高豐琴，何玉梅，安紅婷，牟 萱

（咸陽(yáng)師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 咸陽(yáng) 712000）

葡萄糖氧化酶可催化氧化β-D-葡萄糖生成葡萄糖酸內(nèi)酯，然后水解為葡萄糖酸和H2O2。該方法檢測(cè)葡萄糖具有靈敏度高、準(zhǔn)確、快速的特點(diǎn)[1]，而且，反應(yīng)中產(chǎn)生的H2O2可以在級(jí)聯(lián)酶反應(yīng)中做氧化劑[2]。近年來，葡萄糖氧化酶法已被廣泛用于臨床、食品、生物技術(shù)、化學(xué)合成等行業(yè)中[3]。但游離酶在高溫和強(qiáng)酸強(qiáng)堿等環(huán)境下很容易因失活而導(dǎo)致催化效率降低，且反應(yīng)后難于回收重復(fù)利用。而固定化酶則可以提高酶的操作穩(wěn)定性、在反應(yīng)體系中容易實(shí)現(xiàn)與底物或產(chǎn)物的分離，可實(shí)現(xiàn)多次重復(fù)使用，從而提高其經(jīng)濟(jì)效益，有利于可持續(xù)發(fā)展[4]。與單酶固定化相比，葡萄糖氧化酶的共固定化由于可以將兩種酶的催化特性結(jié)合起來，充分發(fā)揮每一種酶的特點(diǎn)甚至利用級(jí)聯(lián)反應(yīng)的協(xié)同作用，而使酶的催化效率得以提高，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景[5]。

1 葡萄糖氧化酶與氯過氧化物酶的共固定化

雙酶共固定化，需要選擇合適的固定化載體，并采用合適的固定化方法來實(shí)現(xiàn)雙酶的固定并達(dá)到預(yù)期的功能。Yildirim Nimet等[6]在玻璃基板上采用溶膠-凝膠包埋法固定化葡萄糖氧化酶（GOx）和氯過氧化物酶（CPO），并用于檢測(cè)一種pH敏感熒光染料。在磷酸鹽緩沖pH值為7.0溶液中，反應(yīng)體系的熒光強(qiáng)度與濃度在1.0～30mM范圍內(nèi)的葡萄糖呈線性相關(guān)。相比游離酶GOx/CPO，溶膠-凝膠包埋酶的檢測(cè)靈敏度較高，該研究方法可用于某些飲料中葡萄糖的分析。Campbell Alan S.等[7]以GOx為工作酶、與CPO共固定在羧基功能化的多壁碳納米管（MWNT）上，通過GOx酶促反應(yīng)產(chǎn)生的H2O2可以進(jìn)一步作為底物被共固定化的CPO轉(zhuǎn)化為HOCl。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CPO-MWNT-GOx（CPO共價(jià)、GOx吸附）雙酶反應(yīng)體系中HOCl的速率明顯大于GOx-MWNT-CPO（GOx共價(jià)、CPO吸附）雙酶反應(yīng)體系。該雙酶體系設(shè)計(jì)根據(jù)特定功能將給定的酶排列到相同的納米載體上，使其在納米生物界面上的連續(xù)酶促反應(yīng)成為生物傳感器應(yīng)用的可行性。

許多工業(yè)生產(chǎn)過程可以是由兩種或兩種以上的酶以級(jí)聯(lián)方式協(xié)同工作來催化，但設(shè)計(jì)高效的酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。2000年，Velde Fred van de等[8]在聚氨酯薄膜上通過共價(jià)鍵與載體相連實(shí)現(xiàn)CPO和GOx的共固定，并通過GOx氧化葡萄糖產(chǎn)生的H2O2作氧化劑、CPO做催化劑進(jìn)行光學(xué)異構(gòu)性反應(yīng)苯硫基甲烷磺化氧化。固定酶的操作穩(wěn)定性較好，催化氧化轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，e.e.值達(dá)99%。Jung Dirk等[9]將GOx和CPO的交聯(lián)酶聚集體分別固定于大孔-介孔材料MCF中，并通過GOx氧化葡萄糖在線產(chǎn)生的H2O2實(shí)現(xiàn)吲哚的氧化反應(yīng)（在CPO催化下）。在固定床反應(yīng)器中，進(jìn)行的連續(xù)操作條件下的催化試驗(yàn)證實(shí)，與MCF或SBA-15孔中物理吸附的酶相比，在MCF中的交聯(lián)酶不易泄漏。通過調(diào)控十六烷基三甲基溴化銨的用量合成的具有介孔結(jié)構(gòu)的TiO2薄膜，依據(jù)CPO和GOx不同分子大小合理設(shè)計(jì)孔徑尺寸以形成有序的“占位”效應(yīng)，可以抑制酶的聚集，避免酶活性的降低[10]。當(dāng)CPO和GOx共同固定在同一載體上時(shí)，與等摩爾的游離酶混合物相比，初始催化效率提高了4倍。此外，根據(jù)動(dòng)力學(xué)分析，酶對(duì)底物結(jié)合的親和力得到了提高。與游離酶相比，TiO2-GOx和CPO復(fù)合材料的熱穩(wěn)定性有了很大提高。TiO2-GOx和CPO復(fù)合材料可以很容易地從反應(yīng)介質(zhì)中分離出來，這有助于其循環(huán)使用。這種高效的固定化雙酶對(duì)于固定床酶連續(xù)反應(yīng)操作是一個(gè)很有前景的策略，可用于進(jìn)一步評(píng)估預(yù)期的工業(yè)應(yīng)用。

2 葡萄糖氧化酶與辣根過氧化物酶的共固定化

目前，實(shí)現(xiàn)活性固定化多酶生物催化劑在體外進(jìn)行多步級(jí)聯(lián)反應(yīng)的實(shí)現(xiàn)是一個(gè)極具挑戰(zhàn)性的課題。Pitzalis Federica等[11]以3-氨丙基三乙氧基硅烷功能化SBA-15材料為載體，用戊二醛共價(jià)法共固定化GOx和辣根過氧化物酶（HRP）。共固定化雙酶體系中，GOx氧化葡萄糖產(chǎn)生H2O2，用HRP催化氧化ABTS反應(yīng)。無論采用何種固定化策略，結(jié)果表明，只有保持固定化的雙酶生物催化劑保持濕潤(rùn)，才能保持催化活性。濕潤(rùn)的HRP@SBA-15和干燥的GOx@SBA-15在循環(huán)使用6次后活性損失較高，濕潤(rùn)的GOx/HRP@SBA-15生物催化劑可循環(huán)使用14次仍保持良好的催化活性。用雙酶生物催化劑對(duì)農(nóng)業(yè)廢水中的兩種酚類污染物（咖啡酸和阿魏酸）進(jìn)行了氧化試驗(yàn)，生物催化劑在15min內(nèi)轉(zhuǎn)化率可達(dá)70%。

Ahmad Raneem等[12]將GOx和HRP共固定化于金屬有機(jī)物骨架（MOF）UiO-66和UiO-66-NH2，并用于鄰苯三酚的氧化反應(yīng)。選擇兩種MOF作為固定化酶載體，主要研究MOF連接體的修飾如何影響酶/MOF界面的穩(wěn)定性和酶體系的后續(xù)活性。結(jié)果顯示，兩種酶/MOF體系的催化活性增強(qiáng)，表明金屬有機(jī)骨架固定化酶可以提高協(xié)同體系反應(yīng)活性。與HRP/GOx@UiO-66相比，在HRP/GOx@UiO-66-NH2中的偶聯(lián)劑功能化提高了酶的固載量、活性和穩(wěn)定性。酶固載量和穩(wěn)定性的增加可能是由于胺基增加了MOF表面的靜電吸引力。這項(xiàng)研究從結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系分析，為更好地設(shè)計(jì)生物催化劑提供了理論研究基礎(chǔ)。

將GOx和HRP雙酶被包埋在聚乙烯亞胺（PEI）中，然后固定于碳納米管和芘硼酸組成的基底上[13]。這種結(jié)構(gòu)被認(rèn)為是葡萄糖生物燃料電池（GBFC）的陰極催化劑。通過對(duì)催化劑性能的評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)PEI中的雙酶包埋良好，基底通過形成π-π堆積和縮短電子轉(zhuǎn)移路徑來促進(jìn)電子轉(zhuǎn)移，從而提高了氧還原反應(yīng)的催化活性。當(dāng)采用該催化劑操作膜GBFC時(shí)，可獲得較高的功率密度、良好的儲(chǔ)存穩(wěn)定性和較高的葡萄糖消耗率。可見，雙基底共固定化酶陰極催化劑對(duì)提高GBFC的催化活性和性能起到了主導(dǎo)作用，而且GOx-HRP-PEI的復(fù)雜結(jié)構(gòu)防止了酶分子的變性。

Alim Samiul等[14]報(bào)道了一種新型的葡萄糖生物傳感器，該傳感器將GOx和HRP與SnO2聚合多孔納米纖維共同固定在殼聚糖玻碳電極上。以具有高比表面積和良好導(dǎo)電性的錫前驅(qū)體為原料，采用靜電紡絲法制備了SnO2多孔納米纖維，并與聚苯胺進(jìn)行了聚合。聚合后的納米纖維在促進(jìn)固定化酶的電活性中心與電極表面之間的直接電子轉(zhuǎn)移方面起著重要作用。所制備的生物傳感器的安培響應(yīng)與葡萄糖濃度呈長(zhǎng)程線性關(guān)系，而且生物傳感器響應(yīng)速度快、檢測(cè)限低、具有長(zhǎng)期穩(wěn)定性和重復(fù)性。聚合的多孔納米纖維SnO2有望成為生物傳感器中一種很有前景的納米材料。通過將GOx和HRP共固定在Ketjen Black修飾電極上，Xia Hongqi[15]等構(gòu)建了一個(gè)雙酶電極，將GOx的氧化酶反應(yīng)與HRP作用下的H2O2的直接電子轉(zhuǎn)移型生物電催化還原耦合起來，葡萄糖的安培檢測(cè)靈敏度高、檢測(cè)限低，而且對(duì)于生物燃料電池中的生物陰極，固定化雙酶非常具有優(yōu)勢(shì)。

可穿戴電化學(xué)生物傳感器以非侵入性的方式測(cè)量生物流體中生物化學(xué)小分子的濃度，仍然是人們迫切需要的。Xia Hongqi等[16]利用導(dǎo)電柔性碳納米管-乙烯-醋酸乙烯酯薄膜的層狀結(jié)構(gòu)，在酶電極界面成功地實(shí)現(xiàn)了HRP的直接電子轉(zhuǎn)移。通過將GOx和HRP共同固定在這種多孔CNT-EVA薄膜上，進(jìn)一步制備了具有（270±10）μA·（mM·cm2）-1超高靈敏度的無介質(zhì)可穿戴葡萄糖生物傳感器。由于其高導(dǎo)電性和與皮膚的良好相容性，因此，具有較高的信號(hào)背景靈敏度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該傳感器能夠同時(shí)監(jiān)測(cè)汗液葡萄糖和表面肌電信號(hào)，為今后健康監(jiān)測(cè)、早期診斷和臨床研究提供多種生理信號(hào)。

3 葡萄糖氧化酶與其他酶的共固定化

張柳[17]以Cu3（PO4）2為無機(jī)組份，通過結(jié)合GOx的催化專一性和脂肪酶的催化非專一性，構(gòu)建了一種GOx和脂肪酶雙酶納米花共固定化酶，并將固定化雙酶用于催化烯烴類化合物環(huán)氧化反應(yīng)。由于納米花這種特殊的固定化酶方式，GOx和脂肪酶雙酶負(fù)載率可達(dá)100%。與游離雙酶相比，納米花共固定化雙酶具有更高的催化活性、穩(wěn)定性和可重復(fù)利用性。

惠明等[18]制備出一種HNO3-H2SO4法改性的碳纖維（CF）優(yōu)良固定化酶載體，并用于共固定化GOx和過氧化氫酶（CAT）。雙酶配比GOx∶CAT活力比1∶2、戊二醛交聯(lián)劑體積分?jǐn)?shù)0.2%、交聯(lián)時(shí)間15min，固定化雙酶的酶活回收率為30.6%。固定化酶的性能如熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性、貯藏穩(wěn)定性等均有顯著提高。重復(fù)使用性方面，連續(xù)使用10次后固定化酶殘留酶活為初始酶活的72.4%。該研究反應(yīng)條件溫和，為固定酶生產(chǎn)葡萄糖酸鹽工業(yè)應(yīng)用提供了新思路。

Long Jie[19]采用溶膠-凝膠包埋法對(duì)GOx和β-呋喃果糖苷酶進(jìn)行了共固定化，并對(duì)其后續(xù)的蔗糖生產(chǎn)效率進(jìn)行了研究。共固定化后，酶活力保持85.39%，且固定化雙酶具有良好的操作穩(wěn)定性，連續(xù)重復(fù)使用15次后，其初始活性保持在78.5%以上。在優(yōu)化的條件下，固定化雙酶法合成的蔗糖收率提高到160.8g·L-1，比文獻(xiàn)報(bào)道的要高。溶膠-凝膠共固定化GOx和β-呋喃果糖苷酶具有穩(wěn)定性高、可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，在連續(xù)蔗糖生產(chǎn)中顯示出巨大的工業(yè)應(yīng)用潛力。

4 展望

共固定化雙酶反應(yīng)體系以實(shí)現(xiàn)偶聯(lián)反應(yīng)為契機(jī)，可以根據(jù)固定化雙酶的催化性能和分子結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)，設(shè)計(jì)固定高效、性能穩(wěn)定、協(xié)同催化的固定化雙酶載體，以期達(dá)到精準(zhǔn)共固定化葡萄糖氧化酶和其他酶。此外，共固定化葡萄糖氧化酶的工藝技術(shù)也需進(jìn)一步優(yōu)化，以擴(kuò)大固定化雙酶的應(yīng)用領(lǐng)域。