譚小兵 ，張 敏 ，郭 宇 ，杜琳玲 ，戴青原

（1）云南省第一人民醫(yī)院口腔醫(yī)學(xué)中心/昆明理工大學(xué)附屬醫(yī)院，云南 昆明 650032;2）昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，云南 昆明 650032）

自從誘導(dǎo)性多能干細胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）產(chǎn)生以來，它在細胞移植治療、藥物篩選和人類疾病模型等方面的應(yīng)用前景就受到廣泛關(guān)注[1-3]。iPSCs 的應(yīng)用正逐漸走向臨床研究，探索用于各種疾病的細胞治療，如帕金森、黃斑變性、脊髓損傷等[4]。制約其進一步應(yīng)用的一大瓶頸就是較低的重編程效率[5]，而微小RNA（microRNAs，miRNAs）在體細胞重編程中的調(diào)控作用逐漸受到重視[6]。牙源性細胞易于獲取、重編程效率高，采用仙臺病毒誘導(dǎo)可得到安全性能較高的iPSCs，是理想的種子細胞[7]。前期研究[8]分析人牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs）重編程過程miRNAs 的表達譜，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p 明顯上調(diào)，提示它可能通過調(diào)控iPSCs 核心基因在重編程中發(fā)揮作用。為明確miR-130b-3p 對人DPSCs 重編程的作用，本研究擬用miR-130b-3p 轉(zhuǎn)染DPSCs，再用仙臺病毒體系進行誘導(dǎo)，提出如下假說：miR-130b-3p 可以促進DPSCs 的重編程，為進一步探索miR-130b-3p 的作用機制提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器和材料

α-MEM 培養(yǎng)基、胎牛血清、Vitronectin、TriZol 試劑盒、iPS 2.0Sendai reprogramming kit 購自美國Invitrogen；Lipofectamine 3000 試劑購自美國ThermoFisher；PSCeasyII 人多潛能干細胞培養(yǎng)基、PSCeasy 人多潛能干細胞消化液、Repro-Easy 重編程培養(yǎng)基購自北京賽貝生物；一步法RT-PCR 試劑盒購自天根生化科技（北京）；hsamiR-130b-3p-mimics 質(zhì)粒由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；倒置相差顯微鏡購自德國Carl Zeiss。

本研究方案得到云南省第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準同意實施（2018LH051）。

1.2 實驗方法

1.2.1 人DPSCs 復(fù)蘇培養(yǎng)復(fù)蘇凍存的DPSCs（第3 代），完全培養(yǎng)液：αMEM+10%胎牛血清 +1% L-谷氨酰胺+1%青/鏈霉素，37 ℃、5%二氧化碳恒溫孵育箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2 miR-130b-3p 轉(zhuǎn) 染（1）miR-130b-3pmimics 質(zhì)粒的構(gòu)建：設(shè)計合成LV3-shRNA DNA模板，退火處理，取10 μg LV3 載體進行酶切處理，構(gòu)建LV3-shRNA 載體、氯化鈣法制備感受態(tài)細胞、轉(zhuǎn)化連接產(chǎn)物、抽取質(zhì)粒、EcoRI 進行單酶切鑒定，陽性克隆進行測序鑒定，測序正確的菌株進行抽提，所得質(zhì)粒用于后續(xù)實驗；（2）has-miR-130b-3p-mimics 轉(zhuǎn)染DPSCs：取1 mL DPSCs（濃度1×105/mL）鋪于6 孔培養(yǎng)板，30-50%融合時將7.5 μL Lipofectamine 3000 試劑加入250 μL MEM，同時將2.5 μg 質(zhì)粒（分組：miR-130b-3p 空載組和過表達組）和10 μL P3000 試劑加入250 μL MEM，各取上述預(yù)混液125 μL 混勻，室溫孵育15 min，然后加入細胞，12 h 后換成正常完全培養(yǎng)基，48 h 后顯現(xiàn)較強熒光時收集細胞，RT-qPCR 進行驗證；（3）RT-qPCR 檢測基因表達：RT-qPCR 對照組 為 DPSCs+miR-130b-3p-NC，實驗組為DPSCs+miR-130b-3p-mimics。轉(zhuǎn)染48 h后加入Trizol 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，設(shè)計合 成hsa-miR-130b-3p 引 物（CAGUGCAAUGAUGAAAGGGCAU），qPCR 檢 測基因的表達，實驗結(jié)果用2^-△△CT法進行分析，U6 作為內(nèi) 參（F：CTCGCTTCGGCAGCACA，R：AACGCTTCACGAATTTGCGT）。

1.2.3 2 組DPSCs 的重編程實驗組為miR-130b-3p 轉(zhuǎn)染DPSCs，對照組為正常DPSCs，嚴格按照重編程試劑盒說明書進行操作，簡述如下：轉(zhuǎn)染前2 d 將2 組細胞鋪在6 孔板內(nèi)（1×105/孔）培養(yǎng)，當天（第0 天）培養(yǎng)基內(nèi)加入70 μL SeV，隔天再加入130 μL 新鮮培養(yǎng)基，第2 天將培養(yǎng)基換為DPSCs 培養(yǎng)基，第3 天將轉(zhuǎn)染細胞轉(zhuǎn)移到Vitronectin 覆蓋培養(yǎng)板，加入Repro-easy 培養(yǎng)基，每日換液?？寺〕霈F(xiàn)且大小合適時，將克隆分割為小塊，PSC-easy 培養(yǎng)基（加10 mM Y27632）繼續(xù)培養(yǎng)。80%左右融合時，人多潛能干細胞消化液進行傳代，人多潛能干細胞培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)，每日換液。

1.2.4 2 種DPSCs-iPSCs 的鑒定（1）形態(tài)學(xué)觀察：2 組iPSCs 克隆形態(tài)對比。（2）逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）：TriZol 試劑盒提取2 種iPSCs 總RNA，一步法RT-PCR 試劑盒檢測基因的表達。簡述如下：細胞80%融合時，加入適量TriZol 提取細胞總RNA，配制50 μL 反應(yīng)體系，引物序列，見表1。反應(yīng)條件：42 ℃ 30 min（逆轉(zhuǎn)錄）、95 ℃ 3 min（預(yù)變性）、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s（40 次循環(huán)，擴增）、72 ℃ 5 min（補充延伸），反應(yīng)產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳，染色成像。

表1 RT-PCR 特異性引物的序列Tab.1 Specific primer sequences of RT-PCR

1.2.5 重編程效率比較比較2 組iPSCs 的重編程效率，計算公式：iPSCs 克隆數(shù)/轉(zhuǎn)染細胞數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

GraphPad Prism 軟件（8.0）分析數(shù)據(jù)和制圖，計數(shù)資料2 組間比較采用卡方檢驗，計量資料2組間比較采用t檢驗，P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-130b-3p 轉(zhuǎn)染DPSCs

miR-130b-3p 轉(zhuǎn)染48h 后可見目標細胞內(nèi)明顯的熒光染色，見圖1A、圖1B，實驗組miR-130b-3p 的表達水平顯著高于對照組（P＜ 0.01），見圖1C。

圖1 miR-130b-3p-mimics 轉(zhuǎn)染DPSCs 效率驗證Fig. 1 Validation of DPSCs transfection efficiency by miR-130b-3p-mimics

2.2 2 種iPSCs 形態(tài)和標記物表達

2 組iPSCs 均表現(xiàn)為特征性致密的圓形克隆，邊緣清晰、集落內(nèi)部細胞圓形、形態(tài)均一、核質(zhì)比較大，RT-PCR 結(jié)果證實所2 組iPSCs 均可表達干細胞特異標志物Oct4、Nanog，同時外源性病毒SeV 或轉(zhuǎn)錄因子KOS/Klf4/c-Myc 不再表達，見圖2。

圖2 2 組iPSCs 克隆形態(tài)和特異性標記物的表達Fig. 2 Morphology and specific markers expression of iPSCs in two groups

2.3 重編程效率

2 組DPSCs 轉(zhuǎn)染前約為1×105個細胞，重編程后正常組獲得約18 個ES 樣克隆（效率=0.018%），對照組獲得約37 個克?。ㄐ?0.037%），高于正常組（檢驗水準α=0.05，P＜0.05）。

3 討論

早期研究發(fā)現(xiàn)，miR-130b-3p 通過直接抑制干擾素調(diào)節(jié)因子1 影響M1 巨噬細胞的極化[9]，也可直接抑制色域解旋酶DNA 結(jié)合蛋白9 影響結(jié)腸直腸癌細胞的增殖，從而促進腫瘤的發(fā)生和進展[10]，但其在體細胞重編程過程中的作用機制尚未報道。本研究所用Lipofectamine 3000 轉(zhuǎn)染試劑采用脂質(zhì)納米顆粒技術(shù)，尤其是對難以轉(zhuǎn)染的干細胞可以實現(xiàn)超高的轉(zhuǎn)染效率，筆者的研究結(jié)果也證實這一點。前期生信分析結(jié)果提示miR-130b-3p 可能對DPSCs 的重編程有調(diào)控作用。為驗證這一假說，筆者首先在人DPSCs 內(nèi)過表達miR-130b-3p，再用仙臺病毒進行重編程成功得到miR-130b-3p-DPSCs-iPSCs，其克隆形態(tài)、特異性干細胞基因表達和外源性基因沉默等特性與正常DPSCs-iPSCs 相同，且具有更高的重編程效率，但克隆的生長速度較為緩慢。Sendai virus 重編程系統(tǒng)是一種RNA 非整合重編程技術(shù)，不會結(jié)合到宿主細胞染色體或破壞宿主基因，采用單克隆挑選和無飼養(yǎng)層培養(yǎng)技術(shù)得到的iPSCs 生物應(yīng)用的安全性得到提高，本研究結(jié)果與Ye[11]和Okumura 等[12]結(jié)果一致。

多項研究已發(fā)現(xiàn)miRNAs 在體細胞重編程的重要調(diào)控作用。Lin 等[13]研究發(fā)現(xiàn)miR-302 可以替代傳統(tǒng)轉(zhuǎn)錄因子OSKM，將人和小鼠體細胞重編程為iPSCs。miR-302 作為基因沉默，同時可下調(diào)多個關(guān)鍵的表觀調(diào)節(jié)蛋白，誘導(dǎo)產(chǎn)生全基因組脫甲基化。miR-302 結(jié)合AOF2/1 和MECP1/2的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，形成RNA 誘導(dǎo)、帶有阿爾古蛋白和Dicer 核糖核酸內(nèi)切酶的沉默復(fù)合體以抑制這些關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白的轉(zhuǎn)錄。Lin 等[14]進一步研究發(fā)現(xiàn)miR-302 靶向沉默AOF2 以破壞DNMT1 活性，抑制iPSCs 復(fù)制相關(guān)DNA 甲基化，發(fā)生被動性去甲基化。從某種意義上說，重編程發(fā)生的機制就是全基因組的去甲基化[15]。miR-302 誘發(fā)重編程事件的機制可能為：一是抑制4 個表觀調(diào)節(jié)蛋白KDM1、AOF1、p66/MECP1 和MECP2 的表達；二是作用于TGF-β II 型受體，阻斷TGFβ 信號通路，加速間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化過程；三是靶向結(jié)合BMP 抑制劑TOB2、DAZAP2、SLAIN1，從而激活BMP 信號通路，促進iPSCs 的產(chǎn)生。

其他研究也證實miRNAs 對體細胞重編程的重要調(diào)控作用。Miyoshi 等[16]聯(lián)合應(yīng)用miR-200c、miR-302、miR-369（無OSKM 因子），成功將大鼠和人細胞重編程為iPSCs。其他研究也發(fā)現(xiàn)更多的與重編程和iPSCs 多能性相關(guān)的miRNAs 及其靶基因的相互作用，包括miR-290 簇、miR-let7家族、miR-130/301/721 家族、miR-106b-25/miR-106a-363、miR-181 家族等[17]。最新研究發(fā)現(xiàn)miR-27b 可以抑制未分化hiPSCs 的多能性標記物堿性磷酸酶和Nanog 同源異構(gòu)體的表達和細胞增殖，而過表達miR-27b 可下調(diào)BMP 誘導(dǎo)的中胚層標記物，表明miR-27 可以抑制iPSCs 的早期分化[18]。另一項研究通過生物信息學(xué)分析、雙熒光素酶報告和基因敲除實驗證實miR-34c 通過靶向c-Myc 可以影響iPSCs 細胞的增殖和多能性[19]。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)miR-130b-3p 過表達可以促進人DPSCs-iPSCs 的生成，同時保持iPSCs 的生物學(xué)特性，為人們進一步了解miRNAs調(diào)控體細胞重編程的作用機制及干細胞治療提供研究基礎(chǔ)。深入比較2 組iPSCs 在多向分化潛能、核型分析、核心蛋白表達、表觀遺傳特性等方面的差異，同時研究miR-130b-3p 促進人DPSCs重編程生成的作用機制將是筆者下一步的研究內(nèi)容。