周欣怡，蘭茜，王麗輝

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.西南大學(xué)，重慶 400715）

雞傳染性鼻炎（IC）是由副雞禽桿菌（Avibacterium paragallinarum，A.paragallinarum，又稱副雞嗜血桿菌）引起的一種上呼吸道傳染病，此病可以造成蛋雞產(chǎn)蛋率下降（10%～40%）以及育成雞和肉雞生長(zhǎng)遲緩，給養(yǎng)雞業(yè)造成較大的經(jīng)濟(jì)損失，所以引起了養(yǎng)禽業(yè)的高度重視[1]。按照學(xué)者Page等的分型方法，可將副雞禽桿菌分為A、B和C三個(gè)血清型，各型之間幾乎不產(chǎn)生交叉保護(hù)[2-4]。我國(guó)于1986年首次在北京分離到副雞禽桿菌，而后陸續(xù)在不同省、市、區(qū)分離到副雞禽桿菌，經(jīng)鑒定均為Page A型[5-8]。但副雞禽桿菌的生物學(xué)特性較復(fù)雜，在培養(yǎng)過(guò)程中需加入煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和雞血清，本研究利用搖瓶培養(yǎng)的方法可對(duì)其培養(yǎng)特性進(jìn)行研究，便于后續(xù)適宜疫苗的生產(chǎn)研發(fā)。

1 材料

1.1 菌種

副雞禽桿菌A型菌株C-Hpg-8株，由中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察室保管和供應(yīng)。

1.2 培養(yǎng)基和試劑

多聚蛋白胨、酪蛋白氨基酸、胰蛋白胨大豆瓊脂、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基，均購(gòu)自美國(guó)BD公司；氯化鈉等常規(guī)生化試劑，購(gòu)自北京益利精細(xì)化學(xué)品有限公司；煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），購(gòu)自Roche公司；雞血清，購(gòu)自天津康源生物技術(shù)有限公司。

2 方 法

2.1 培養(yǎng)基的配制

2.1.1 雞肉湯瓊脂培養(yǎng)基

稱取多聚蛋白胨3 g、酪蛋白胨3 g和氯化鈉3 g，溶于1 000 mL雞肉湯中，調(diào)pH至7.2，加入15 g瓊脂，并經(jīng)121℃高壓滅菌15 min。

2.1.2 雞肉湯液體培養(yǎng)基

稱取多聚蛋白胨3 g、酪蛋白胨3 g、氯化鈉3 g和雞肉湯100 mL，加入純化水至1 000 mL，調(diào)pH至7.2，并經(jīng)121℃高壓滅菌15 min。

2.1.3 半合成培養(yǎng)基

稱取多聚蛋白胨1 g、酪蛋白胨3 g、谷氨酸鈉2 g、酵母浸粉1 g、葡萄糖0.6 g和氯化鈉3 g，溶于600 mL水中，115℃滅菌40 min，降至室溫后加入10%無(wú)菌雞血清和0.5%輔酶即成。

2.2 副雞禽桿菌固體培養(yǎng)基的選擇

將副雞禽桿菌A型菌株接種于含1%雞血清的雞肉湯瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇后傳代1次復(fù)壯，再同步接種于半合成培養(yǎng)基和雞肉湯瓊脂培養(yǎng)基上37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h，通過(guò)對(duì)固體培養(yǎng)基上菌落形態(tài)的觀察并從中篩選出適合該菌株生長(zhǎng)的固體培養(yǎng)基。

2.3 副雞禽桿菌液體培養(yǎng)基的選擇

將副雞禽桿菌A型菌株接種于含1%雞血清的雞肉湯瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇后傳代1次復(fù)壯，用接種環(huán)刮取1滿環(huán)菌苔至5 mL磷酸鹽緩沖溶液（PBS，0.01 mol·mL-1）溶液中，吹打使菌體充分混勻。分別向100 mL的半合成培養(yǎng)基、胰蛋白大豆肉湯培養(yǎng)基和雞肉湯液培養(yǎng)基中同步接種100 μL菌稀釋液，置37℃搖床中培養(yǎng)24 h，分別于培養(yǎng)6、12、18 h和24 h時(shí)測(cè)定培養(yǎng)菌液中的活菌數(shù)，并從中篩選出適合該菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。取副雞禽桿菌A型菌在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌數(shù)高峰時(shí)的培養(yǎng)物涂片并革蘭氏染色，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)形態(tài)。

2.4 副雞禽桿菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線的研究

將副雞禽桿菌A型菌株接種于雞肉湯瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇后傳代1次復(fù)壯，用接種環(huán)刮取1滿環(huán)菌苔至5 mL PBS溶液中，吹打使菌體充分混勻。取100 μL加入100 mL雞肉湯液體培養(yǎng)基中，置搖床中37℃振蕩培養(yǎng)24 h。期間每2 h取樣1次，分別進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)、OD600值和pH測(cè)定，繪制生長(zhǎng)曲線。

2.5 搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

2.5.1 不同濃度NAD含量培養(yǎng)基的比較試驗(yàn)

將菌種復(fù)蘇后傳代1次復(fù)壯，用接種環(huán)刮取1滿環(huán)菌苔至5 mL PBS溶液中，吹打使菌體充分混勻。在雞血清濃度為5%的雞肉湯液體培養(yǎng)基中分別添加1、5、10 μg·mL-1和20 μg·mL-1的NAD，置37℃搖床中振蕩培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，在培養(yǎng)18 h時(shí)取副雞禽桿菌A培養(yǎng)物測(cè)定OD600值和活菌數(shù)，從而確定菌種最佳NAD濃度。

2.5.2 不同血清濃度對(duì)活菌數(shù)影響的比較試驗(yàn)

雞肉湯液體培養(yǎng)基121℃滅菌15 min后向其中添加前面確定的最佳濃度NAD（10 μg·mL-1），并分別加入1%、2%和4%的已滅活的雞血清。取復(fù)蘇好的副雞禽桿菌進(jìn)行1次傳代復(fù)壯后，用接種環(huán)刮取1滿環(huán)菌苔至5 mL PBS溶液中，吹打使菌體充分混勻。分別取該懸液100 μL加入到100 mL添加了不同濃度血清的雞肉湯液體培養(yǎng)基中，放入搖床中37℃振蕩培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)菌生長(zhǎng)曲線，在培養(yǎng)18 h時(shí)取副雞禽桿菌A型培養(yǎng)物測(cè)定OD600值和活菌數(shù)，從而確定菌種最佳血清濃度。

2.5.3 培養(yǎng)基滅菌條件對(duì)活菌數(shù)影響的比較試驗(yàn)

分別按照121℃15 min、121℃30 min、121℃60 min、116℃40 min對(duì)雞肉湯液體培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌。待培養(yǎng)基恢復(fù)至室溫后，向其中添加前面確定的最佳濃度的雞血清（2%）和NAD（10 μg·mL-1）。取復(fù)蘇好的副雞禽桿菌A型菌進(jìn)行1次傳代復(fù)壯，然后用接種環(huán)刮取1滿環(huán)菌苔至5 mL PBS溶液中，吹打使菌體充分混勻制得菌懸液。分別取該菌懸液100 μL加入到經(jīng)不同條件滅菌的100 mL雞肉湯液體養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)，在培養(yǎng)18 h時(shí)取培養(yǎng)物測(cè)定OD600值和活菌數(shù)，從而確定液體培養(yǎng)基的最佳滅菌條件。

3 結(jié)果與分析

3.1 副雞禽桿菌固體培養(yǎng)基的選擇結(jié)果

副雞禽桿菌A型菌在幾種固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)不同時(shí)間后的菌落大小見表1。

由表1可知，副雞禽桿菌A型菌適合在雞肉湯瓊脂培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。

表1 培養(yǎng)不同時(shí)間后固體培養(yǎng)基上的菌落大小

3.2 副雞禽桿菌液體培養(yǎng)基的選擇結(jié)果

副雞禽桿菌A型菌在不同的液體培養(yǎng)基中活菌數(shù)見表2。

由表2可知，副雞禽桿菌A型菌在雞肉湯液體培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)狀況優(yōu)于其他培養(yǎng)基。在雞肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18 h后的活菌數(shù)達(dá)到最高為3.2×109cfu·mL-1。

表2 不同液體培養(yǎng)基中的細(xì)菌菌數(shù)

取副雞禽桿菌A型菌在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)至菌數(shù)高峰時(shí)的培養(yǎng)物涂片后，進(jìn)行革蘭氏染色，觀察細(xì)菌的生長(zhǎng)形態(tài)。鏡下可見雞肉湯液體培養(yǎng)基中的菌體飽滿、大小均一，而在其他培養(yǎng)基上其菌落形態(tài)有一定變化。通過(guò)對(duì)菌落形態(tài)、液體培養(yǎng)時(shí)的活菌數(shù)確定雞肉湯液體培養(yǎng)基為最佳液體培養(yǎng)基。

3.3 副雞禽桿菌在液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)曲線的研究

液體培養(yǎng)時(shí)副雞禽桿菌生長(zhǎng)曲線見圖1，培養(yǎng)物OD600值與pH隨時(shí)間變化的規(guī)律見表3。

圖1 副雞禽桿菌A型菌生長(zhǎng)曲線

表3 液體培養(yǎng)時(shí)副雞禽桿菌A型培養(yǎng)物中OD600值與pH隨時(shí)間變化的規(guī)律

由圖1和表3可知，副雞禽桿菌液體培養(yǎng)時(shí)可在16～18 h達(dá)到高峰，其pH下降也較快，至20 h左右時(shí)達(dá)到最低。

3.4 搖瓶培養(yǎng)條件的優(yōu)化

3.4.1 不同濃度NAD含量培養(yǎng)基的比較試驗(yàn)結(jié)果

培養(yǎng)18 h測(cè)定不同NAD添加量對(duì)培養(yǎng)物中活菌數(shù)的影響，結(jié)果見表4。

由表4可知，增加NAD的添加量可顯著提高培養(yǎng)物中的活菌數(shù)，其中添加量為10 μg·mL-1時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)物中的活菌數(shù)均高于低濃度組。但是對(duì)于副雞禽桿菌A型菌，當(dāng)添加量為20 μg·mL-1時(shí)，菌數(shù)的增加有限?？紤]到成本因素，將液體培養(yǎng)時(shí)的NAD添加量定為10 μg·mL-1。

表4 不同NAD添加量對(duì)培養(yǎng)物中活菌數(shù)的影響 cfu·mL-1

3.4.2 不同血清濃度對(duì)活菌數(shù)影響的比較試驗(yàn)

培養(yǎng)18 h測(cè)定不同雞血清添加量對(duì)培養(yǎng)物中活菌數(shù)的影響，結(jié)果見表5。

由表5可知，液體培養(yǎng)基中雞血清的含量可影響培養(yǎng)物中的活菌數(shù)，當(dāng)雞血清的添加量為2%時(shí)，比添加1%時(shí)提高，繼續(xù)提高添加量至4%對(duì)液體培養(yǎng)時(shí)副雞禽桿菌菌數(shù)的影響不大。考慮到生產(chǎn)成本因素，將液體培養(yǎng)基中雞血清的添加量定為2%。

表5 不同雞血清添加量對(duì)培養(yǎng)物中活菌計(jì)數(shù)的影響 cfu·mL-1

3.4.3 培養(yǎng)基滅菌條件對(duì)菌數(shù)影響的比較試驗(yàn)

培養(yǎng)基滅菌條件對(duì)活菌數(shù)的影響見表6。

由表6可知，液體培養(yǎng)基的滅菌條件會(huì)顯著影響細(xì)菌培養(yǎng)物中的活菌數(shù)，滅菌時(shí)間越長(zhǎng)，培養(yǎng)物中的活菌數(shù)越少?？赡苁怯捎谂囵B(yǎng)基中的有效成分在長(zhǎng)時(shí)間的滅菌過(guò)程中被破壞，細(xì)菌無(wú)法利用所致，因此確定最佳滅菌條件為121℃15 min。

表6 培養(yǎng)基滅菌條件對(duì)活菌數(shù)的影響

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)培養(yǎng)基種類、血清的添加量、NAD添加量進(jìn)行優(yōu)化和篩選，結(jié)果表明雞肉湯瓊脂培養(yǎng)基和雞肉湯液體培養(yǎng)基是作為疫苗雞禽桿菌A型株生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基；培養(yǎng)基中NAD的最適濃度為10 μg·mL-1；血清最適添加量為2%，培養(yǎng)基最佳滅菌條件為121℃15 min，搖瓶培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)時(shí)間為18 h。