蔣錦雷

（濮陽市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 濮陽 457000）

分子標(biāo)記在遺傳學(xué)這門學(xué)科發(fā)展過程中有著至關(guān)重要的作用，同時(shí)也是觀賞園藝植物遺傳育種的重要工具。隨著遺傳學(xué)學(xué)科的縱深發(fā)展，遺傳標(biāo)記的種類和數(shù)量也在不斷擴(kuò)充，主要種類包括形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、DNA 標(biāo)記和生化標(biāo)記4 類。其中DNA 標(biāo)記是分子水平遺傳變異的直接反映，而其他三類標(biāo)記都是對(duì)基因的間接反映，并且對(duì)植物各發(fā)育階段都能進(jìn)行精準(zhǔn)的分子鑒定，其數(shù)量豐富且結(jié)果可靠性高。

1 兩大類分子標(biāo)記技術(shù)原理和特點(diǎn)

DNA 分子標(biāo)記是分子水平上遺傳多態(tài)性的直接表現(xiàn)。生物技術(shù)的進(jìn)步和科研成果的運(yùn)用，為觀賞植物遺傳育種提供了基于DNA 多態(tài)性的分子標(biāo)記，該技術(shù)的重要性早已被觀賞植物育種領(lǐng)域所公認(rèn)，其應(yīng)用突出表現(xiàn)：直接以DNA 多態(tài)性形式表現(xiàn)，對(duì)觀賞植物個(gè)體各個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期的細(xì)胞均可檢測(cè)，不受時(shí)間、環(huán)境、取樣部位等條件限制，且可覆蓋到整個(gè)基因組[1]。鑒于多方面的優(yōu)越性，現(xiàn)已大量地應(yīng)用于觀賞園藝植物分子育種研究[2]。

1.1 基于Southern技術(shù)類標(biāo)記

該技術(shù)是利用限制性內(nèi)切酶對(duì)各類DNA分子片段酶切后，用特異性探針進(jìn)行Southern雜交技術(shù)，再通過放射自顯影技術(shù)或非同位素顯色來證明DNA分子的多態(tài)性。其中表現(xiàn)最典型的是發(fā)現(xiàn)最早的RFLP（restriction fragment length polymorphisms）標(biāo)記，它屬于共顯性標(biāo)記，呈孟德爾式遺傳，結(jié)果穩(wěn)定可靠，特別適合于建立連鎖圖譜，不足是RFLP探針的開發(fā)費(fèi)用較高[3]。

1.2 基于PCR技術(shù)類分子標(biāo)記

RAPD（random amplified polymorphic DNA）標(biāo)記。設(shè)計(jì)的隨機(jī)引物由10 個(gè)堿基組成，由該引物對(duì)樣品的全基因組進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得DNA 多態(tài)性條帶。其具有分辨率高、簡(jiǎn)單、成本低等優(yōu)點(diǎn)，因隨機(jī)擴(kuò)增基因組而致使其穩(wěn)定性較差[4]。

SSR（simple sequence repeats）標(biāo)記。該標(biāo)記利用簡(jiǎn)單序列重復(fù)次數(shù)的差異設(shè)計(jì)引物，利用該引物一般檢測(cè)到單一的多等位基因位點(diǎn)，而開發(fā)SSR 引物前期費(fèi)用較高[5]。

AFLP（amplified fragments length polymorphism）標(biāo)記。通過選擇性擴(kuò)增基因組DNA 的酶切片段，為共顯性或顯性，穩(wěn)定性強(qiáng)，結(jié)果可靠[6]。

SRAP（sequence-related amplified polymorphism）標(biāo)記。該標(biāo)記利用基因外顯子里GC 含量不同，同時(shí)啟動(dòng)子和內(nèi)含子里AT 含量不同的特點(diǎn)來設(shè)計(jì)引物，利用該引物對(duì)不同材料的ORFs（open reading frames）進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出多態(tài)DNA 條帶，具有簡(jiǎn)便、穩(wěn)定、便于克隆目標(biāo)片段等特點(diǎn)[7]。

EST（expressed sequence tags）標(biāo)記。該標(biāo)記是通過對(duì)cDNA 文庫(kù)隨機(jī)擴(kuò)增，進(jìn)而對(duì)所得的cDNA 不同端序列進(jìn)行測(cè)序，一般長(zhǎng)度為150 bp～500 bp，易于開發(fā)[8]。

TRAP（target region amplified polymorphism）標(biāo)記。該標(biāo)記依據(jù)生物信息學(xué)及表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）數(shù)據(jù)庫(kù)DNA 信息，找出目標(biāo)候選基因區(qū)，對(duì)照設(shè)計(jì)不同DNA標(biāo)記[8]。

2 遺傳圖譜中常見分子標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用

1）RAPD 標(biāo)記。Debener 等[9]通過運(yùn)用305 個(gè)RAPD 分子標(biāo)記、AFLP 分子標(biāo)記構(gòu)建了一張觀賞植物玫瑰的連鎖圖譜。Peltier 等[10]利用RAPD 分子標(biāo)記和形態(tài)學(xué)標(biāo)記手段構(gòu)建了一張觀賞植物矮牽牛BC1群體的分子圖譜，有7 個(gè)連鎖群，覆蓋基因組長(zhǎng)262.9 cM，平均圖距為8.2 cM。謝偉等[11]利用RAPD 分子標(biāo)記對(duì)春蘭、春劍、蕙蘭進(jìn)行了分子研究，構(gòu)建它們的DNA 分子指紋圖譜，并進(jìn)一步探究了它們的親緣關(guān)系。黃翠娟[12]利用RAPD、SSR 兩種分子標(biāo)記，以F1雜交群體為材料，構(gòu)建了觀賞植物梅花的分子圖譜。黃少玲[13]利用RAPD 標(biāo)記構(gòu)建了一張春石斛分子遺傳圖譜，圖譜包含9 個(gè)連鎖群、121 個(gè)標(biāo)記位點(diǎn)，其總長(zhǎng)度為6 568.7 cM，標(biāo)記間平均距離為50.11 cM。

2）SSR 標(biāo)記。胡興華等[14]以1 個(gè)茶花品種為試材研究不同體系，利用SSR 標(biāo)記構(gòu)建茶花分子指紋圖譜。于超[15]以月季四倍體為材料，構(gòu)建7 個(gè)連鎖群，包含295 個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，總圖距為874 cM，平均圖距為2.9 cM。

3）ISSR 標(biāo)記?？姾惚虻萚16]利用ISSR 標(biāo)記進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，獲得多態(tài)性譜帶114 條，并利用標(biāo)記多態(tài)性構(gòu)建了菊花的指紋圖譜。葛亞英等[17]利用12 條ISSR 引物，以41 個(gè)麗穗鳳梨品種為材料，構(gòu)建了麗穗鳳梨品種的分子指紋圖譜。

4）SRAP 標(biāo)記。潘俊松等[18]以黃瓜自交系S06 與S52 雜交產(chǎn)生的F2群體（共93 個(gè)單株）為作圖群體，應(yīng)用SRAP 標(biāo)記構(gòu)建觀賞黃瓜的分子遺傳框架圖譜。Gao 等[19]利用92 對(duì)SRAP 標(biāo)記，以白姜花與圓瓣姜花雜交的F1個(gè)體為材料，構(gòu)建兩張中等密度的父母本的遺傳圖譜，其中母本連鎖圖有18 個(gè)連鎖群，包含139 個(gè)標(biāo)記，總長(zhǎng)917 cM；父本的連鎖圖有23 個(gè)連鎖群，包含203個(gè)標(biāo)記，總長(zhǎng)1 386.8 cM。Sun等[20]利用SRAP標(biāo)記對(duì)梅花的圖譜進(jìn)行了連鎖研究。

5）多種標(biāo)記的綜合應(yīng)用。以下綜述了常見的十種觀賞園藝植物的分子圖譜構(gòu)建中多種分子標(biāo)記的聯(lián)合應(yīng)用研究。Li 等[6]以羽衣甘藍(lán)與花椰菜的86 個(gè)RI 系個(gè)體為作圖群體，利用SRAP 標(biāo)記、AFLP 標(biāo)記作圖，構(gòu)建了羽衣甘藍(lán)的分子圖譜。Zhang 等[21]利用RAPD、ISSR 和AFLP 三種標(biāo)記初步構(gòu)建了菊花的遺傳連鎖圖譜，共有567 個(gè)標(biāo)記。張飛[22]以142 個(gè)F1為作圖群體，利用RAPD、ISSR 和AFLP 三種標(biāo)記，分別構(gòu)建菊花父母本遺傳圖譜。Bossolini 等[23]以兩個(gè)種間矮牽牛雜交個(gè)體為作圖群體，運(yùn)用SSR 標(biāo)記、AFLP 標(biāo)記構(gòu)建了矮牽牛的分子圖譜，圖譜總長(zhǎng)分別為970 cM和700 cM。潘宏兵[24]利用8個(gè)SSR標(biāo)記、28個(gè)ISSR 標(biāo)記和194 個(gè)SRAP 標(biāo)記，構(gòu)建了石斛遺傳連鎖圖，該圖譜有26 條連鎖群，總圖距為1 548.9 cM，平均圖距為9.91 cM。王萬興[25]利用SSR、SNP 標(biāo)記對(duì)結(jié)球甘藍(lán)的DH 群體進(jìn)行了遺傳圖譜構(gòu)建，覆蓋基因組總長(zhǎng)度為1 197.9 cM，平均遺傳距離和物理距離分別為0.98 cM 和503.3 Kb。唐楠[26]對(duì)郁金香的圖譜研究表明，母本連鎖群有27 條，包含110 個(gè)SNP 標(biāo)記、2個(gè)SSR標(biāo)記、238個(gè)AFLP標(biāo)記，總圖距為1 707 cM，平均圖距為3.9 cM；父本連鎖群有21 條，連鎖群含有99 個(gè)SNP 標(biāo)記、3 個(gè)SSR 標(biāo)記、190 個(gè)AFLP 標(biāo)記，總圖距為1 201 cM，平均圖距3.1 cM。Venkat 等[27]采用Anthurium ornatum“A1”和Anthurium“Eternity”雜交的41 個(gè)F1代單株用于遺傳作圖，共使用三種標(biāo)記，其中有RAPD 標(biāo)記99 個(gè)、ISSR 標(biāo)記21 個(gè)和SRAP 標(biāo)記108 個(gè)，對(duì)兩個(gè)紅掌親本分別構(gòu)建圖譜，母本的圖譜圖距為1 233.5 cM，而父本的圖譜總圖距為1 023.5 cM。蔡長(zhǎng)福[28]采用牡丹的F1代群體中195 株單株為作圖群體，利用SLAF、SSR 標(biāo)記，構(gòu)建了牡丹的分子連鎖圖譜，該圖譜總圖距為1 061.94 cM，平均圖距為0.84 cM。

3 存在的問題及展望

分子標(biāo)記已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于遺傳育種中。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)一步發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)在觀賞園藝植物育種領(lǐng)域的運(yùn)用將更加廣泛。但是現(xiàn)在大多數(shù)試驗(yàn)僅停留在少數(shù)幾種標(biāo)記技術(shù)的應(yīng)用，在以后的研究中如果能把多種標(biāo)記同時(shí)用在一個(gè)試驗(yàn)中，就會(huì)構(gòu)建出飽和度更高的遺傳圖譜。SRAP 和TRAP 標(biāo)記系統(tǒng)是簡(jiǎn)便、高效的標(biāo)記系統(tǒng)，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化，在一次實(shí)驗(yàn)中可產(chǎn)生大量的多態(tài)性片段。SRAP 標(biāo)記可以和RAPD、AFLP 等其他分子標(biāo)記相結(jié)合，構(gòu)建大多數(shù)觀賞園藝植物高度飽和的遺傳圖譜。大量篩選適用于觀賞園藝植物花品種的SSR 標(biāo)記，將是深入開展觀賞園藝花品種指紋圖譜研究必須應(yīng)對(duì)的重要挑戰(zhàn)。在與傳統(tǒng)育種技術(shù)相結(jié)合的基礎(chǔ)上，利用和開發(fā)更為高效的分子標(biāo)記方法（例如EST-SSR 標(biāo)記）成為觀賞園藝植物標(biāo)記育種研究的重點(diǎn)之一。