謝 娜，陸 磊，姬小婷，王丹楊，唐成芳，李子夏，胡 妍，李 旋

（1.西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 陜西 西安 710021；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科 陜西 咸陽(yáng) 712000）

牙髓再生是目前牙齒組織再生中最具挑戰(zhàn)性的課題之一，這是由于牙髓組織穩(wěn)定的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和自身有限的修復(fù)能力所致。隨著現(xiàn)代組織工程技術(shù)的發(fā)展和各種干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)將為年輕恒牙牙髓壞死的治療開(kāi)辟新的研究領(lǐng)域[1]。本實(shí)驗(yàn)中利用人乳牙牙髓干細(xì)胞（Stem cells derived from exfoliated deciduous teeth，SHED）、生物支架材料聚乙丙交酯（PLGA）、人乳牙牙髓干細(xì)胞膜片以及處理過(guò)的牙本質(zhì)基質(zhì)片段在裸鼠體內(nèi)進(jìn)行牙髓再生的實(shí)驗(yàn)研究，以期構(gòu)建出一種適合臨床應(yīng)用的牙髓再生策略，為年輕恒牙發(fā)生牙髓壞死的生物學(xué)治療提供新的參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/c裸鼠（上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司購(gòu)買，西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物房飼養(yǎng)）。

1.2 試劑和器材

1.2.1 主要試劑：DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清（Hyclone，北京）；Ⅰ型膠原酶、Dispase酶（Gibco，美國(guó)）；DSPP單克隆抗體（Santa，美國(guó)）；PLGA（濟(jì)南岱罡生物科技有限公司，山東）。

1.2.2 主要儀器：細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，美國(guó)）；酶聯(lián)檢測(cè)儀（Amersham Biosciences，瑞典）；Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（廈門麥克奧迪有限責(zé)任公司，福建）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 人乳牙牙髓細(xì)胞的獲取、培養(yǎng)和純化：選取臨床中需要拔除的6～8歲兒童滯留的乳前牙（經(jīng)倫理審批會(huì)審批，拔除前患者簽署知情同意書(shū)），在超凈臺(tái)內(nèi)用PBS液沖洗后拔除牙髓組織，浸泡于1:1混合的Ⅰ型膠原酶和Dispase酶中。將牙髓組織剪成0.5～1 mm3大小的組織塊，5% CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育45～60 min。待組織塊完全消化、溶解后轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用含15%胎牛血清的DMEM/F12（培養(yǎng)基中加入100 U/ml青霉素，100 μg/ml鏈霉素和2 mM的L-谷氨酰胺）培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，隨后移至60 mm培養(yǎng)皿中培養(yǎng)。有限稀釋法對(duì)所培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行克隆純化。

1.3.2 牙本質(zhì)基質(zhì)片段的制備

1.3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料獲取：實(shí)驗(yàn)所需的牙本質(zhì)片段來(lái)源于臨床上5～12歲患者所拔除的多生牙（經(jīng)倫理審批會(huì)審批，拔除前患者簽署知情同意書(shū)）。

1.3.2.2 制備實(shí)驗(yàn)所需的牙本質(zhì)基質(zhì)片段：去除牙齒表面的牙周組織，以根尖處為起點(diǎn)，截取長(zhǎng)度約為6～7 mm的牙根，拔除根管內(nèi)的牙髓組織，均勻磨除根管內(nèi)壁的部分前期牙本質(zhì)，擴(kuò)大根管直徑為1～2.5 mm。根管一端用MTA封閉1 mm，另外一端不做任何處理。將所制備的牙本質(zhì)片段分別放入17% EDTA、19%檸檬酸、碘伏和5.25%次氯酸鈉溶液中處理，用PBS漂洗數(shù)次后，置于無(wú)菌PBS液中，37℃的條件下浸泡3～7 d。4℃儲(chǔ)存于DMEM/F12的培養(yǎng)基中備用[2]。

1.3.3 人乳牙牙髓干細(xì)胞膜片的培養(yǎng)：取第3代SHED，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/毫升，用含10% FBS、100 μmol/L的L-抗壞血酸-2-磷酸鹽、2 mmol/ml的L-谷氨酰胺的DMEM/F12培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)14 d。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)前棄去培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，用探針和眼科鑷沿著培養(yǎng)皿的邊緣將所培養(yǎng)的細(xì)胞膜片緩慢的從培養(yǎng)皿底部剝離，將剝離后的SHED細(xì)胞膜片小心折疊為長(zhǎng)約4～5 mm，直徑約為1～2 mm的圓柱體，再置于所制備的牙本質(zhì)基質(zhì)片段的根管內(nèi)，將負(fù)載細(xì)胞膜片的牙本質(zhì)基質(zhì)片段迅速的置入培養(yǎng)皿中，加入培養(yǎng)基后在37℃、5% CO2細(xì)胞孵育箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h，用于后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 細(xì)胞-支架材料復(fù)合物的制備：取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代SHED，待其融合至培養(yǎng)皿底的80%～90%時(shí)，更換為礦化誘導(dǎo)液，體外連續(xù)誘導(dǎo)7 d后胰蛋白酶消化3～5 min，1 000 r/min離心5 min，用不含胎牛血清的礦化誘導(dǎo)液吹打細(xì)胞沉淀，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107個(gè)/毫升，按此密度將50 μl的細(xì)胞懸液接種至已滅菌消毒過(guò)的大小為1.5～2.0 mm3的支架材料PLGA上，將細(xì)胞-材料復(fù)合物置入預(yù)先制備的牙本質(zhì)基質(zhì)片段中，再將其轉(zhuǎn)移至37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育3 h，用于后續(xù)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 實(shí)驗(yàn)分組：分為5組，空白對(duì)照組（單純牙本質(zhì)基質(zhì)片段組）、陰性對(duì)照組（負(fù)載支架材料的牙本質(zhì)基質(zhì)片段組）、SHED-PLGA組（負(fù)載細(xì)胞-支架材料復(fù)合物的牙本質(zhì)基質(zhì)片段組）、SHED細(xì)胞膜片組（負(fù)載細(xì)胞膜片的牙本質(zhì)基質(zhì)片段組）和陽(yáng)性對(duì)照組（臨床上拔除的多生牙，其未作任何處理）。

1.3.6 裸鼠體內(nèi)異位移植實(shí)驗(yàn)：取4周齡雄性裸鼠6只，腹腔麻醉后，在其背部皮膚處剪開(kāi)約10 mm的切口，制備皮下袋，左右兩側(cè)相對(duì)應(yīng)的部位分別隨機(jī)植入不同的實(shí)驗(yàn)組。裸鼠皮下異位移植12周后，取出裸鼠背部皮下組織中植入的復(fù)合物，固定、脫鈣、包埋、切片，進(jìn)行HE染色和DSPP免疫組織化學(xué)法染色。

1.3.7 灰度掃描：利用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，將所得數(shù)據(jù)與陰性對(duì)照組的灰度值相比后，對(duì)所得數(shù)據(jù)利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 人乳牙牙髓細(xì)胞的培養(yǎng)：采用酶解組織塊法對(duì)人乳牙牙髓細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，一般培養(yǎng)24 h后就可觀察到細(xì)胞的偽足已經(jīng)開(kāi)始逐漸伸展（見(jiàn)圖1A），3～5 d后偽足基本上已經(jīng)全部伸展開(kāi)。大多數(shù)完全伸展開(kāi)的人乳牙牙髓細(xì)胞呈長(zhǎng)梭狀，類似于成纖維細(xì)胞的形狀，少數(shù)人乳牙牙髓細(xì)胞為多角形、橢圓形或者呈現(xiàn)出紡錘形（見(jiàn)圖1B）。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察人乳牙牙髓細(xì)胞（100×）

2.2 SHED細(xì)胞膜片的培養(yǎng)：生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第3代SHED用含維生素C的DMEM/F12培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng)7～10 d后，在培養(yǎng)皿的底部，肉眼可見(jiàn)一層成絨狀的白色薄膜，薄膜與培養(yǎng)皿底部緊密貼附，在培養(yǎng)皿邊緣處的薄膜有輕微的卷曲，晃動(dòng)或倒置后薄膜均不會(huì)發(fā)生脫落，此層薄膜即為細(xì)胞膜片。倒置顯微鏡下觀察可見(jiàn)細(xì)胞彼此間連接緊密呈長(zhǎng)梭形，并呈重疊的復(fù)層（見(jiàn)圖2A），細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)至14 d時(shí)，用探針和眼科鑷沿著培養(yǎng)皿的邊緣將所培養(yǎng)的細(xì)胞膜片緩慢的從培養(yǎng)皿底部剝離，所得的膜片出現(xiàn)皺縮，呈現(xiàn)為乳白色的膜狀物，具有一定的厚度和強(qiáng)度（見(jiàn)圖2B）。

圖2 培養(yǎng)的SHED細(xì)胞膜片

2.3 裸鼠體內(nèi)的異位移植

2.3.1 取4周齡的雄性裸鼠6只，用4%的水合氯醛腹腔麻醉后，分別將體外所構(gòu)建的牙本質(zhì)基質(zhì)片段移植入裸鼠的背部所制備的皮下袋中，嚴(yán)密縫合（見(jiàn)圖3）。

圖3 裸鼠皮下移植實(shí)驗(yàn)

2.3.2 HE染色：空白對(duì)照組的根管內(nèi)未見(jiàn)牙髓樣組織生成，僅有裸鼠背部的修復(fù)性組織長(zhǎng)入，長(zhǎng)入的組織中含有完整的血管樣結(jié)構(gòu)（見(jiàn)圖4A～B）；陰性對(duì)照組的根管內(nèi)也未見(jiàn)有牙髓樣組織生成，除了長(zhǎng)入的裸鼠背部的修復(fù)性組織之外，還在根管內(nèi)見(jiàn)到一些未完全降解的支架材料（見(jiàn)圖4C～D）；SHED-PLGA組在根管內(nèi)可見(jiàn)疏松的牙髓樣組織生成，其間有血管穿行，還可見(jiàn)到少量的尚未完全降解的支架材料，原有牙本質(zhì)根管壁最內(nèi)側(cè)有一層不連續(xù)的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞生成，細(xì)胞呈單層排列，并且有少量粉染的牙本質(zhì)基質(zhì)形成，甚至還可見(jiàn)一些成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞突起伸入到新形成的牙本質(zhì)基質(zhì)中（見(jiàn)圖4E～F）；SHED細(xì)胞膜片組在根管內(nèi)也可見(jiàn)一些牙髓樣組織生成，其組織密度介于陽(yáng)性對(duì)照組和SHED-PLGA組之間，血管穿行于其中，在根管壁的最內(nèi)側(cè)也可見(jiàn)到不連續(xù)的單層成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞生成，在新生成細(xì)胞的牙本質(zhì)側(cè)形成了牙本質(zhì)基質(zhì)，有成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的突起伸入到新形成的牙本質(zhì)基質(zhì)中（見(jiàn)圖4G～H）；陽(yáng)性對(duì)照組可見(jiàn)大片呈紅染的牙本質(zhì)，根管內(nèi)的牙髓組織較致密，其中包含完整的血管，在牙本質(zhì)最內(nèi)層有一層淺染的尚未礦化的前期牙本質(zhì)層，緊貼著前期牙本質(zhì)層有復(fù)層排列的柱形成牙本質(zhì)細(xì)胞，其細(xì)胞頂端有細(xì)長(zhǎng)的突起深入到牙本質(zhì)基質(zhì)內(nèi)（見(jiàn)圖4I～J）。

圖4 HE染色結(jié)果

2.3.3 牙本質(zhì)涎磷蛋白免疫組化染色：對(duì)各組樣本進(jìn)行牙本質(zhì)涎磷蛋白免疫組化染色，可見(jiàn)陽(yáng)性對(duì)照組前期牙本質(zhì)對(duì)牙本質(zhì)涎磷蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，組織染色后為棕黃色；成牙本質(zhì)細(xì)胞對(duì)牙本質(zhì)涎磷蛋白也同樣呈陽(yáng)性表達(dá)：細(xì)胞的胞漿為棕黃色著色，胞核復(fù)染后為藍(lán)色；SHED-PLGA組和SHED細(xì)胞膜片組均可見(jiàn)新生的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞和牙本質(zhì)基質(zhì)對(duì)牙本質(zhì)涎磷蛋白呈陽(yáng)性表達(dá)，這與陽(yáng)性對(duì)照組的染色結(jié)果一致；空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組可見(jiàn)根管內(nèi)新生成的組織對(duì)牙本質(zhì)涎磷蛋白呈陰性表達(dá)：細(xì)胞的胞漿未見(jiàn)明顯著色，胞核復(fù)染后為藍(lán)色（見(jiàn)圖5）。

圖5 DSPP免疫組織化學(xué)法染色結(jié)果

2.3.4 灰度掃描結(jié)果分析：利用Motic Med 6.0數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)對(duì)DSPP免疫組化染色結(jié)果進(jìn)行灰度掃描，將SHED細(xì)胞膜片組、SHED-PLGA組和陽(yáng)性對(duì)照組的灰度值與陰性對(duì)照組的灰度值進(jìn)行比較后，對(duì)所得的結(jié)果利用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件采用單因素方差分析后可知SHED細(xì)胞膜片組的組織生成量明顯的多于SHED-PLGA組，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)圖6。

圖6 DSPP免疫組化灰度掃描分析

3 討論

利用組織工程技術(shù)進(jìn)行牙髓再生的實(shí)驗(yàn)研究中，尋找合適的種子細(xì)胞是首先要解決的問(wèn)題之一。牙源性干細(xì)胞與其他組織來(lái)源的干細(xì)胞一樣，都具有自我更新和多向分化的特性，因此可作為種子細(xì)胞應(yīng)用于牙髓再生的實(shí)驗(yàn)研究中。兒童脫落的乳牙屬于廢棄的組織，因而較少涉及倫理以及道德等方面的問(wèn)題，且乳牙具有取材簡(jiǎn)便、對(duì)供體的損傷較少、不容易污染、便于實(shí)現(xiàn)后期自體移植等方面的優(yōu)點(diǎn)，在臨床應(yīng)用中的前景十分廣闊[3-4]。因此，本實(shí)驗(yàn)選用人乳牙牙髓細(xì)胞作為種子細(xì)胞，探討其在牙髓再生應(yīng)用中的可行性。

牙本質(zhì)基質(zhì)片段作為一種純天然的多孔支架材料，本身含有多種有機(jī)成分，如胰島素樣生長(zhǎng)因子（Insulin-like growth factor，IGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（Transforming growth factor-β，TGF-β）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白（Bone morphogenic proteins，BMP）等，這些生長(zhǎng)因子作為牙本質(zhì)和牙髓組織修復(fù)過(guò)程中的重要信號(hào)分子，在組織的生理再生過(guò)程中發(fā)揮著非常重要的作用，因此它與其它化學(xué)合成的支架材料相比具有一定的優(yōu)越性，被廣泛的應(yīng)用于組織工程牙髓再生的實(shí)驗(yàn)研究之中[5-6]。

然而無(wú)論使用任何支架材料作為種子細(xì)胞的載體，細(xì)胞和支架材料負(fù)載的過(guò)程中都存在著以下的問(wèn)題[7-8]：①細(xì)胞外基質(zhì)（Extracellular matrix，ECM）存在的多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子以及蛋白會(huì)因?yàn)橐鹊鞍酌赶@取種子細(xì)胞的過(guò)程中大量破壞，進(jìn)而會(huì)嚴(yán)重影響細(xì)胞的生物學(xué)行為；②細(xì)胞與支架材料復(fù)合的過(guò)程中，接種在支架材料上的細(xì)胞密度有限，也會(huì)影響組織的再生能力；③可降解的支架材料在降解的過(guò)程中會(huì)遺留有一定的空隙，進(jìn)而會(huì)影響組織再生的范圍；④支架材料在體內(nèi)有可能會(huì)和機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)。

由于這些問(wèn)題的存在，具有一定三維立體結(jié)構(gòu)的細(xì)胞膜片技術(shù)被廣泛的應(yīng)用于組織工程的研究之中。細(xì)胞膜片最早由Okano等[9]發(fā)現(xiàn)以來(lái)，因其能最大限度的保護(hù)細(xì)胞膜表面的相關(guān)蛋白、細(xì)胞間相互連接以及細(xì)胞-細(xì)胞外基質(zhì)連接等結(jié)構(gòu)，因此受到廣大學(xué)者們的關(guān)注。細(xì)胞膜片是采用高密度濃度接種細(xì)胞、成膜誘導(dǎo)液以及結(jié)合相關(guān)物理化學(xué)手段，從而構(gòu)建一種富含細(xì)胞外基質(zhì)并且具備一定可操作性以及兼?zhèn)錂C(jī)械強(qiáng)度的細(xì)胞膜片結(jié)構(gòu)[10-11]。本實(shí)驗(yàn)中采用Yang等[2]的培養(yǎng)方法，在培養(yǎng)基中加入了適量的維生素C和L-谷氨酰胺，成功誘導(dǎo)形成了SHED細(xì)胞膜片。

裸鼠背部皮下組織中異位移植12周后，經(jīng)HE染色以及DSPP免疫組化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：SHED細(xì)胞膜片組和SHED-PLGA組均在多生牙的根管內(nèi)生成了包含完整血管的牙髓樣組織，并且在原有的牙本質(zhì)壁上還形成了一層不連續(xù)的鈣化牙本質(zhì)基質(zhì)，緊貼著新生成鈣化組織的內(nèi)側(cè)有一層成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞生成。DSPP免疫組化的灰度掃描分析提示：SHED細(xì)胞膜片組與SHED-PLGA組相比，可以新生出更多成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞并且分泌出更多的牙本質(zhì)基質(zhì)。

究其原因，這可能與細(xì)胞膜片本身所具備的特點(diǎn)有關(guān)[12]：①細(xì)胞膜片是由種子細(xì)胞自身產(chǎn)生的ECM所形成的膜片狀物質(zhì)，種子細(xì)胞在體外通過(guò)條件誘導(dǎo)液誘導(dǎo)后可以在短時(shí)間內(nèi)促使細(xì)胞分泌大量的細(xì)胞外基質(zhì)，從而將細(xì)胞與細(xì)胞之間緊密連接之后形成一種三維立體的膜片狀結(jié)構(gòu)，不需要經(jīng)過(guò)胰蛋白酶消化后獲取種子細(xì)胞，因此對(duì)種子細(xì)胞損傷較??；②細(xì)胞膜片可維持細(xì)胞之間正常的連接，并可最大限度地保持細(xì)胞外基質(zhì)的完整性，膜片本身富含大量的細(xì)胞外基質(zhì)可誘導(dǎo)SHED分化為牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞，從而分泌大量的牙本質(zhì)基質(zhì)，并進(jìn)一步礦化為牙本質(zhì)樣組織，因此細(xì)胞膜片對(duì)于組織工程牙髓再生起到了極其重要作用[13-15]。

但是，SHED細(xì)胞膜片組新生成的組織并沒(méi)有達(dá)到整個(gè)根管充滿，推測(cè)這主要與細(xì)胞膜片在折疊后沒(méi)有具備一定的孔隙結(jié)構(gòu)，因而會(huì)對(duì)新生成組織的血供產(chǎn)生一定的影響，進(jìn)而限制了組織的進(jìn)一步生成。在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中考慮是否可以將所培養(yǎng)的細(xì)胞膜片包裹于支架材料上，這樣既解決了種子細(xì)胞獲取過(guò)程中的損傷問(wèn)題，又為細(xì)胞的生長(zhǎng)提供了一定的空隙，從而為新形成的組織提供必要的條件。

人乳牙牙髓干細(xì)胞是牙科再生醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域中極具潛力的牙源性的成體干細(xì)胞之一，因此對(duì)其的研究具有十分廣泛的意義。目前，對(duì)于發(fā)生牙髓疾病的生物學(xué)治療的最終目標(biāo)是要生成具有活力的牙髓組織。因此，隨著組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，在高效的誘導(dǎo)分子調(diào)控機(jī)制作用下，在不久的將來(lái)，希望可以利用人乳牙牙髓干細(xì)胞和適合的生物支架材料再生出具有活力的牙髓組織，并將其廣泛的應(yīng)用于臨床治療年輕恒牙發(fā)生牙髓壞死的患者之中，為廣大患者帶來(lái)福音。