曹巍巍，郭修田

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院肛腸科，上海 200071)

結(jié)直腸癌(Colorectal cancer，CRC)是常見的一種消化道惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)影響男性和女性最常見腫瘤中居第3位[1-3]。每年有超過100萬新病例報(bào)告，大約60萬患者死于這種疾病[4]。而在我國，CRC發(fā)病率和病死率也在不斷上升。根據(jù)《中國結(jié)直腸癌診療規(guī)范(2020年版)》[5]2018年中國癌癥統(tǒng)計(jì)報(bào)告顯示，我國CRC發(fā)病率、病死率在全部惡性腫瘤中分別位居第3及第5位，新發(fā)病例37.6萬，死亡病例19.1萬。

近年來，針對CRC的動物模型受到了廣泛關(guān)注。近5年來，關(guān)于CRC小鼠造模的綜述[6-9]也逐漸增多，CRC生物復(fù)雜性激發(fā)了更合適的研究設(shè)計(jì)的發(fā)展[10]。嚙齒類動物模型[11-12]具有許多重要的屬性，它們與人類的許多相同特征已被證明對理解CRC的許多復(fù)雜分子方面非常重要，它們也是開發(fā)新的化療藥物的寶貴工具[13-14]。這使得實(shí)驗(yàn)室小鼠成為腫瘤學(xué)研究中最具吸引力的實(shí)體之一。目前常規(guī)使用的CRC動物模型分為自發(fā)性模型、誘發(fā)性模型、移植性模型以及轉(zhuǎn)基因模型?，F(xiàn)對CRC移植模型中原位移植的最新研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1 原位移植造模優(yōu)勢

以往的小鼠腫瘤模型均為異種移植瘤異位模型，為新型原位腫瘤模型的發(fā)展奠定了基礎(chǔ)[15]。這些異種異位移植模型傳統(tǒng)上是通過將人結(jié)腸癌細(xì)胞皮下植入裸鼠。在這個模型中，形成的腫瘤位于外部，因此它更容易完整地與組織分離，可以更加準(zhǔn)確地測量腫瘤的生長情況和大小。然而，傳統(tǒng)的皮下腫瘤模型對大腸癌的研究并不理想，制作一個異位模型很容易，但它不能模擬人類的疾病過程[16]。因?yàn)槟[瘤的解剖位置在皮下，且皮下轉(zhuǎn)移不存在，所以該模型不適合研究自發(fā)轉(zhuǎn)移過程[17-19]。大腸癌原位小鼠模型以癌細(xì)胞在自然位置生長為特征，高保真地復(fù)制了人類疾病過程，能更準(zhǔn)確地預(yù)測腫瘤治療的臨床結(jié)果[20]。因此，原位移植模型是一種比較容易建立且腫瘤生物學(xué)特性與在體腫瘤較為一致的模型，是進(jìn)行CRC生物學(xué)研究和腫瘤藥物篩選研究的理想模型[21]。

2 原位移植造模方法

原位異種移植模型的制備方法有多種，按技術(shù)方法可分為開放手術(shù)造模、灌腸造模、經(jīng)肛門低劑量電凝造模以及內(nèi)鏡微創(chuàng)造模四種。

2.1 開放手術(shù)造模 Zhu等[22]于2020年3月將來自于美國加州大學(xué)圣地亞哥分校外科腫瘤科(UCSD)1例術(shù)前未接受任何化療或放療的患者的CRC樣本移植在裸鼠皮下。腫瘤長大后再次采集，移植在表達(dá)綠色熒光蛋白的裸鼠皮下傳代兩代，提取最終表達(dá)綠色熒光蛋白的小鼠直腸癌細(xì)胞。麻醉非表達(dá)綠色熒光蛋白的裸鼠后，在腹部正中皮膚切開約1 cm，在盲腸上縫合一個5 mm×5 mm×5 mm的腫瘤碎片，使用6-0尼龍線縫合切口，建立原位移植的CRC模型。該模型的淋巴轉(zhuǎn)移率與遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移率文中并未統(tǒng)計(jì)，但腫瘤發(fā)生率為100%。Hu等[23]在傳統(tǒng)的開放手術(shù)原位造模法的基礎(chǔ)上改良了腫瘤碎片的種植方式。傳統(tǒng)方式是用手術(shù)縫合線將1 mm×1 mm的腫瘤碎片縫合于直腸黏膜損傷區(qū)域，而改良模型是用黏合劑(氰基丙烯酸酯)代替手術(shù)縫合線，1 mm×1 mm的腫瘤碎片黏附于直腸黏膜損傷區(qū)域。對比傳統(tǒng)縫合方式，改良模型在手術(shù)耗時、小鼠成活率以及腫瘤大小方面有明顯優(yōu)勢。

2.2 灌腸造模 Kishimoto等[24]將小鼠CRC細(xì)胞系CT26和人CRC細(xì)胞系HCT-116在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，造模過程是先通過化學(xué)破壞直腸黏膜屏障。將小鼠麻醉后，通過肛門將一根聚乙烯導(dǎo)管插入直腸腔，用6 ml PBS沖洗直腸腔，以清除腸道內(nèi)容物。將牽開器插入肛門直腸區(qū)域，擴(kuò)張直腸腔，然后用4%乙酸溶液浸泡直腸黏膜2 min，然后再次用6 ml PBS沖洗。在直腸黏膜屏障破裂后，立即將CT26-GFP細(xì)胞注入50 μl 基底膠，用一根針將其灌注到距肛門4 mm的直腸黏膜表面。在注入癌細(xì)胞后，立即用塑料膠帶將肛門密封，將牽開器夾在直腸內(nèi)，以防止細(xì)胞滲漏。手術(shù)總時間約為每只小鼠15 min，沒有發(fā)生與醋酸治療和癌細(xì)胞植入相關(guān)的并發(fā)癥或死亡。最終，腫瘤發(fā)生率為100%，腸系膜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為90.9%，主動脈旁淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率為54.5%，肺轉(zhuǎn)移率為91.8%，肝轉(zhuǎn)移率為9%。

2.3 經(jīng)肛門低劑量電凝造模 Bhullar等[25]將CRL-2639、CRL-2638、HT-29、LS-174T腫瘤細(xì)胞系植入重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)小鼠。麻醉后將小鼠仰臥放置。特別設(shè)計(jì)的可拆卸單電極的外護(hù)套由柔軟的橡膠制成，尖端光滑。首先把直腸引入橡膠護(hù)套，輔以水溶性凝膠潤滑，從而避免對結(jié)腸造成傷害。然后，將軟金屬單極電極穿過先前放置的外層橡膠護(hù)套，確保電極的非創(chuàng)傷性圓端剛好伸出外橡膠套為電極提供絕緣，將軟夾具應(yīng)用于小鼠尾尖并連接到Bovie機(jī)器。電流過低時不能造成黏膜損傷，過高則會導(dǎo)致穿孔，通過嘗試不同的Bovie設(shè)置，最終選擇最佳的5 W設(shè)置進(jìn)行研究。在預(yù)設(shè)的單個或3個點(diǎn)電凝結(jié)腸黏膜，每個點(diǎn)之間至少間隔5 mm的距離，從距離肛門口2 cm開始。去電極后，將一根24 Fr TeflonⅠ/Ⅴ套管插入直腸灌注腫瘤細(xì)胞。結(jié)果顯示，腫瘤發(fā)生率CRL-2638為100%，CRL-2639為92%，LS-174T為100%，HT-29為58%；淋巴轉(zhuǎn)移率CRL-2638為100%，CRL-2639為50%，LS-174T為83.3%，HT-29為33.3%；肝轉(zhuǎn)移率CRL-2638為41.7%，CRL-2639為0%，LS-174T為83.3%，HT-29為0%。

2.4 內(nèi)鏡微創(chuàng)造模 Hite等[26]將HT-29細(xì)胞通過顯微鏡下注射在SCID小鼠直腸黏膜下。具體造模方式為：將小鼠麻醉后，用潤滑的鈍頭鉗擴(kuò)張肛管，暴露遠(yuǎn)端肛門和直腸黏膜。使用奧林巴斯解剖顯微鏡漢密爾頓微升注射器把腫瘤細(xì)胞注射到直腸遠(yuǎn)端黏膜下層、肛管以上1～2 mm處。結(jié)果顯示，小鼠直腸原位腫瘤發(fā)生率為100%，肝轉(zhuǎn)移率為60%，肺轉(zhuǎn)移率為56%，淋巴轉(zhuǎn)移率文中未統(tǒng)計(jì)。Chen 等[27]描述了一種使用內(nèi)鏡微創(chuàng)手術(shù)的新型CRC原位移植造模法，將CT26細(xì)胞系原位移植在BALB/C小鼠直腸黏膜下，MC38細(xì)胞系原位移植在C57BL/6J小鼠直腸黏膜下，植入細(xì)胞數(shù)分別為104、105和106個，各實(shí)驗(yàn)組均取14 d觀察期，以觀察各組的腫瘤發(fā)生率及轉(zhuǎn)移率，結(jié)果顯示CT26各組腫瘤發(fā)生率均為100%，淋巴轉(zhuǎn)移率分別為75%(104個細(xì)胞)、100%(105個細(xì)胞)和50%(106個細(xì)胞)，肝轉(zhuǎn)移率分別為25%(104個細(xì)胞)、50%(105個細(xì)胞)和50%(106個細(xì)胞)；MC38腫瘤發(fā)生率發(fā)表為0%(104個細(xì)胞)、25%(105個細(xì)胞)和50%(106個細(xì)胞)，淋巴轉(zhuǎn)移率和肝轉(zhuǎn)移率各組均為0%。

3 四種原位移植造模方法優(yōu)缺點(diǎn)

Zhu等[22]在裸鼠盲腸上進(jìn)行的原位移植造模是在裸鼠腹部切開皮膚，找到盲腸，在盲腸上縫合腫瘤細(xì)胞碎片，再縫合切口，所以造模的定位很準(zhǔn)確，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求自主選擇腫瘤細(xì)胞移植點(diǎn)位，且腫瘤移植成功率和成瘤率很高，這是開放手術(shù)造模相較于其他造模方式的顯著優(yōu)勢。Hu等[23]發(fā)表的改良模型用黏合劑(氰基丙烯酸酯)代替手術(shù)縫合線，在手術(shù)耗時、小鼠成活率以及腫瘤大小方面有明顯優(yōu)勢。但是同樣，開放手術(shù)帶來的開放性創(chuàng)口容易造成小鼠術(shù)后感染，增加模型病死率，且需要縫合切口，對手術(shù)操作本身有一定的要求。

Kishimoto等[24]介紹的灌腸模型沒有開放性創(chuàng)口，操作較為便捷且成瘤率高，而且淋巴轉(zhuǎn)移率和其他器官轉(zhuǎn)移率都較高。據(jù)我們所知，這是第一個可以可靠地提供真正的原位直腸癌在黏膜組織中生長，并隨后引起自發(fā)淋巴結(jié)和肺轉(zhuǎn)移的模型，這很容易被GFP熒光高靈敏度檢測到。該模型可用于研究腫瘤的早期生長或評估可能增強(qiáng)或抑制早期CRC生長的腔內(nèi)因素(膳食化合物、膽汁酸、腸道菌群等)。但是灌腸模型不能根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求精準(zhǔn)選取腫瘤細(xì)胞種植點(diǎn)位，這是該模型的明顯缺點(diǎn)。

Bhullar等[25]提出的經(jīng)肛門低劑量電凝造模法結(jié)合了開放手術(shù)造模法和灌腸造模法的優(yōu)勢，在設(shè)定合適的電流量后，將電極經(jīng)小鼠肛門到達(dá)直腸黏膜的目標(biāo)點(diǎn)位，造成黏膜損傷后退出肛門，再使用灌腸法使得腫瘤細(xì)胞在黏膜下目標(biāo)點(diǎn)位種植。這種造模法既沒有開放創(chuàng)口，也可以精確到幾個點(diǎn)位，是目前比較新的一種造模方式，具有其獨(dú)特的優(yōu)勢。但是該造模法對于設(shè)備有一定的要求，且調(diào)試電極過程中會造成小鼠的意外死亡。

Hite等[26]介紹的顯微鏡下注射模型是截至目前最安全、最可復(fù)制、最成功的具有原發(fā)腫瘤生長和自發(fā)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移特征的原位CRC小鼠模型。而且，該模型在主觀上是最快建立的，最容易學(xué)習(xí)，技術(shù)上最容易操作，對動物的壓力較小。腫瘤成瘤率和肝、肺轉(zhuǎn)移率都是實(shí)驗(yàn)組中最高的，淋巴轉(zhuǎn)移率實(shí)驗(yàn)未涉及。Chen等[27]介紹的內(nèi)鏡微創(chuàng)造模法是目前比較先進(jìn)的原位CRC造模法，是利用內(nèi)鏡觀察并選取直腸目標(biāo)注射點(diǎn)位，后引入柔性注射導(dǎo)管，使注射針輕輕穿過結(jié)腸黏膜，使其斜面朝向管腔。再由第2名研究員注射腫瘤細(xì)胞懸液，看到黏膜輕微抬起(“陽性抬升標(biāo)志”)則為注射成功。該造模法腫瘤種植成功率高，操作簡單，淋巴轉(zhuǎn)移率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率都比較高，是目前比較先進(jìn)的一種造模方式[28]，且效果較好，但是對實(shí)驗(yàn)器材要求較高，造模成本很高，普及率較低。

4 結(jié) 語

目前主流的幾種原位CRC小鼠造模方式都各有其優(yōu)勢和不足之處。傳統(tǒng)的開放手術(shù)種植點(diǎn)位精準(zhǔn)，操作簡便，器材易得，但是對小鼠創(chuàng)傷較大，病死率和感染率較高。最新的幾種非手術(shù)經(jīng)肛門的造模方式相比于傳統(tǒng)開放手術(shù)和灌腸造模法有了一定的改良，在大大降低了小鼠病死率和感染率的同時提高了種植點(diǎn)位的精準(zhǔn)度，但是對設(shè)備有較高的要求，較難進(jìn)行推廣和普及。相信在科學(xué)技術(shù)的不斷升級和推動下，新的方法將會引入到CRC的造模之中，為臨床和科研提供更有利的數(shù)據(jù)支持。