT1、AtSHMT1、AtSHMT2、itfSHMT3、SlSHMT2具有相同的motif組成和排列順序,這與基因家族進化樹的結果相吻合;分支2中的SlSHMT3、SlSHMT4、AtSHMT3與itfSHMT4的motif結構也很相似,與進化樹結果一致;分支3中的AtSHMT5雖然相比SlSHMT5、itfSHMT5、AtSHMT4多了一個motif5,但其他motif位置都保持一致;分支4中的AtSHMT6、AtSHMT7，SlSHMT6、SlSHMT7以及itfSHMT6、itfSHMT7的motif數量及排列均比較一致,表明它們可能具有保守的基因功能。蛋白motif結果分析表明,進化樹中的4個分支分別具有相對保守的蛋白motif結構,說明motif分析結果與進化樹的一致性。

2.3 SHMT蛋白家族結構域分析

利用SMART網站對甘薯、番茄、擬南芥中21個SHMT蛋白的結構域進行分析,結果如圖3所示。

從圖3可以看出,21個蛋白都有典型的SHMT結構域。

圖3 甘薯、番茄、擬南芥中SHMT蛋白結構域分析

從圖3a可以看出,與進化樹相對應的分支1中itfSHMT1、itfSHMT2、SlSHMT1、AtSHMT1、AtSHMT2、SlSHMT2、itfSHMT3的SHMT結構域共有398個氨基酸，其中SlSHMT2的SHMT結構域位于第56～454個氨基酸之間,從圖3b可以看出,itfSHMT3的SHMT結構域位于第59～457個氨基酸之間,該分支其余5個蛋白結構域位于第55～453個氨基酸之間;進化樹分支2中AtSHMT3、itfSHMT4、SlSHMT3、SlSHMT4的SHMT結構域共有390個氨基酸,其中AtSHMT3的SHMT結構域位于第83～473個氨基酸之間,itfSHMT4、SlSHMT4的SHMT結構域位于第81～471個氨基酸之間,SlSHMT3結構域位于第78～468個氨基酸之間;從圖3c可以看出,進化樹分支3中AtSHMT4、AtSHMT5、SlSHMT5、itfSHMT5的SHMT結構域共有405個氨基酸,它們的結構域分別位于第142～547個、第138～543個、第137～542個、第134～539個氨基酸之間;從圖3d可以看出，進化樹分支4中AtSHMT6,AtSHMT7、SlSHMT6、SlSHMT7、itfSHMT6、itfSHMT7的結構域共有400個氨基酸,結構域皆位于第12～412個氨基酸之間。由上述分析可以看出,甘薯、擬南芥、番茄當中的SHMT蛋白結構域約由400個氨基酸殘基構成,且同源性越高的蛋白結構域位置及氨基酸數目越相似。

2.4 SHMT基因家族結構分析

利用GSDS 2.0在線軟件分析甘薯、番茄、擬南芥中21個SHMT基因結構中內含子和外顯子的分布情況，如圖4所示。

圖4 甘薯、番茄、擬南芥中SHMT基因結構分析

圖4中:藍色代表基因上游或下游的非編碼序列;黃色代表基因的外顯子區(qū)域;實線代表基因的內含子區(qū)域。

從圖4可以看出,進化樹分支1中相對應的itfSHMT1、itfSHMT2、SlSHMT1、AtSHMT1、AtSHMT2、itfSHMT3、SISHMT2有15個外顯子和14個內含子;分支2中AtSHMT3、itfSHMT4、SlSHMT3、SlSHMT4有11個外顯子和10個內含子;分支3中AtSHMT4、AtSHMT5、SlSHMT5、itfSHMT5有4個外顯子和3個內含子;分支4除了AtSHMT6只有3個外顯子2個內含子外,AtSHMT7、SlSHMT6、SlSHMT7、itfSHMT6、itfSHMT7均具有4個外顯子3個內含子。由上述分析可知,進化樹上處于同一分支的SHMT基因亞家族,具有相似數目的外顯子和內含子,進一步說明SHMT基因在不同物種間具有保守性。

2.5 SHMT蛋白家族理化性質分析

對甘薯、番茄、擬南芥中的21個SHMT氨基酸序列進行理化分析結果,見表1所列。

由表1可知，進化樹分支1中相對應的itfSHMT1、itfSHMT2、SlSHMT1、AtSHMT1、AtSHMT2、itfSHMT3、SISHMT2蛋白理化性質相近,氨基酸數目最多相差4個氨基酸殘基,蛋白分子量相差不到1 000 g/mol,pI均為堿性;分支2中AtSHMT3、itfSHMT4、SlSHMT3、SlSHMT4、氨基酸數目、蛋白分子量差異均不大,pI值均為堿性,但AtSHMT3的pI明顯高于其他3個蛋白。

表1 番茄、甘薯、擬南芥中SHMT蛋白的理化性質

由表1還可知，分支3中AtSHMT4、AtSHMT5、SlSHMT5、itfSHMT5、氨基酸數目、蛋白分子量皆高于另外3個分支的基因或蛋白,pI值也各有不同,位于6.40～8.03之間;分支4中,AtSHMT6比AtSHMT7、SlSHMT6、SlSHMT7、itfSHMT6、itfSHMT7氨基酸數目僅少1個氨基酸殘基,蛋白分子量和pI值也有略微差異。由上述分析可知,進化樹上處于同一分支的SHMT蛋白具有相似的理化性質,進一步說明SHMT蛋白理化性質在不同物種間具有保守性。

2.6 SHMT蛋白家族亞細胞定位預測

SHMT基因的核定位序列(nuclear localization sequence,NLS)及亞細胞定位分析,結果見表2所列。通過NLS Mapper網站預測,其中擬南芥SHMT基因中有3個含有潛在的NLS,番茄SHMT基因只有SlSHMT5含有潛在的NLS,甘薯SHMT基因中只有itfSHMT1和itfSHMT5含有潛在的NLS,說明小部分SHMT蛋白可能在細胞核中發(fā)揮作用。通過亞細胞定位預測網站發(fā)現絕大多數SHMT可能在線粒體和葉綠體發(fā)揮主要作用,有的SHMT蛋白還可以在細胞核、內質網、質體、過氧化物酶體、細胞質、細胞骨架發(fā)揮作用;甚至AtSHMT4、AtSHMT2、itfSHMT4蛋白可能同時具有不同的亞細胞定位,進而行使自身的功能。

表2 番茄、甘薯、擬南芥中SHMT蛋白的核定位序列及亞細胞定位預測

2.7 SHMT蛋白高級結構預測

利用SOPMA網站對甘薯、番茄、擬南芥SHMT蛋白序列的二級結構進行預測分析,如圖5所示。圖5中:藍色代表α-螺旋;紫色代表無規(guī)則卷曲;紅色代表延伸鏈;綠色代表β-轉角。SHMT蛋白主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構成。其中,擬南芥、甘薯、番茄中SHMT蛋白構成α-螺旋占比分別為38.63%～47.78%、40.10%～46.81%、40.07%～46.91%;β-轉角分別占比5.10%～6.00%、5.73%～6.72%、5.73%～6.72%;延伸鏈分別占比11.70%～16.19%、11.91%～13.85%、11.89%～15.32%;最后無規(guī)則卷曲占比分別為35.03%～41.47%、33.97%～42.64%、33.01%～38.72%。由圖5可知,處于同一分支的蛋白具有較為相似的二級結構排布,表明在蛋白二級結構上的保守性。

圖5 甘薯、番茄、擬南芥中SHMT蛋白二級結構分析

為研究甘薯、番茄、擬南芥中的21個SHMT蛋白在三維結構上的保守性,利用SWISS網站在線構建SHMT的甘薯、番茄、擬南芥三維結構模型,如圖6所示。

從圖6可以看出，3個物種的蛋白三維結構基本分為4種構象,其中進化樹分支1中itfSHMT1、itfSHMT2、SlSHMT1、AtSHMT1、AtSHMT2;itfSHMT3、SlSHMT2蛋白三維結構相似;分支2中AtSHMT3、itfSHMT4、SlSHMT4、SlSHMT3構象相近;分支3中AtSHMT4、AtSHMT5、SlSHMT5、itfSHMT5構象相近;分支4中itfSHMT6、itfSHMT7、SlSHMT6、SlSHMT7、AtSHMT6、AtSHMT7具有相似的構象。這與進化樹分析結果比較吻合，結果表明,甘薯、擬南芥、番茄中SHMT蛋白具有高度保守的三級結構。

圖6 甘薯、番茄、擬南芥中SHMT蛋白三維結構分析

2.8 番茄中SHMT基因的組織表達水平分析

利用Solanaceae Genomics Network網站和基迪奧網站分析番茄中SHMT基因的組織表達水平,為甘薯中該基因家族的功能研究提供參考。番茄中7個SHMT基因在番茄不同組織及果實不同發(fā)育階段的表達量,如圖7所示。

圖7 番茄中SHMT基因在不同組織中的表達量熱圖分析

圖7中，DPA代表開花后天數。由圖7可知，SlSHMT1和SlSHMT6在番茄種子、葉、根中表達量較低,但在花及不同時期的果實中表達量顯著上升,說明這2個基因可能在番茄開花、果實成熟過程中發(fā)揮了重要作用;SlSHMT2、SlSHMT5、SlSHMT7分別在葉片、種子、花中表達量偏高,而在其他組織中幾乎檢測不到,體現了這3個基因表達的組織特異性,表明這3個基因可能參與番茄光合作用、種子萌發(fā)及開花過程的調控;SlSHMT3、SlSHMT4的表達量與種子發(fā)育過程呈現明顯的正相關,說明它們可能參與番茄種子中胚的發(fā)育,同時兩者與果實成熟也具有一定的關聯。

2.9 AtSHMT在脅迫條件下的基因表達量

鑒于SHMT基因家族在植物中的保守性,本文分析了擬南芥中7個SHMT基因在冷、熱及鹽脅迫下基因表達變化，如圖8所示,從圖8可以看出,在冷脅迫中,只有AtSHMT5在脅迫6 h后表達量呈現上升趨勢,對冷脅迫響應明顯;鹽脅迫中AtSHMT1在根中表達量下降,AtSHMT5表達量在3～24 h明顯高于對照組,表明AtSHMT1可能參與鹽脅迫的負調控,而AtSHMT5則可能參與正調控;熱脅迫條件下,AtSHMT1在根和幼苗中表達量急劇上升又急劇下降到正常水平,AtSHMT3在6 h時表達量急劇上升,24 h又恢復到正常水平,AtHMT6在熱脅迫過程中表達量一直低于對照組,說明AtHMT1、AtHMT3、AtHMT6可能參與了擬南芥對熱脅迫的反應。綜合上述可知,在熱脅迫中AtSHMT3、AtSHMT6表達量明顯上調,表明AtSHMT3、AtSHMT6在擬南芥抵御高溫時的潛在作用;而AtSHMT5在冷脅迫中表達量上調明顯,表明該基因可能參與擬南芥冷害脅迫的調控。

圖8 擬南芥中不同脅迫條件下各SHMT基因的表達量分析

3 結 論

SHMT在植物生長中的重要作用不言而喻,迄今為止對SHMT的研究依舊是生命科學領域重要的課題,不少相關領域的學者已經對SHMT的功能做了深入的探索和研究。然而,SHMT在甘薯和番茄中的功能尚不可知,因此,本文以甘薯、番茄、擬南芥SHMT基因家族為研究對象,通過進化樹分析、基因結構域分析、motif分析、蛋白的二級結構及三級結構預測,發(fā)現SHMT蛋白家族具有較高的保守性,并且發(fā)現蛋白結構信息和進化樹的分支情況,具有顯著的一致性。隨后通過理化性質分析、核定位序列預測、亞細胞定位預測等,發(fā)現部分SHMT具有廣泛的亞細胞定位。通過對番茄中7個SHMT基因進行表達量分析,研究SHMT基因家族在番茄生長發(fā)育中的功能和作用。例如,SlSHMT1和SlSHMT6可能在番茄開花、果實成熟過程中發(fā)揮了重要作用;SlSHMT2、SlSHMT5、SlSHMT7可能參與番茄光合作用、種子萌發(fā)及開花過程的調控;SlSHMT3、SlSHMT4可能參與番茄種子中胚的發(fā)育,同時兩者與果實成熟也具有一定的關聯。通過獲取不同脅迫(冷害、高溫及鹽脅迫)下擬南芥中7個SHMT的基因表達量,分析SHMT在擬南芥中可能參與多種脅迫。例如,AtSHMT3、AtSHMT6在擬南芥抵御高溫時可能有潛在作用;而AtSHMT5可能參與擬南芥冷害脅迫的調控。因此,通過對甘薯、番茄、擬南芥中的21個SHMT基因的生物信息學分析及表達數據挖掘,歸納出特定SHMT基因可能具有的功能,對深入研究SHMT基因在甘薯、番茄、擬南芥中的生物功能具有重要作用。