韋 葦 易賢林 廖 海

[1 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學(xué)影像中心/廣西臨床重點(diǎn)?？?醫(yī)學(xué)影像科)/優(yōu)勢(shì)培育學(xué)科(醫(yī)學(xué)影像學(xué)科)，南寧市 530021，電子郵箱：570944612@qq.com； 2 廣西醫(yī)科大學(xué)附屬武鳴醫(yī)院泌尿外科，南寧市 530199]

【提要】 早期診斷、早期治療是改善乳腺癌患者預(yù)后的關(guān)鍵。目前用于篩查和診斷乳腺癌的方法均存在一定的局限性，其中組織活檢只能在診斷穿刺或腫瘤切除時(shí)進(jìn)行，不能反映整個(gè)腫瘤復(fù)雜的分子表達(dá)譜。而液體活檢可以在不同時(shí)間點(diǎn)多次進(jìn)行，可以通過(guò)原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤部位采樣來(lái)確定腫瘤成分及腫瘤起源，模仿腫瘤個(gè)體的結(jié)構(gòu)組合，可用于腫瘤遺傳分析，這有助于乳腺癌的早期診斷、預(yù)后評(píng)估、個(gè)體化治療。本文就液體活檢技術(shù)及其在乳腺癌中應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

乳腺癌是女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤[1]。近年來(lái)，我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率及檢出率逐年上升[2]，嚴(yán)重影響女性的生活質(zhì)量和身心健康。早期診斷、早期治療是降低乳腺癌死亡率、提高患者生活質(zhì)量的關(guān)鍵。乳腺X線鉬靶或超聲是目前篩查乳腺癌的常用手段，但這些檢查均存在一定假陰性和假陽(yáng)性率[3]；乳腺癌組織病理檢查是診斷乳腺癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但其只能在診斷穿刺或腫瘤切除時(shí)進(jìn)行，不能反映整個(gè)腫瘤分子復(fù)雜的表達(dá)譜。因此，需要一種更有效的新方法來(lái)診斷乳腺癌。

隨著分子病理學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)及基因組學(xué)的深入研究，循環(huán)腫瘤標(biāo)志物備受關(guān)注。循環(huán)腫瘤標(biāo)志物包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell，CTC)、循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)、循環(huán)腫瘤RNA(circulating tumor RNA，ctRNA)及腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體等，而目前臨床上采用液體活檢的方法從患者的血液、胸腹腔積液、尿液等標(biāo)本中檢測(cè)這些標(biāo)志物[3]，以達(dá)到診斷疾病的目的。上述循環(huán)腫瘤標(biāo)志物在乳腺癌的早期診斷、進(jìn)展與轉(zhuǎn)移、異質(zhì)性與耐藥性以及預(yù)后療效評(píng)估等方面都發(fā)揮著重要的協(xié)助作用，因此乳腺癌的液體活檢已成為研究熱點(diǎn)之一。本文就液體活檢技術(shù)及其在乳腺癌中應(yīng)用的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為乳腺癌的分子診斷及臨床療效監(jiān)測(cè)等提供新信息。

1 液體活檢技術(shù)及其檢測(cè)的主要循環(huán)腫瘤標(biāo)志物

1.1 液體活檢技術(shù)概述 在原發(fā)性腫瘤形成和生長(zhǎng)、凋亡及壞死過(guò)程中，其各種組分如CTC、ctDNA、ctRNA和外泌體等，可釋放到人體外周體液中[4]。液體活檢通過(guò)檢測(cè)人體體液的各種組分從而獲取相關(guān)疾病的分子信息數(shù)據(jù)，具有可連續(xù)取樣、自動(dòng)化完成及結(jié)果可重復(fù)等諸多優(yōu)點(diǎn)[5]。目前，常用的液體活檢技術(shù)包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)、聚合酶鏈反應(yīng)、生物傳感器技術(shù)、高通量測(cè)序等。酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)、聚合酶鏈反應(yīng)可檢測(cè)蛋白、DNA/RNA的表達(dá)水平；生物傳感器技術(shù)具有超靈敏、免標(biāo)記的特點(diǎn)；高通量測(cè)序多用于基因組、表觀基因組、轉(zhuǎn)錄組等檢測(cè)；高通量納米生物芯片集成系統(tǒng)可快速、同時(shí)和多重檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞囊泡的蛋白質(zhì)、mRNA/微小RNA(microRNA,miRNA)及其組合[6]。上述檢測(cè)技術(shù)均可通過(guò)檢測(cè)患者體液(如尿液、血液、腦脊液及胸腹水等)，觀察病癥(如惡性腫瘤等)相關(guān)特異性蛋白、DNA、RNA等生物標(biāo)志物的表達(dá)變化，從而診斷或輔助診斷疾病及評(píng)價(jià)臨床治療效果。

1.2 液體活檢技術(shù)檢測(cè)的主要循環(huán)腫瘤標(biāo)志物

1.2.1 CTC：CTC是從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤中脫落的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)淋巴系統(tǒng)或血管進(jìn)入血液循環(huán)，這些細(xì)胞可以在腫瘤形成和生長(zhǎng)期間、微轉(zhuǎn)移期間等任何時(shí)間釋放，甚至可以從腫瘤前病變中釋放[7]。在腫瘤轉(zhuǎn)移的早期階段，腫瘤細(xì)胞可發(fā)生侵襲、脫落從而進(jìn)入外周血液循環(huán)，并與原發(fā)性腫瘤具有相似的遺傳或免疫學(xué)特征[8]。但由于機(jī)械因素或人體免疫系統(tǒng)的破壞，只有極少部分CTC能存活并進(jìn)入血液循環(huán)系統(tǒng)，同時(shí)大多數(shù)CTC處于休眠狀態(tài)或增殖能力低下，對(duì)化療藥物耐藥，并可逃避機(jī)體的免疫監(jiān)視[7]。目前認(rèn)為CTC逃避細(xì)胞凋亡和免疫監(jiān)視、抗脫落凋亡的能力可能與上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)[8]，但CTC的具體生存機(jī)制尚不明確。有研究顯示，CTC特異性存在于腫瘤患者體內(nèi)，1 g癌組織每天大約向外周血釋放1×106個(gè)CTC，即使切除原發(fā)性腫瘤，在腫瘤衍生的炎性趨化因子的誘導(dǎo)下，CTC可通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶1、肌成束蛋白1等載體從外周血滲透進(jìn)入組織，返回原發(fā)性腫瘤的發(fā)生部位進(jìn)行克隆性增殖，因此切除原發(fā)性腫瘤后外周血中仍能檢測(cè)到CTC[8]。CTC可應(yīng)用于預(yù)測(cè)癌癥轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，研究顯示，CTC含量越高，轉(zhuǎn)移的可能性越大[9]；檢測(cè)CTC中的相關(guān)基因，可為靶向藥物的選擇提供指導(dǎo)[10]；CTC還可用于預(yù)測(cè)患者對(duì)治療的反應(yīng)及預(yù)后評(píng)估等[11]。

1.2.2 ctDNA：外周血游離DNA和外泌體是兩個(gè)重要的液體活檢生物標(biāo)志物[12]。1977年，Leon等[13]發(fā)現(xiàn)癌癥患者的循環(huán)游離DNA(circulating free DNA,cfDNA)含量顯著高于正常健康人，故猜測(cè)其與癌癥的發(fā)生相關(guān) 。因?yàn)閏fDNA在血液中的濃度較高，其作為液體活檢標(biāo)志物的效果優(yōu)于CTC[14]。在腫瘤患者中，ctDNA是總cfDNA的一個(gè)亞群。ctDNA僅占血漿總cfDNA的一小部分[15]。ctDNA可用于監(jiān)測(cè)正在發(fā)生的腫瘤學(xué)改變，其表達(dá)水平可反映腫瘤突變、表觀遺傳變化和微衛(wèi)星不穩(wěn)定性等基因組學(xué)變化[16]。可通過(guò)靶向和非靶向測(cè)序技術(shù)分析從血液樣品中提取的ctDNA序列，其中靶向測(cè)序可用于分析已知的乳腺癌相關(guān)基因組，而非靶向全基因組測(cè)序可用于識(shí)別未知的新變異。

1.2.3 ctRNA：高代謝率是腫瘤細(xì)胞的一個(gè)關(guān)鍵特征，這需要特定基因的高表達(dá)從而導(dǎo)致大量mRNA的產(chǎn)生，而這些mRNA又可能從細(xì)胞中大量流失。原發(fā)性腫瘤細(xì)胞壞死后可將核酸釋放入血，在血液循環(huán)中凋亡或被人體免疫系統(tǒng)消滅的腫瘤細(xì)胞亦可將核酸釋放入血，其中包含了ctRNA。目前，針對(duì)ctRNA的研究熱點(diǎn)是循環(huán)非編碼RNA，循環(huán)非編碼RNA包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)、環(huán)狀RNA、小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)和核仁小分子RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)、miRNA以及與Piwi蛋白相互作用RNA(piRNA)[8]。

在人類基因組計(jì)劃中，只有約2%的人類基因組編碼蛋白質(zhì)被發(fā)現(xiàn)，而98%的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是非編碼RNA。lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，其可通過(guò)基因沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活等機(jī)制，在多個(gè)不同層面調(diào)控基因表達(dá)，從而調(diào)控癌癥的發(fā)生和發(fā)展并影響癌癥預(yù)后。根據(jù)其功能所涉及的不同分子機(jī)制，lncRNA可分為信號(hào)原型、誘餌原型、引導(dǎo)原型、支架原型等類型。近年來(lái)的研究表明，lncRNA、miRNA和mRNA三者之間可相互作用，lncRNA通過(guò)內(nèi)源性競(jìng)爭(zhēng)性抑制miRNA的表達(dá)，促進(jìn)下游靶基因的表達(dá)，從而發(fā)揮促腫瘤或抑腫瘤的作用[7]。

1.2.4 外泌體：外泌體是細(xì)胞之間溝通的載體，直徑在30～200 nm之間，是細(xì)胞分泌的包裹著DNA、RNA和蛋白質(zhì)的囊泡，具有典型的脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞培養(yǎng)上清液及血清、唾液、尿液等體液中均可存在；腫瘤細(xì)胞分泌的外泌體具有抑制免疫系統(tǒng)、刺激細(xì)胞生長(zhǎng)、促進(jìn)腫瘤血管生成等功能，同時(shí)還參與了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過(guò)程[8]。外泌體含有特定的標(biāo)志蛋白及大量的脂質(zhì)，后者包括膽固醇、磷脂酰絲氨酸和飽和脂肪酸等[17]，分析外泌體脂質(zhì)表面分子抗原還可以確定腫瘤細(xì)胞的來(lái)源。除了蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，外泌體還含有ctDNA、腫瘤mRNA和miRNA等成分，均在腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及細(xì)胞間通訊中發(fā)揮著重要作用[18]。

2 液體活檢在乳腺癌中的臨床應(yīng)用

臨床上，液體活檢可以分析原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者相關(guān)標(biāo)本中的生物標(biāo)志物，可用于早期診斷或復(fù)發(fā)的檢測(cè)。此外，液體活檢可獲得整個(gè)腫瘤基因組信息，可用于鑒定新的遺傳標(biāo)記，并用于患者個(gè)體化基因組分層和定制藥物[3]。

2.1 用于乳腺癌的早期診斷 早期診斷對(duì)于降低乳腺癌死亡率至關(guān)重要；早期乳腺癌通?？梢灾斡?，如果腫瘤<2 cm，早期診斷能明顯提高患者的總體生存率和預(yù)后[19]。此外，乳腺癌的早期診斷可影響治療方案的選擇，而這與患者預(yù)后息息相關(guān)。然而，由于乳腺癌無(wú)特異性癥狀，早期診斷困難較大。多項(xiàng)研究表明液體活檢在有助于在早期發(fā)現(xiàn)乳腺癌。其中，利用液體活檢檢測(cè)外周血ctDNA/cfDNA的水平，可比臨床和放射學(xué)手段提前5個(gè)月診斷乳腺癌[20]。此外，在腫瘤的早期階段，可通過(guò)檢測(cè)體細(xì)胞中ctDNA的突變情況及血漿中的cfDNA水平提高早期診斷的準(zhǔn)確度[21]。還有研究顯示，對(duì)于具有乳腺癌易感基因突變的人群或乳腺癌的高風(fēng)險(xiǎn)人群，采用液體活檢方法可以在更早期進(jìn)行診斷[22]。故為了早期乳腺癌檢測(cè)，需要開(kāi)發(fā)高靈敏度檢測(cè)血漿cfDNA水平的方法。雖然乳腺癌患者cfDNA中確切的腫瘤突變譜尚不清楚，但是研究者們已經(jīng)開(kāi)始通過(guò)篩選大量已知的乳腺癌始動(dòng)基因、鑒定非腫瘤細(xì)胞的體細(xì)胞致癌突變以增加檢測(cè)敏感性。

CTC的檢測(cè)也有助于早期診斷乳腺癌。Kruspe等[23]開(kāi)發(fā)了一種快速、靈敏的熒光核酸酶激活的探針來(lái)檢測(cè)乳腺癌CTC，該方法的原理是對(duì)CTC衍生的核酸酶進(jìn)行信號(hào)擴(kuò)增，這些酶在包括上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的乳腺癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤中升高；結(jié)果顯示，熒光核酸酶激活的探針可用于快速檢查CTC水平，可作為一種經(jīng)濟(jì)有效的乳腺癌早期診斷方法。但CTC應(yīng)用于乳腺癌的診斷及預(yù)測(cè)尚處于早期研究階段，其作用仍有待進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

2.2 用于乳腺癌的復(fù)發(fā)和預(yù)后評(píng)估 由于CTC會(huì)進(jìn)入二級(jí)器官或被從血液中清除，其在外周血中的半衰期非常短(1～2.4 h)[10]。雖然在血液中分離低豐度CTC具有挑戰(zhàn)性，但它們已被證明是預(yù)測(cè)腫瘤預(yù)后的有力工具。Bidard等[11]檢測(cè)了乳腺癌患者血液中CTC的豐度，發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者平均每7.5 mL血液中有5個(gè)或更多的CTC，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)CTC低水平(低于5個(gè)/7.5 mL)患者的疾病無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間和總生存時(shí)間較CTC高水平患者更長(zhǎng)。Madic等[24]探討了三陰性乳腺癌患者的預(yù)后與血漿CTC水平的關(guān)系，也發(fā)現(xiàn)CTC計(jì)數(shù)與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，即CTC計(jì)數(shù)高的患者其總生存期及疾病進(jìn)展時(shí)間更短。因此，CTC可作為潛在的液體活檢標(biāo)志物，為監(jiān)測(cè)患者病情變化提供實(shí)時(shí)信息，有助于對(duì)乳腺癌患者預(yù)后進(jìn)行評(píng)估。

ctDNA也可用于乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的評(píng)估[25]?；蚪M改變(包括多種ESR1基因組改變)有助于評(píng)估復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性乳腺癌，基于ctDNA的基因組分析是一種敏感的檢測(cè)手段[26]。研究表明，ctDNA水平與乳腺癌患者的總體存活率升高相關(guān)，并可定量評(píng)估早期的治療反應(yīng)；對(duì)ctDNA基因組畸變的測(cè)定也可用于輔助預(yù)測(cè)乳腺癌復(fù)發(fā)[3]。Garcia-Murillas等[25]跟蹤檢測(cè)ctDNA以監(jiān)測(cè)早期乳腺癌患者根治性手術(shù)治療后的復(fù)發(fā)情況，發(fā)現(xiàn)多數(shù)(96%)未復(fù)發(fā)患者術(shù)后ctDNA為陰性，ctDNA預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的準(zhǔn)確率為80%(12/15)。另外一項(xiàng)回顧性研究結(jié)果顯示，針對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌，術(shù)后ctDNA水平診斷復(fù)發(fā)情況的準(zhǔn)確率達(dá)到93%～100%[27]。此外，ctDNA可在出現(xiàn)臨床癥狀前7.9～11.0個(gè)月預(yù)測(cè)乳腺癌患者的復(fù)發(fā)情況[25]。

2.3 用于腫瘤間/腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的判斷 干性突變發(fā)生于腫瘤的早期階段并存在于所有的腫瘤細(xì)胞中；相反，在后期轉(zhuǎn)移性腫瘤階段發(fā)生的個(gè)體突變僅發(fā)現(xiàn)于部分腫瘤克隆中[28]?？v向監(jiān)測(cè)和比例分析干性突變有助于腫瘤克隆分層，以及區(qū)分原發(fā)腫瘤部位和轉(zhuǎn)移性腫瘤[28]。乳腺癌的組織活檢只能在診斷穿刺或腫瘤切除時(shí)進(jìn)行，不能反映整個(gè)腫瘤復(fù)雜的分子表達(dá)譜。而液體活檢可以通過(guò)提供個(gè)體化的腫瘤圖譜來(lái)實(shí)現(xiàn)這些功能，即通過(guò)判斷腫瘤間的異質(zhì)性，從而進(jìn)行原發(fā)腫瘤定位。其中，組織特異性甲基化和核小體定位模式可以為原發(fā)性腫瘤的定位提供有價(jià)值的信息。Lehmann-Werman等[29]使用甲基化組數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定組織的特異性cfDNA，其利用硫酸氫鹽來(lái)處理提取的cfDNA，對(duì)其含有特征CpG位點(diǎn)的區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增的cfDNA進(jìn)行了測(cè)序，以確定甲基化模式，然后與甲基化組數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，從而確定從血液中提取的cfDNA的起源組織。

此外，ctDNA突變檢測(cè)可用于判斷腫瘤內(nèi)的異質(zhì)性。De Mattos-Arruda等[30]納入了發(fā)生骨和肝臟轉(zhuǎn)移的浸潤(rùn)性乳腺癌患者，在其接受蛋白激酶B抑制劑進(jìn)行四線治療期間，多次收集血漿來(lái)源的ctDNA用于測(cè)定腫瘤相關(guān)基因，結(jié)果表明，基于ctDNA的大規(guī)模并行測(cè)序是靶向治療期間識(shí)別新發(fā)基因突變和監(jiān)測(cè)體細(xì)胞遺傳變異的潛在方法，這或有助于應(yīng)對(duì)腫瘤內(nèi)異質(zhì)性所帶來(lái)的挑戰(zhàn)。

2.4 用于乳腺癌治療反應(yīng)的評(píng)估 在治療過(guò)程中，腫瘤組織不斷獲得克隆和亞克隆的耐藥細(xì)胞，而液體活檢可在藥物治療期間縱向監(jiān)測(cè)腫瘤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)克隆進(jìn)化[31]。有研究顯示，在治療過(guò)程中可出現(xiàn)雌激素受體1(estrogen receptor 1,ESR1)基因突變，這可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞對(duì)內(nèi)分泌治療產(chǎn)生耐藥性。例如，Beije等[32]納入43例初次接受一線內(nèi)分泌治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者和40例一線內(nèi)分泌治療后進(jìn)展的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，檢測(cè)了CTC和cfDNA中ESR1的突變情況，結(jié)果顯示，與前者相比，后者cfDNA中ESR1突變發(fā)生率升高，提示ESR1突變可導(dǎo)致轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者對(duì)內(nèi)分泌治療產(chǎn)生耐藥性。此外，O′Leary等[33]發(fā)現(xiàn)，在早期乳腺癌患者中，周期蛋白依賴性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)4/6抑制劑治療前后ctDNA中磷脂酰肌醇-3-激酶催化亞基α突變的變化情況可較好地預(yù)測(cè)患者對(duì)CDK4/6抑制劑的反應(yīng)性。由此可見(jiàn)，液體活檢循環(huán)腫瘤標(biāo)志物中相關(guān)基因的突變情況，有助于評(píng)估或預(yù)測(cè)乳腺癌患者的治療效果。

2.5 用于乳腺癌微小殘余病灶的評(píng)估 轉(zhuǎn)移性腫瘤發(fā)生的決定性因素是治愈性手術(shù)和化療后存在乳腺癌微小殘余病灶(minimal residual disease，MRD)。早期檢測(cè)MRD可以最大限度地提高患者的治療效果。從MRD釋放至血液的ctDNA中腫瘤相關(guān)基因發(fā)生了特異性突變，即ctDNA中存在不同于原發(fā)瘤灶的新轉(zhuǎn)移瘤基因圖譜表達(dá)[34]。而這些特異性突變可利用液體活檢來(lái)鑒定。研究表明，對(duì)于已進(jìn)行腫瘤切除術(shù)的乳腺癌患者，檢測(cè)ctDNA和cfDNA有助于這些患者的術(shù)后監(jiān)測(cè)，即尋找MRD，指導(dǎo)臨床切除術(shù)后可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)的任何殘余腫瘤的治療[35]。有學(xué)者使用微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)早期乳腺癌患者手術(shù)前后的血漿ctDNA中PIK3CA基因的突變情況，結(jié)果顯示，14例術(shù)前cfDNA發(fā)現(xiàn)PIK3CA基因突變的患者中，有10例患者進(jìn)行術(shù)后cfDNA檢測(cè)，其中5例在術(shù)后仍可檢測(cè)到PIK3CA突變[36]。這提示，在早期乳腺癌患者手術(shù)前后使用液體活檢技術(shù)檢測(cè)cfDNA有助于評(píng)估術(shù)后殘余腫瘤的情況，這助于臨床醫(yī)師制訂個(gè)性化治療方案進(jìn)行及時(shí)干預(yù)，避免過(guò)度治療。

3 小 結(jié)

盡管目前液體活檢還只能作為乳腺癌的二線診斷手段，但隨著高靈敏度檢測(cè)技術(shù)的進(jìn)步，液體活檢可為乳腺癌傳統(tǒng)組織活檢提供強(qiáng)有力的輔助作用。隨著新的研究不斷開(kāi)展和標(biāo)準(zhǔn)化流程的建立，液體活檢的特異性和靈敏度不斷提高，液體活檢將為乳腺癌的篩查和治療提供更有力的支撐，在臨床上發(fā)揮更重要的作用。