劉水兵，方文杰，李言凱，張文韜，劉三鳳，陳 彪*

(1.江西農業(yè)大學動物科學技術學院，南昌 330045； 2.江西農業(yè)大學家禽研究所，南昌 330045)

近年來，蛋鴨籠養(yǎng)因其環(huán)境友好、經濟效益高而得到大力推廣[1]。蛋鴨籠養(yǎng)模式解決了蛋鴨污染問題，提高了生物安全性和產品質量；實施標準化生產更具優(yōu)勢[2]。相比蛋鴨單籠飼養(yǎng)，疊層籠飼養(yǎng)密度更大，可進一步提高空間利用率。但高密度飼養(yǎng)下的疊層籠養(yǎng)方式在生產中依然存在包括蛋鴨死亡率上升、種蛋受精率低下、鴨腹水的比例增高、機體應激反應強烈等問題[3-4]。研究表明，蛋鴨上籠1和2 d后應激水平與平養(yǎng)組相比差異較大，不僅造成肝組織一定程度的損傷，而且導致炎癥損傷因子表達增加，但隨著應激時間增加，肝損傷在上籠第4、7、10天后逐漸好轉[2]?；\養(yǎng)應激是一種非病理性慢性應激，蛋鴨對籠養(yǎng)應激的耐受性在很大程度上取決于鴨的應激反應能力?；\養(yǎng)應激反應會降低蛋鴨體重、減少食物攝入并導致直接經濟損失，減少應激造成的經濟損失仍然是籠養(yǎng)蛋鴨養(yǎng)殖業(yè)的主要目標[5]。

代謝組學(metabolomics)是一種基于高通量檢測技術研究在特定條件下細胞、組織或生物體內所有小分子化合物的系統(tǒng)生物學方法[6]。在過去十年里，隨著高通量質譜技術的發(fā)展，代謝組學已被廣泛用于識別標志代謝物，探索潛在的生物化學作用機制[7-8]。特別是代謝組學已廣泛應用于畜牧行業(yè)所涉及的相關研究中，如產品品質[9]、營養(yǎng)調控[10]、遺傳育種[11]、應激[12]等方面。迄今為止，基于組學技術探究疊層籠高密度飼養(yǎng)應激對蛋鴨生產性能影響的研究還未見報道，籠養(yǎng)應激調控蛋鴨繁殖性狀的機制仍不清楚。

基于以上研究背景，試驗以山麻鴨母鴨為研究對象，比較110日齡山麻鴨在平養(yǎng)與疊層籠養(yǎng)模式下第3天個體血漿代謝物的異同，為建立解決蛋鴨籠養(yǎng)應激的新方法提供理論基礎，促進水禽籠養(yǎng)技術的發(fā)展和推廣。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用蛋鴨均由江西天韻農業(yè)開發(fā)股份有限公司提供。試驗蛋鴨在100日齡時運到試驗場地在平養(yǎng)模式下飼養(yǎng)，適應10 d后隨機選15只上籠飼養(yǎng)(四層階梯式籠，籠具規(guī)格：長×寬×高為100 cm×45 cm×50 cm)，第3天隨機挑選平養(yǎng)組(floor-water rearing system，FWR組)和疊層式籠養(yǎng)組(cage-rearing system，CR組)各10只均采用跖骨靜脈采血法采血至抗凝管中。每只采血3 mL，4 ℃ 3 000 r·min-1離心10 min收集上清血漿，分裝后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗儀器與試劑

Triple TOFTM5600高效液相色譜-質譜(high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometer，HPLC-HRMS)聯用儀(配有DBS和MMDF Trigger IDA數據采集系統(tǒng)及MarkerView、PeakView、MetabolitePilot數據分析軟件，美國AB Sciex公司)；Heraeus Fresco17離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)；BSA124S-CW電子天平(德國Sartorius公司)；明澈 D24 UV純水儀(美國Merck Millipore公司)；ACQUITY UPLC HSS T3 1.8 μm，2.1 mm×100 mm色譜柱(美國Waters公司)；超低溫冷凍冰箱(日本，Panasonnic公司)。

甲醇(Methanol)、乙腈(Acetonitrile)購自美國Honeywell公司；甲酸(Formic acid)購自美國SIGMA公司；均為LC-MS級純度。

1.3 LC-MS/MS分析

通過有機試劑沉淀蛋白法對樣本進行代謝物提取，用120 μL預冷的50%甲醇溶液提取20 μL血漿樣品，充分混勻，常溫靜置10 min；提取液于-20 ℃冰箱儲存過夜，將樣品中的蛋白質充分沉淀；4 000×g離心20 min，轉移上清液到96孔板；樣品在-80 ℃冰箱保存，后進行HPLC-HRMS分析。等量取出20個樣品稀釋液混合成QC樣品。對所提取的樣本進行隨機上機排序檢測，在樣品前、中、后分別插入QC樣品作為試驗技術重復評估。

數據采集所用到的液相體系為SCIEX，UK公司的超高壓液相。采集時，ACQUITY UPLC T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm，Waters，UK)色譜柱；柱溫設置為35 ℃，流速為0.4 mL·min-1。采用的流動相為A相：水(1%甲酸)；B相：乙腈(1%甲酸)。洗脫梯度為0～0.5 min，5% B；0.5～7 min，5%～100% B；7～8 min，100% B；8～8.1 min，100%～5% B；8.1～10 min；5% B。

采集所用的高分辨率質譜儀為TripleTOF 5600 Plus(SCIEX，UK)飛行時間質譜。每個樣本進行正負兩種模式采集，正離子模式電壓為5 000 V，負離子模式時為-4 500 V。離子源的氣簾氣壓為30 PSI，氣體1(輔氣)和氣體2(鞘氣)壓力均設置為60 PSI。離子源溫度650 ℃。通過IDA(信息依賴性采集)模式對數據進行采集。詳細方法見參考文獻[13]。

在采集過程中，每20個樣本進行一次質量精度校準。同時，每10個樣本進行一次QC品的掃描。用QC間的質量差距來校正整批試驗的系統(tǒng)誤差。

1.4 多元數據處理和數據分析

首先在XCMS軟件中導入由MSConver軟件轉換原始文件得到的mzXML文件，以達到代謝物峰提取、保留時間矯正的目的；通過CAMERA軟件對代謝物同位素、加和離子進行分析。metaX軟件結合KEGG、HMDB數據庫完成物質注釋。通過in-house圖譜庫對質譜二級碎片數據進行匹配、打分，完成對相似度大于80%的代謝物的提取。通過metaX軟件，去掉在50% QC樣品和80%樣品中缺失的代謝物。利用KNN(k-nearest neighbor)算法補充缺失值，所有樣品通過PQN(probabilistic quotient normalization)算法進行數據歸一化，同時利用QC樣品進行QC-RSC(QC-robust spline batch correction)校正。校正數據后去除在QC樣品中變異系數(coefficient of variation，CV)>30%的代謝物，得到高質量代謝物。詳細方法參照文獻[13]。

1.5 差異代謝物鑒定和通路分析

利用metaX軟件對代謝物結果進行單變量分析和多變量分析。主要方法是通過計算代謝物強度在兩表型間的比值，利用t檢驗進行統(tǒng)計學分析，對檢驗結果作多重檢驗分析，再利用BH(Benjamini-Hochberg)矯正，到q值。同時利用偏最小二乘法判別分析(partial least square discriminate analysis，PLS-DA)，得到每個代謝物的變量重要性(variable importance in projection，VIP)。取差異倍數(Fold-change)ratio≥2或ratio≤1/2、VIP>1、q<0.05為篩選條件得到顯著差異代謝物。

找出差異代謝物KEGG號，通過在線網站MBRole 2.0 (http://csbg.cnb.csic.es/mbrole2/index.php)進行代謝通路富集分析。進入網站上傳需要分析的數據，選擇Annotation、KEGG pathway，Background set選擇分析背景，點擊Enrichment analysis開始進行分析，得出代謝通路富集分析結果。

2 結 果

2.1 代謝物檢測及質控

按照代謝組樣品處理步驟每隔10個樣品插入1個QC樣品，以驗證系統(tǒng)的可靠性。將QC樣本總離子色譜(TIC)疊加比較，結果發(fā)現QC的響應強度和保留時間重疊良好，說明該方法具有較強的穩(wěn)定性。LC-MS獲得的血漿樣品總離子流圖(TIC)如圖1所示，峰間分離良好，表明色譜和質譜條件適用于本研究樣品的測定。

2.2 差異代謝物多元統(tǒng)計分析

2.2.1 差異代謝物PCA分析 為了驗證組內個體的重復性，本研究進行了代謝物質的PCA分析，結果取PC1、PC2二維主成分進行展示。結果如圖2所示，其中第一主成分(PC1)可以解釋原始數據集的18.78%特征，第二主成分(PC2)可以解釋原始數據集14.47%特征。差異代謝離子的主成分分析識別出的離散點聚集，代表相似性較好。在本研究中，PCA結果中不同組樣本間分離明顯，表明組間代謝物發(fā)生了明顯的變化。

2.2.2 差異代謝物PLS-DA分析 PLS-DA分析結果如圖3A所示，CR組和FWR組的主成分模式分離顯著，沒有重疊。通過分析血漿差異代謝物獲得的R2Y為0.99，Q2Y為0.85，這表明該模型能夠反映CR組和FWR組之間99%的差異，并且該模型的差異代謝物預測能力為85%，R2Y和Q2Y均高于0.5，說明當前PLS-DA模型較為可靠。對該模型參數R2和Q2進行置換檢驗，設置檢驗次數為200次。置換檢驗分析結果如圖3B所示，差異代謝物的R2Y值均高于Q2Y值，Q2<0說明沒有過擬合現象。

A. PLS-DA分析結果；B. PLS-DA模型置換檢驗A. Analysis of PLS-DA; B. Permutation test of PLS-DA圖3 CR和FWR組血漿代謝物PLS-DA模型分析Fig.3 PLS-DA model analysis of plasma metabolites of CR and FWR groups

2.2.3 差異代謝物分析 采用單變量分析差異倍數(Fold-change)和t檢驗，進行BH校正得到q-value，結合多變量統(tǒng)計分析PLS-DA得到衡量各代謝物表達模式對各組樣本分類判別的影響強度和解釋能力的VIP值。以表達差異倍數(Fold-change)ratio≥2或ratio≤1/2；VIP≥1.0并結合t檢驗的P值(P<0.05)作為篩選條件尋找顯著性差異代謝物(圖4)。差異代謝物分析共篩選到差異代謝物30種，其中上調表達的差異代謝物14種，下調表達的差異代謝物16種。差異代謝物種類包括甘油磷脂Glycerophospholipids(16種)、脂酰Fatty Acyls(4種)、羧酸及其衍生物Carboxylic acids and derivatives(2種)等物質外，還包括苯丙酸、酚類、有機硫酸及其衍生物、甾醇脂質、嘌呤核苷、有機氧化合物、類固醇和類固醇衍生物、有機磺酸及其衍生物等代謝物(表1)。

灰色代表無顯著差異的代謝物，紅色代表上調代謝物，綠色代表下調代謝物，圖中點的大小代表VIP值Grey dots represent no significant differential metabolites, red dots represent up-regulated differential metabolites, green dots represent down-regulated differential metabolites, the size of the dots in the figure represents the VIP value圖4 CR和FWR組血漿差異代謝物火山圖Fig.4 Volcano plot of plasma differential metabolites of CR and FWR groups

表1 CR組與FWR組的差異代謝物分布

(轉下頁 Carried forward)

為了更直觀地表達樣本之間的關系以及在不同樣本中代謝組的表達差異，通過利用差異代謝物在不同樣品中的表達情況，對每個代謝物的強度值歸一化以聚類熱圖表示(圖5)。聚類熱圖結果表明，CR組和FWR組樣本分別聚類在同一簇中，具有相似表達模式的代謝物聚類在同一簇中，說明組間代謝物相對定量值層次聚類區(qū)分明顯。

2.3 差異代謝物通路富集分析

KEGG通路富集分析結果顯示，上述差異代謝物極顯著富集到初級膽汁酸生物合成、甘油磷脂代謝通路，顯著富集到次級膽汁酸生物合成、?；撬岷蛠喤；撬岽x通路(圖6)，說明這4條代謝通路可能是調節(jié)蛋鴨籠養(yǎng)急性應激的關鍵通路。

圖5 CR和FWR組血漿差異代謝物聚類熱圖Fig.5 Heat map of plasma differential metabolites of CR and FWR groups

圖6 CR和FWR組血漿差異代謝物KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of plasma differential metabolites of CR and FWR groups

3 討 論

應激在人類社會和動物生產中廣泛存在，影響個體的行為、代謝等生命進程。應激是指機體受到外界刺激而產生的一種非特異性反應，分為急性應激和慢性應激[14-15]。應激主要通過下丘腦-垂體-腎上腺軸(hypothalamic-pitutary-adrenal axis，HPA)調節(jié)機體反應[16]。外界刺激作用于機體體表感受器，通過交感神經傳到神經中樞，從而激活HPA軸。HPA軸產生的激素可上調促性腺激素抑制激素(gonadotropin inhibiting hormone，GnIH)抑制促性腺激素釋放激素(gonadotropin-releasing hormone，GnRH)發(fā)揮作用，導致垂體分泌促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone，FSH)和促黃體生成素(luteinizing Hormone，LH)減少，從而抑制動物繁殖[17-18]。

疊層籠養(yǎng)過程中，蛋鴨上籠初期因多種環(huán)境因素的改變會產生強烈的應激反應導致生長緩慢、免疫力下降等，嚴重阻礙了蛋鴨籠養(yǎng)技術的推廣普及[19]。因此，減少應激有利于解決蛋鴨籠養(yǎng)的產蛋性能下降問題。目前，籠養(yǎng)應激導致蛋鴨機體最終代謝通路的變化以及最終代謝物的變化還未見報道。本研究利用LC-MS技術共鑒定出蛋鴨血漿中343種代謝物，其中差異代謝物30種。通過代謝通路富集分析發(fā)現，初級膽汁酸生物合成、甘油磷脂代謝通路發(fā)生極顯著變化，次級膽汁酸生物合成、?；撬岷蛠喤；撬岽x通路發(fā)生顯著變化。

3.1 初級膽汁酸和次級膽汁酸合成通路

膽汁酸主要分為初級和次級膽汁酸兩種。由肝中膽固醇代謝合成的初級膽汁酸是膽汁的主要成分，主要包括由膽固醇合成的膽酸(cholic acid，CA)、熊脫氧膽酸(ursodeoxycholic acid，UDCA)、鵝脫氧膽酸(chenodeoxycholic acid，CDCA)以及其與?；撬岷透拾彼峤Y合的膽酸鹽[20-21]。次級膽汁酸通過初級膽汁酸在腸道菌群作用下合成，其中CA轉化為脫氧膽酸(deoxycholic acid，DCA)，CDCA轉化為石膽酸(lithocholic acid，LCA)[22]。家禽體內主要包含CA、DCA、CDCA以及?；蛆Z脫氧膽酸(taurochenodeoxycholic acid，TCDCA)等膽汁酸[21]。屬于腸-肝軸和微生物-宿主軸交互信號分子的膽汁酸可由肝排到腸道以達到維護腸道屏障及改善腸道菌群的目的，通過次級膽汁酸和短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids，SCFA)等代謝產物腸道菌群可以在腸-肝軸傳遞信號，影響宿主采食和能量代謝[23]。

本研究中，初級膽汁酸合成通路富集到3種差異代謝物，其中膽酸極顯著下調，牛磺酸、甘膽酸極顯著上調。膽酸屬于初級膽汁酸的一種，通過法尼醇X受體(FXR)和G蛋白偶聯受體(TGR5)影響物質吸收和調節(jié)免疫應答、糖代謝、脂代謝和能量代謝、腸道菌群穩(wěn)態(tài)[24-26]。有研究發(fā)現，肝細胞癌發(fā)生的全過程有膽汁酸代謝、腸道菌群以及膽汁酸受體調控通路的參與，肝細胞癌小鼠的肝組織和肝細胞癌患者的血漿和糞便中的甘氨膽酸(glycocholate，GCA)、?；悄懰?taurocholate，TCA)、?；蛆Z脫氧膽酸(taurochenodeoxycholate，TCDCA)等膽汁酸水平顯著升高[27-29]。杜雪兒等[30]在對膽汁酸腸肝循環(huán)過程中所關聯到的轉運蛋白以及FXR對其的調控機制進行綜合闡述的同時認為，腸肝循環(huán)對調節(jié)膽汁酸穩(wěn)態(tài)有重要意義。本研究中籠養(yǎng)蛋鴨受到急性應激后膽汁酸合成下調，可能由于籠養(yǎng)蛋鴨上籠后體重下降、食物攝入減少、機體免疫應答、糖代謝、脂代謝以及腸道菌群受到影響所導致。

3.2 甘油磷脂代謝通路

甘油磷脂是機體內含量最多的磷脂之一，是構成活體細胞膜的主要成分，還參與細胞膜對蛋白質的識別以及信號傳導，包含磷脂酸(phosphatidicacid，PA)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanilamine，PE)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)、磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)、磷脂酰肌醇(phosphatidylinoitide，PI)和磷脂酰甘油(phosphatidylglycerol，PG)等[31]。甘油磷脂可被磷脂酶水解并與細胞膜上G蛋白偶聯受體結合，調節(jié)細胞內信號傳導途徑，并參與如炎癥、免疫和腫瘤等過程[32]。甘油磷脂在細胞增殖、分化和凋亡中同樣起到至關重要的作用[33]。在腦組織中，甘油磷脂代謝產物和鞘脂代謝產物之間的相互作用可能在與神經系統(tǒng)疾病相關的氧化應激的啟動和維持中發(fā)揮重要作用[34]。在高鹽環(huán)境下，酵母會提高甘油磷脂成分、增加細胞膜的完整性來對抗?jié)B透壓應激[35]。在本研究中，甘油磷脂代謝通路富集到2種甘油磷脂，磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine，PC)，磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)。磷脂酰膽堿中LysoPC(24:4)、LysoPC(22:6)、LysoPC(22:5)、LysoPC(22:4)、LysoPC(17:1)、LysoPC(16:2)顯著上調；LysoPC(20:5)、LysoPC(20:3)、LysoPC(16:1)、LysoPC(15:1)、LysoPC(14:1)顯著下調。磷脂酰乙醇胺中LysoPE(22:5)、LysoPE(22:4)顯著上調；LysoPE(20:1)、LysoPE(18:1)、LysoPE(16:1)顯著下調。這些結果表明，籠養(yǎng)急性應激導致蛋鴨血漿中甘油磷脂代謝途徑紊亂，影響機體健康。有研究發(fā)現，黃連解毒湯及其正丁醇組分可通過調節(jié)花生四烯酸代謝通路和甘油磷脂代謝通路緩解小鼠急性潰瘍性結腸炎[36]。

3.3 ?；撬岷蛠喤；撬岽x通路

?；撬?taurine，2-氨基乙磺酸)，是一種廣泛存在于各種組織中的含硫游離氨基酸，可在體內通過蛋氨酸、半胱氨酸合成[37]。?；撬嵩诙喾N代謝和生理過程中發(fā)揮重要作用，如葡萄糖和脂質調節(jié)、能量代謝、抗炎調節(jié)和抗氧化作用[38-39]。張金秋等[40]研究表明，外源性?；撬峥梢蕴岣叩半u腎組織抗氧化水平，改善飼養(yǎng)應激造成的腎組織損傷，進而提高蛋雞的健康水平。近年來研究發(fā)現，?；撬嵩诳箲し矫婢哂蟹e極作用，能有效保護應激機體的神經、心血管、消化系統(tǒng)等[41]。同時，?；撬嵩诮档脱獫{和肝組織膽固醇濃度方面具有顯著作用，這與膽汁酸穩(wěn)態(tài)相關[42]。本研究中，?；撬岷蛠喤；撬岽x通路和膽汁酸代謝通路所富集到的?；撬嵩贔WR組極顯著上調。蛋鴨機體可能通過調整這兩條通路以對抗籠養(yǎng)急性應激。

研究表明，?；撬峋哂休^強的抗氧化能力，可以顯著降低心肌細胞中線粒體的蛋白氧化水平，對基因敲除小鼠的抗氧化應激能力有所提升[43]。本研究中，牛磺酸在受到急性應激后的籠養(yǎng)蛋鴨血漿中上調，說明籠養(yǎng)蛋鴨機體可通過上調血漿中的?；撬嵋缘挚够\養(yǎng)應激。?；撬崮軌蚺c膽酸結合形成牛磺膽酸，隨膽汁排到消化道中，促進脂肪乳化，提高膽固醇、脂溶性維生素等脂溶性物質消化吸收的水平。牛磺酸也可通過增加腸道絨毛高度和降低腸道隱窩深度，以達到維持腸黏膜正常結構，修復熱應激造成的腸道損傷[44]。楊小然等[45]研究發(fā)現，日糧中添加0.1%?；撬峥梢燥@著提高蛋雛鴨的平均日增重，提高肝組織中超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶的活性，總抗氧化能力以及法氏囊和脾臟指數。盧宇等[46]研究表明，日糧中添加牛磺酸可緩解急性熱應激導致的輸卵管損傷，提高機體免疫抗氧化機能。

4 結 論

本研究應用非靶向代謝組學方法研究了籠養(yǎng)蛋鴨急性應激時血漿中代謝物的變化。通過差異代謝物鑒定及通路富集分析發(fā)現，蛋鴨在籠養(yǎng)條件下機體代謝發(fā)生適應性變化。研究結果為深入探討籠養(yǎng)模式影響蛋鴨的健康機制，解決蛋鴨籠養(yǎng)應激奠定理論基礎。