徐 華，邢寶奎，朱 捷

（1.廊坊市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 廊坊 065000；2.廊坊市六驥生物技術(shù)開發(fā)有限公司，河北 廊坊 065000）

1978年世界上第一個“試管女嬰”路易絲·布朗（Louise Brown）在英國出生。小路易絲的誕生標(biāo)志著哺乳動物體外受精（in vitrofertilization，IVF）技術(shù)已經(jīng)成熟。輔助生殖技術(shù)（包括IVF技術(shù)）為動物和人類生殖生物學(xué)增添了新的內(nèi)容，也為無數(shù)不孕不育夫妻帶來“福音”。由于這項技術(shù)在動物生殖生物學(xué)的基礎(chǔ)研究成果在治療不孕不育及動物育種中表現(xiàn)出極大的應(yīng)用前景，此項技術(shù)在后來的10年里有了較快發(fā)展，特別是在大家畜IVF技術(shù)方面，1981—1986年間通過體外受精技術(shù)生產(chǎn)的試管牛［1］、試管豬［2］、試管綿羊［2］及試管山羊［3］相繼獲得成功。遺憾的是所有這些成功案例采用的卵子全部來自體內(nèi)成熟的卵母細胞。可見這時的IVF技術(shù)是真正意義上的IVF。隨著該項技術(shù)研究不斷深入及技術(shù)的發(fā)展，IVF技術(shù)的內(nèi)涵也發(fā)生了很大改變，已經(jīng)發(fā)展成為集卵母細胞體外成熟（in vitromaturation，IVM）、成熟卵母細胞IVF和胚胎體外培養(yǎng)（embryoin vitroculture，IVC）三項技術(shù)于一體的綜合技術(shù)體系。到1990年前，主要家畜的IVF體系基本建立。由于牛特殊的經(jīng)濟價值及IVF技術(shù)在品種改良上的巨大潛力，其IVF技術(shù)在所有家畜中發(fā)展最快、水平最高，并迅速在生產(chǎn)中得到了廣泛應(yīng)用。2017年，全球體外生產(chǎn)（in vitroembryo production，IVP）的牛胚胎移植數(shù)首次超過了體內(nèi)回收胚胎移植數(shù)，其中60%以上是鮮胚移植，冷凍體外胚胎由于移植成功率偏低致使其占比相對較少［4］。這些數(shù)據(jù)僅僅是國際胚胎移植協(xié)會發(fā)布的統(tǒng)計數(shù)據(jù)，而實際數(shù)據(jù)可能還要高。這也標(biāo)志著牛胚胎體外生產(chǎn)技術(shù)已經(jīng)進入規(guī)?；虡I(yè)應(yīng)用階段。近20年來在世界范圍內(nèi)已累計進行了超過1 600萬次牛胚胎移植［5］。目前，全世界每年生產(chǎn)約100萬枚IVP牛胚胎，其中約1萬枚為性控胚胎。另外在提高單頭優(yōu)秀母牛繁殖效率方面，?；铙w采卵（ovum pick-up，OPU）結(jié)合體外受精和胚胎移植技術(shù)（OPU-IVF-ET）正在取代傳統(tǒng)的超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)（MOET），展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。例如，在美國綜合育種值排名前100名的奶用種公牛中，有87頭是通過OPU-IVF-ET技術(shù)產(chǎn)生的?；仡?0多年來牛IVF技術(shù)的發(fā)展，在一些方面取得了進展，如激素和各種添加因子在體外成熟體系中的應(yīng)用、無血清培養(yǎng)體系或無動物產(chǎn)品培養(yǎng)體系的建立；但遺憾的是IVF生產(chǎn)效率并沒有明顯提高，如卵母細胞的體外成熟率仍然保持在80%～90%，受精后48 h分裂率為70%～80%，囊胚率為30% ～40%，囊胚率極少超過50%。這些結(jié)果被認為是目前的國際先進水平，幾乎與30年前相同。這意味著超過50%的體外成熟卵母細胞在受精后無法正常發(fā)育。這已成為制約牛OPU-IVF-ET技術(shù)普及應(yīng)用的最大障礙，而IVF技術(shù)的難點正是卵母細胞的體外成熟［5］。因此，文章將著重圍繞牛卵母細胞體外成熟中遇到的主要問題（即卵母細胞核與細胞質(zhì)不同期成熟、卵母細胞群中每個卵母細胞發(fā)育階段不同期及表觀遺傳學(xué)的變化）進行論述，并提出可能的解決辦法。

1 卵母細胞細胞核與細胞質(zhì)成熟不同期

無論是OPU采集，還是通過屠宰廠卵巢得到，從離開卵泡時開始，卵母細胞核成熟就失去了卵泡液中一些抑制因子的調(diào)控，其細胞周期重新恢復(fù)，從而產(chǎn)生了卵母細胞核成熟超前而細胞質(zhì)成熟滯后的情況，即“卵母細胞核與細胞質(zhì)成熟不同期”的問題。這樣的卵母細胞要么無法受精，要么因為卵母細胞質(zhì)量差導(dǎo)致受精后發(fā)育停滯。另外，成熟卵母細胞質(zhì)量的好壞不僅直接影響受精率和發(fā)育率，而且直接影響多精入卵現(xiàn)象的發(fā)生。與體內(nèi)成熟的卵母細胞相比，體外成熟的卵母細胞受精后多精入卵的發(fā)生率要遠遠高于前者。顯然，這種卵母細胞核與細胞質(zhì)成熟的不同期會隨著采卵人員技術(shù)不熟練或卵母細胞離開卵泡到進入卵母細胞體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)時間的延長而加劇。因此，抑制卵母細胞核成熟速度、縮小卵母細胞核成熟與細胞質(zhì)成熟不同期化的程度，是在體外成熟培養(yǎng)過程中獲得高質(zhì)量成熟卵母細胞的關(guān)鍵。

牛卵母細胞體外成熟培養(yǎng)中存在的細胞核與細胞質(zhì)成熟不同期的問題是長期以來研究人員一直關(guān)注并努力解決的問題。要解決這個問題，最直接的方法是模擬卵母細胞體內(nèi)發(fā)育過程，詳細了解不同發(fā)育階段卵泡內(nèi)環(huán)境條件的變化規(guī)律，從而找到有效解決辦法。在這方面研究人員已經(jīng)取得了一些成果。在卵泡內(nèi)部卵母細胞和周圍的顆粒細胞通過間隙連接和卵泡液（follicular fluid，F(xiàn)F）傳遞的因子不斷相互作用，使卵母細胞獲得發(fā)育能力。這些相互作用是卵母細胞分化成功的決定性因素。目前已經(jīng)在卵泡液中發(fā)現(xiàn)許多化合物，包括由顆粒細胞或卵母細胞本身分泌的生長因子［6］及包括外泌體（exosomes）在內(nèi)的細胞外載體（extracellular vehicles，EV）［7］，這些細胞載體來源于體細胞和卵母細胞，其中包括蛋白質(zhì)、mRNA、microRNA和脂質(zhì)［8］。這些外泌體參與保護卵母細胞免受過氧化物的損害［9］，以及microRNA信號傳導(dǎo)、誘導(dǎo)早期胚胎中的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［10］和調(diào)節(jié)卵丘擴張［11］等作用。總之，對外泌體的進一步研究可能會改善胚胎體外生產(chǎn)效率［12］，并有助于確定卵母細胞質(zhì)量的標(biāo)志物。卵泡液中含有眾多已知和未知的因子，在不改變其他條件的情況下，直接利用卵泡液取代體外成熟培養(yǎng)液中的犢牛血清，可顯著改善牛卵母細胞體外成熟效率［13］。卵泡液的主要作用可能是促進了卵母細胞在體外成熟過程中細胞核和細胞質(zhì)成熟的同期化。但卵泡液中各種因子的含量和活性易受諸多因素影響而發(fā)生變化，很難做到在牛卵母細胞的IVM中精確添加。因此，研究人員希望通過調(diào)節(jié)卵母細胞的細胞周期，降低其細胞核成熟速度或提高細胞質(zhì)成熟速度，使卵母細胞核與細胞質(zhì)達到同期（或同步）成熟。目前比較理想的辦法是在卵母細胞離開卵泡后立即抑制或停止卵母細胞的細胞周期，使卵母細胞的細胞核與細胞質(zhì)在IVM前接近同期化，之后再進入IVM液開始體外培養(yǎng)過程。自1990年以來，在不同畜種上開展了大量試驗研究，并有許多相關(guān)文章發(fā)表［14-17］。調(diào)控卵母細胞細胞周期的抑制因子主要有放線菌酮（cycloheximide，CHX，一種蛋白質(zhì)合成抑制劑）［18］、卵母細胞成熟促進因子激酶活性的抑制劑（roscovitine，ROS）［19］、6-二甲基氨基嘌呤（6-dimethylaminopurine，一種磷酸化抑制劑）［17，20-22］、蛋白酪氨酸磷酸酶抑制劑（vanadate，即NaV03）［20］、侵入性細胞外腺苷酸環(huán)化酶（iAC）、磷酸二酯酶抑制劑（PDE inhibitor）、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）［23-24］和丁內(nèi)酯Ⅰ（ButyrolactoneⅠ，一種核成熟抑制劑）［14，25］。以上這些抑制因子都通過不同途徑對卵母細胞的細胞周期產(chǎn)生抑制或停滯作用。而當(dāng)這些因子的抑制或停滯作用被取消后卵母細胞的細胞周期又可以重新恢復(fù)，而且絕大多數(shù)的抑制劑并不影響卵母細胞正常成熟。但這些試驗的結(jié)果并不總是有效的。R.D.Rose等［26］將從屠宰廠卵巢獲得的羊卵母細胞-顆粒細胞復(fù)合體在正常IVM培養(yǎng)之前，用含有100 mmol／L的Forskolin（FSK）加500 mmol／L的3-isobutyl-1-methylxanthine（IBMX）溶液處理卵母細胞-顆粒細胞復(fù)合體2 h，卵母細胞與顆粒細胞復(fù)合體的cAMP濃度提高了10倍。并且IVF后囊胚率和胚胎質(zhì)量獲得顯著提高。此外，Milrinone是一種3型磷酸二酯酶的特異性抑制劑，只在卵母細胞中表達；而Rolipram是一種4型磷酸二酯酶的特異性抑制劑，只在顆粒細胞中表達。如果將這兩種抑制劑同時加入成熟培養(yǎng)液中，囊胚率也會明顯提高。這說明上述抑制劑不僅抑制卵母細胞的細胞周期，而且抑制顆粒細胞的細胞周期，這對卵母細胞成熟是非常有利且必要的。同樣，添加cAMP調(diào)節(jié)劑或其他類似試劑到成熟培養(yǎng)液中也可以改善卵母細胞成熟效率和質(zhì)量［15，27-29］，或者至少對卵母細胞發(fā)育潛力無不利影響［14，29-30］。另外，IVM的卵母細胞與體內(nèi)成熟的卵母細胞相比，除了質(zhì)量上的差異以外，還有一個顯著缺點就是最佳受精時間短，一般僅為2～3 h（如果卵母細胞成熟質(zhì)量不好，時間可能更短），而體內(nèi)成熟的卵母細胞最佳受精時間可達4～6 h，甚至更長。因此，延長IVM卵母細胞最佳受精時間不僅可以提高卵母細胞成熟質(zhì)量和數(shù)量，同時也能讓一些接近老化的卵母細胞延緩老化，使更多的卵母細胞可以被受精，進而提高IVF效率。從理論上講，凡是可以維持或提高卵母細胞中成熟促進因子（maturation promoting factor，MPF）的藥物都應(yīng)該是潛在的候選藥物。篩選出適宜的抑制劑，并優(yōu)化其使用濃度和處理時間是非常重要的。

綜上所述，采用特異性抑制劑去停滯或延遲卵母細胞核成熟的速度或加速卵母細胞質(zhì)成熟的速度，使細胞核與細胞質(zhì)的成熟同期化，有可能成為未來提高體外成熟卵母細胞質(zhì)量的一個有效途徑。

2 卵母細胞群中每個卵母細胞發(fā)育階段不同期

IVF技術(shù)的最大優(yōu)勢就是可以高效利用優(yōu)秀母畜卵巢上的卵母細胞資源，充分發(fā)揮繁殖潛力和遺傳優(yōu)勢。但牛是單胎動物，無論是通過活體采卵、還是通過屠宰廠卵巢獲得的卵母細胞，在進行體外成熟培養(yǎng)時各自處于不同的發(fā)育階段，這種現(xiàn)象稱為群體卵母細胞發(fā)育階段的不同期。當(dāng)采集的卵母細胞進行正常的體外成熟培養(yǎng)后（一般22～24 h）通常可以得到以下類型的卵母細胞：（1）死的或閉鎖的卵母細胞；（2）沒有成熟的卵母細胞；（3）老化的成熟卵母細胞；（4）細胞核成熟而細胞質(zhì)未成熟的卵母細胞；（5）細胞核和細胞質(zhì)都成熟的卵母細胞。其中，只有第5種類型的卵母細胞是真正具有發(fā)育潛力的合格細胞。另外，除了死的卵母細胞，有經(jīng)驗的技術(shù)人員可以通過形態(tài)學(xué)觀察加以剔除，而其他很難通過形態(tài)學(xué)加以區(qū)分。群體卵母細胞發(fā)育階段的不同期是造成牛體外受精效率在過去30多年中沒有明顯提高的最主要原因。為什么不同的技術(shù)人員處理同一批卵母細胞會得到不同的結(jié)果？究其原因，具備熟練操作經(jīng)驗的技術(shù)人員是關(guān)鍵，一是這類人員動作熟練、操作速度快，可以顯著縮短卵母細胞離開卵泡后進入體外成熟培養(yǎng)系統(tǒng)的時間。二是他們對采集卵母細胞的質(zhì)量判斷和形態(tài)學(xué)選擇更加準(zhǔn)確。因此，對初學(xué)者進行必要的培訓(xùn)是快速提高操作人員技術(shù)水平的必由之路［8］。

與讓單個卵母細胞核與細胞質(zhì)成熟同期化相比，欲使從屠宰廠采集的卵巢或活體采卵收集的卵母細胞群體中所有或絕大多數(shù)卵母細胞發(fā)育期達到同期化要相對更難些。前已述及，不僅卵母細胞的細胞周期需要同期化，而且附著在卵母細胞周圍的顆粒細胞也需要同期化，這對卵母細胞群體的同期化至關(guān)重要。而顆粒細胞的細胞周期一般為22～24 h。這也意味著與卵母細胞核成熟被抑制或停滯相比，卵母細胞群體的同期化可能需要更長時間。一般認為群體卵母細胞的成熟不可能同時到達成熟（即第二次減數(shù)分裂的中期MⅡ）。通過匯總分析卵母細胞到達成熟的時間和數(shù)量等數(shù)據(jù)，可以得到卵母細胞的成熟率曲線，一般呈左半正態(tài)分布的狀態(tài)，這是目前衡量IVM卵母細胞成熟的一項重要指標(biāo)。當(dāng)成熟率曲線分布越廣，表明卵母細胞群中處于不同期狀態(tài)的卵母細胞數(shù)量越多，預(yù)示IVF效率越低；相反，當(dāng)成熟率曲線分布范圍越小，則說明卵母細胞群中到達成熟的時間比較集中、同期化程度較高，預(yù)示會有更多的卵母細胞可在最佳時間內(nèi)得以受精。因此，IVM卵母細胞成熟率曲線是提高卵母細胞體外成熟率的關(guān)鍵，也是決定動物體外胚胎生產(chǎn)效率最主要的因素之一。如何提高卵母細胞群體成熟率，同步、集中卵母細胞群體成熟時間，是目前全世界牛IVF技術(shù)領(lǐng)域面臨的共同挑戰(zhàn)。比較理想的解決思路就是設(shè)法讓所有的卵母細胞在IVM之前，像“百米短跑比賽”一樣，能夠“站在”同一起跑線上，即讓卵母細胞在進入IVM培養(yǎng)前處于同一發(fā)育階段，不允許其停滯在原來的自然發(fā)育階段。這樣經(jīng)過同樣時間的IVM培養(yǎng)，就會有更多的卵母細胞共同發(fā)育、成熟到較為集中、統(tǒng)一的最佳受精時間，為后續(xù)受精和胚胎發(fā)育奠定物質(zhì)基礎(chǔ)［9］。有研究者采用蛋白合成抑制劑放線菌酮或絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶抑制劑6-二甲基氨基嘌呤處理卵母細胞24 h，以避免卵母細胞核的成熟［31］。他們發(fā)現(xiàn)幾乎所有被處理過的牛卵母細胞都停止在GⅤ期，表明抑制劑的作用是有效的。當(dāng)抑制劑被移除后，這些卵母細胞可以正常成熟和受精。采用放線菌酮處理后體外成熟的牛卵母細胞，經(jīng)過體外受精及胚胎培養(yǎng)，囊胚率略低于未經(jīng)抑制劑處理并在體外成熟22 h后的卵母細胞再進行體外受精的對照組，但高于26 h受精的對照組；不過，放線菌酮處理48 h后卵母細胞可以正常成熟與受精，但沒有囊胚出現(xiàn)。而6-二甲基氨基嘌呤處理后的牛卵母細胞，盡管后續(xù)可發(fā)育至囊胚，但囊胚率低于未經(jīng)藥物處理的對照組，同時也低于放線菌酮處理組。同時，在含有放線菌酮的溶液中添加促卵泡素（FSH）＋17β-雌二醇（estradiol-17β，E2）或只添加17β-雌二醇處理，受精后的囊胚率與對照組沒有差異。更重要的是，將經(jīng)過放線菌酮處理24 h的卵母細胞進行體外受精后得到的胚胎進行受體移植，最終獲得2頭健康牛犢。這表明采用放線菌酮處理24 h的卵母細胞可以產(chǎn)生正常胚胎，且這些胚胎具有發(fā)育成動物個體的潛力。這為廣大研究人員打開了“新的窗口”，提供了解決問題的新思路。按照這個思路，筆者正在進行中的試驗取得的初步結(jié)果（尚未發(fā)表）表明，與對照組相比，對卵母細胞群體進行同期化處理組的卵母細胞成熟率及受精48 h后的分裂率、囊胚率、胚胎質(zhì)量都有顯著提高。隨著對卵母細胞體內(nèi)發(fā)育過程的生理機制更為深入的研究和了解，加強對卵母細胞體外發(fā)育調(diào)控方法的創(chuàng)新和持續(xù)優(yōu)化，相信在不久的將來，這個長期困擾牛卵母細胞IVM的問題一定可以得到圓滿解決。

3 表觀遺傳學(xué)的變化

眾所周知，卵母細胞在體內(nèi)生長環(huán)境和體外成熟培養(yǎng)環(huán)境有著很大的不同。其中最大的不同是，體內(nèi)生長環(huán)境是一個動態(tài)的自主調(diào)控系統(tǒng)，即按照卵母細胞生長需求，機體不斷提供相應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)和調(diào)控因子，通過下丘腦-垂體-性腺軸的負反饋和正反饋調(diào)控機制調(diào)節(jié)卵母細胞生長、發(fā)育、成熟和排卵所必需的生殖激素［11］。而體外培養(yǎng)環(huán)境是一個固定態(tài)，讓卵母細胞-顆粒細胞復(fù)合體在一個人為模擬體內(nèi)環(huán)境的條件下培養(yǎng)24 h。這個復(fù)合體需要在這個固定態(tài)的培養(yǎng)體系中進行新陳代謝，溶液中被消耗的營養(yǎng)物質(zhì)和激素?zé)o法得到及時補充和更換，加上代謝產(chǎn)物也無法及時排出，這種雙重作用會直接導(dǎo)致卵母細胞-顆粒細胞復(fù)合體在發(fā)育成熟過程中的一些基因表達發(fā)生異常，從而使卵母細胞的成熟偏離正常的發(fā)育軌跡。因此，把這種卵母細胞基因本身沒有變化、但因環(huán)境因素改變而導(dǎo)致基因表達發(fā)生改變視為表觀遺傳的變化。例如，小鼠受精卵在Whitten培養(yǎng)液中培養(yǎng)至囊胚階段，與體內(nèi)的同期囊胚相比，有114個基因表達出現(xiàn)異常；而同樣的小鼠受精卵培養(yǎng)在KSOM＋氨基酸的溶液中，僅發(fā)現(xiàn)有29個基因表達出現(xiàn)異常［32］。由此可見，不同培養(yǎng)液對胚胎細胞發(fā)育的影響非常大。另外，由于采用卵母細胞-顆粒細胞復(fù)合體體外成熟培養(yǎng)，在細胞發(fā)育過成程中產(chǎn)生的各種代謝產(chǎn)物無法及時清除，造成一些有毒、有害代謝產(chǎn)物的積累，進而對卵母細胞的成熟產(chǎn)生不良影響，其中代謝產(chǎn)生的過氧化物對卵母細胞或胚胎的毒害作用是研究人員應(yīng)特別關(guān)注的問題。另一方面，血清和氨基酸代謝產(chǎn)生的氨對細胞也有毒害作用，常導(dǎo)致胚胎在著床前印記基因的表達喪失或異常，這被認為是導(dǎo)致牛羊出現(xiàn)“大胎兒綜合征（large offspring syndrome，LOS）的主要原因。大約10% 的體外生產(chǎn)胚胎在移植后可能出現(xiàn)“大胎兒綜合癥”［33］。因此，目前的卵母細胞體外培養(yǎng)體系與機體自身卵泡內(nèi)成熟系統(tǒng)相比，遠沒有達到理想條件。這也說明改善牛卵母細胞的IVM仍然有很大提升空間。

目前，絕大多數(shù)已發(fā)表的有關(guān)動物卵母細胞體外成熟的文章都屬于表觀遺傳變化范疇，歸納起來主要包括：（1）營養(yǎng)物質(zhì)或代謝對卵母細胞成熟的影響。例如溶液成分［34-35］、氨基酸［36］、脂肪因子［37］、氧氣與葡萄糖［38］、茴香腦［39］、DMSO［40］、葉酸［41］等。（2）各種激素、生長因子（包括旁激素對卵母細胞成熟的影響）。例如雌激素［42］、上皮生長因子（EGF）和透明質(zhì)酸［43］、前列腺素［44］、促卵泡素（FSH）［45］、L-半胱氨酸、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-15（BMP15）和生長分 化 因 子 -9（GDF9）［46］、白 血 病 抑 制 因 子（LIF）［47-48］等。（3）抗氧化劑或緩解代謝毒素對卵母細胞成熟的影響。例如褪黑色素（melatonin）［49-50］、番茄紅素（lycopene）［51］、諾比列?。∟obiletin）［52］等。盡管類似的探索試驗還有很多，但絕大多數(shù)結(jié)果與試驗條件有很大的關(guān)系。有些試驗結(jié)果報道有效，但有些試驗結(jié)果是不可重復(fù)的。

4 小結(jié)和展望

與其他很多學(xué)科和技術(shù)相比，IVF技術(shù)仍然非常年輕。從IVF包括IVM建立以來，只在短短的30年時間里，這項技術(shù)不僅累計產(chǎn)生了近千萬的“試管嬰兒”，為許多不孕不育家庭解除了痛苦、帶來了歡樂，而且正在或?qū)⒃谔岣呒倚笊a(chǎn)率和改良動物育種效率上發(fā)揮越來越重要的作用。近兩年，國內(nèi)以牛IVF技術(shù)為基礎(chǔ)的生物技術(shù)公司不斷涌現(xiàn)，標(biāo)志著IVF技術(shù)已經(jīng)初步具備了商業(yè)化生產(chǎn)的條件和基礎(chǔ)。隨著國內(nèi)動物育種（特別是牛育種）的發(fā)展和日益增長的市場需求，我國牛IVF技術(shù)也將迎來一個重要的發(fā)展機遇期。同時應(yīng)該看到，目前國內(nèi)體外受精技術(shù)水平與國際相比，無論是在科研還是在生產(chǎn)應(yīng)用上都存在很大差距。一方面我們深切感到將現(xiàn)代動物繁殖生物新技術(shù)應(yīng)用到動物育種上的緊迫感，另一方面又面臨著相關(guān)技術(shù)瓶頸的限制。因此，加快牛IVF技術(shù)由研究轉(zhuǎn)向應(yīng)用，必須從關(guān)鍵技術(shù)層面解決好主要瓶頸問題。盡管到目前為止，牛IVF技術(shù)研究涉及的相關(guān)因素至少有上百種，但在本文中僅簡要歸納為三類，其中前兩項最為重要，也是難度最大的。這是多年來筆者在IVF科研實踐與推廣應(yīng)用中收獲的體會。

生產(chǎn)效率是一項技術(shù)轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力的生命線，沒有生產(chǎn)效率的技術(shù)是失敗技術(shù)。因此，需要廣大科研和推廣工作人員立足實際，通過聯(lián)合研發(fā)、集成協(xié)作、實驗示范，著力解決IVF技術(shù)中存在的主要問題，力爭使我國早日進入到該技術(shù)世界先進水平，為牛OPU-IVF-ET技術(shù)在我國牛育種中快速、高效應(yīng)用奠定扎實的技術(shù)基礎(chǔ)和平臺。