張 靜，孫藝璇，李艷君

解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 檢驗(yàn)科，北京 100048

隨著航運(yùn)經(jīng)濟(jì)發(fā)展，海上船只越來(lái)越多。海上環(huán)境高溫高濕、淡水缺少，作業(yè)人員蔬菜水果攝入少，長(zhǎng)期疲勞，容易導(dǎo)致機(jī)體的代謝能力和免疫功能降低，菌群分布發(fā)生變化。體表菌群的分布不同可能影響長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員的健康狀況，從而在一定程度上影響海上作業(yè)能力[1-3]。菌群是指可以肉眼可見(jiàn)細(xì)菌或真菌形成的集團(tuán)，正常菌群是指對(duì)人類(lèi)無(wú)害的微生物群落，一般會(huì)在人的身體或健康動(dòng)物的皮膚、 黏膜以及人體與外界相通的各種腔道中發(fā)現(xiàn)，其數(shù)量大、種類(lèi)較穩(wěn)定[4-5]。菌群與人類(lèi)疾病存在密切的聯(lián)系，菌群平衡被打破就會(huì)出現(xiàn)菌群失調(diào)，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。本研究應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)，對(duì)長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員不同航行階段的咽部菌群測(cè)序進(jìn)行種類(lèi)和豐度分析，了解長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員咽部菌群分布以及隨航行時(shí)間變化特征，為深入探討隨航癥狀以及某種疾病與菌群微生態(tài)相關(guān)性提供依據(jù)，進(jìn)而為航海人員疾病的預(yù)防治療以及后續(xù)深入研究積累基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 采集2017年9月- 2018年1月30名長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員在印度洋海域執(zhí)行任務(wù)期間的咽部拭子，人員年齡20 ～ 53歲，男性18名，女性12名。其中包括醫(yī)療保障人員8名、船員8名、機(jī)組人員8名和后勤保障人員6名。采集的時(shí)間為航行前、航行中1個(gè)月、航行中3個(gè)月和航行中4個(gè)月，分別命名為1、2、3、4組，共120份樣本，-80℃冰箱保存。

2 儀器與試劑 Qubit@2.0熒光計(jì)(Thermo Scientific)；安捷倫生物分析儀2100 ions5tmxl；移液器；生物安全柜；Illumina Miseq測(cè)序儀；GeNeJET凝膠提取試劑盒(Turo SeaCo)。

3 基因組DNA提取 將拭子的棉簽頭剪下置于2 mL離心管，加入400 μL裂解緩沖液1；加入20 μL蛋白酶K和400 μL裂解緩沖液2，渦旋震蕩15 s，充分混勻；56℃靜置10 min，12 000 r/min離心(下同)15 s；加入400 μL無(wú)水乙醇振蕩混勻，倒入吸附柱，離心1 min，棄廢液；加入500 μL漂洗緩沖液1，離心1 min后棄廢液；加入500 μL漂洗緩沖液2，離心3 min后棄廢液；再次離心1 min；將吸附柱放入新的離心管，加入50 μL洗脫緩沖液，室溫放置5 min；離心1 min收集DNA。采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA的純度和濃度，取適量樣品于離心管中，使用無(wú)菌水稀釋樣品至1 ng/μL。

4 PCR擴(kuò)增 以稀釋后的DNA樣本作為模板，根據(jù)序列中的保守區(qū)域設(shè)計(jì)相應(yīng)引物，使用特異性Barcode序列，進(jìn)而對(duì)特定基因片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為高保真PCR反應(yīng)液15 μL，引物0.2 μmol/L，模板DNA 10 ng，共30 μL體系，擴(kuò)增條件為98℃ 1 min (98℃ 10 s，50℃ 30 s，72℃ 30 s) 30個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。

5 產(chǎn)物純化 在PCR產(chǎn)物中加0.8倍的磁珠，震蕩充分懸浮后在磁力架上吸附5 min，用移液槍吸出上清；加入20 μL 0.8倍磁珠洗滌液，吸上清；加200 μL 80%乙醇，反向放置；待乙醇揮發(fā)完全，磁珠出現(xiàn)裂縫；加入25 μL洗脫液，室溫放置5 min，充分吸附，移出上清到干凈離心管中保存。

6 文庫(kù)構(gòu)建和上機(jī)測(cè)序 已經(jīng)構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)，評(píng)估合格后，使用Illumina平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。高通量測(cè)序得到的原始圖像數(shù)據(jù)文件，經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列，其中包含測(cè)序序列(Reads)的序列信息以及其對(duì)應(yīng)的測(cè)序質(zhì)量信息。

7 數(shù)據(jù)分析 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接、過(guò)濾，得到有效數(shù)據(jù)，按照QIIME2 dada2分析流程進(jìn)行序列可操作分類(lèi)單元(operational taxonomic units，OTU)聚類(lèi)，再進(jìn)行物種分類(lèi)分析。根據(jù)聚類(lèi)結(jié)果，一方面對(duì)每個(gè)序列做物種注釋?zhuān)玫綄?duì)應(yīng)的物種信息和基于物種的豐度分布情況。同時(shí)，采用ASVs進(jìn)行豐度分析，以得到樣本內(nèi)物種豐富度和均勻度信息，使用方差分析(analysis of variance，ANOVA)對(duì)分組樣本的物種組成和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

結(jié) 果

1 四組咽部菌群在門(mén)水平的構(gòu)成 120份樣本測(cè)序結(jié)果，4份樣本測(cè)序失敗。剩余測(cè)序結(jié)果分析，四組樣本在界門(mén)綱目科屬種水平的ASV數(shù)量見(jiàn)圖1，116份樣本在界門(mén)綱目科屬種水平的ASV數(shù)量見(jiàn)圖2。菌群門(mén)水平主要有厚壁菌門(mén)(Firmicutes)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes)、放線菌門(mén)(Actinobacteria)、梭桿菌門(mén)(Fusobacteria)、變形菌門(mén)(Proteobacteria)、疣微菌門(mén)(Verrucomicrobia)、藍(lán)藻門(mén)(Cyanobacteria)和糖細(xì)菌門(mén)(Glycobacteria)(圖3)。其中厚壁菌門(mén)豐度最高，在四組中占比依次為30%、28%、31%、38%；擬桿菌門(mén)豐度次之，在四組中占比依次為34%、35%、27%、23%。厚壁菌門(mén)和擬桿菌門(mén)在所有樣本中占比為32%和30%，此外放線菌門(mén)和梭桿菌豐度占比也較高(圖4)。

圖1 四組咽部菌群的主要分布(橫坐標(biāo)為組別，Time1 Sep、Time2 Oct、Time3 Dec和Time4 Jan分別代表1、2、3和4組；縱坐標(biāo)為分類(lèi)水平的ASV數(shù)量)Fig.1 Distribution of pharyngeal flora in the four groups (The abscissa indicates groups, Time1 Sep, Time2 Oct, Time3 Dec and Time4 Jan represent group 1, 2, 3 and 4; The ordinate is the number of ASV)

圖2 116份樣本咽部菌群的分布特征(橫坐標(biāo)為116份樣本；縱坐標(biāo)為分類(lèi)水平的ASV數(shù)量)Fig.2 Distribution characteristics of pharyngeal flora of the 116 samples (The abscissa is the 116 samples; The ordinate is the number of ASV)

圖4 116份樣本在門(mén)類(lèi)水平物種注釋豐度分布(橫坐標(biāo)為116份樣本；縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度百分比)Fig.4 Species abundance distribution of phylum in the 116 samples (The abscissa is the 116 samples; The ordinate is the relative abundance percentage)

2 四組咽部菌群在屬水平的構(gòu)成 菌群屬水平主要有普氏菌(Prevotella)、擬桿菌屬(Bacteroides)、瘤胃球菌屬(Ruminococcaceae)、奈瑟菌屬(Neisseria)、嗜血桿菌屬(Haemophilus)、乳酸桿菌屬(Lachnobacterium)和厭氧球菌屬(Anaerococcus)。厚壁菌門(mén)中，瘤胃球菌屬豐度占比最高；擬桿菌門(mén)中，擬桿菌屬和普氏菌屬豐度占比最高；梭桿菌門(mén)的梭形菌屬、放線菌門(mén)的雙歧桿菌屬豐度占比較高(圖5、圖6)。厚壁菌門(mén)擁有最高的豐度，菌群也最具多樣性，其中梭菌綱和芽孢桿菌綱也有較高的豐度(圖5、圖6)。

圖5 四組咽部菌群主要屬的分布(橫坐標(biāo)為組別，Time1 Sep、Time2 Oct、Time3 Dec和Time4 Jan分別代表1、2、3和4組；縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度百分比)Fig.5 Genus distribution of pharyngeal flora in four groups (The abscissa indicates groups, Time1 Sep,Time2 Oct, Time3 Dec and Time4 Jan represent group 1, 2, 3 and 4; The ordinate is the relative abundance percentage)

圖6 116份樣本在屬類(lèi)水平物種注釋豐度分布(橫坐標(biāo)為116份樣本；縱坐標(biāo)為相對(duì)豐度百分比)Fig.6 Species abundance distribution of genus in the 116 samples (The abscissa is the 116 samples; The ordinate is the relative abundance percentage)

3 四組咽部菌群變化趨勢(shì) 在門(mén)水平，四組的平均相對(duì)豐度對(duì)比發(fā)現(xiàn)，厚壁菌門(mén)4組＞3組＞1組＞2組，1組與4組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；擬桿菌門(mén)1組＞2組＞3組＞4組，1組與4組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；放線菌門(mén)4組＞3組＞2組＞1組，1組與4組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)；變形桿菌門(mén)平均相對(duì)豐度在3組時(shí)最高(圖7)。在屬水平，普氏菌屬平均相對(duì)豐度最高，2組＞1組＞3組＞4組，2組相對(duì)豐度最高；雙歧桿菌屬，4組＞3組＞2組＞1組，4組相對(duì)豐度最高；放線菌屬3組＞1組＞4組＞2組，3組豐度最高；棒桿菌屬平均相對(duì)豐度在3組時(shí)最高(圖8)。

圖7 門(mén)類(lèi)水平主要菌的變化趨勢(shì)(橫坐標(biāo)為物種分類(lèi)；縱坐標(biāo)為平均相對(duì)豐度，Time1 Sep、Time2 Oct、Time3 Dec和Time4 Jan分別代表1、2、3和4組)Fig.7 Trends in major bacteria of phylum (The abscissa is species classification; The ordinate is the relative abundance, Time1 Sep, Time2 Oct, Time3 Dec and Time4 Jan represent group 1, 2, 3 and 4)

圖8 屬類(lèi)水平主要菌的變化趨勢(shì)(橫坐標(biāo)為物種分類(lèi)；縱坐標(biāo)為平均相對(duì)豐度，Time1 Sep、Time2 Oct、Time3 Dec和Time4 Jan分別代表1、2、3和4組)Fig.8 Trends in major bacteria of genus (The abscissa is species classification; The ordinate is the relative abundance, Time1 Sep, Time2 Oct,Time3 Dec and Time4 Jan represent group 1, 2, 3 and 4)

討 論

本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)，使用Illumin測(cè)序平臺(tái)對(duì)116份咽部樣本進(jìn)行測(cè)序分析，研究人體咽部菌群的構(gòu)成和分布特征。研究顯示，長(zhǎng)航人員咽部菌群在門(mén)水平有厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、梭桿菌門(mén)、變形菌門(mén)、疣微菌門(mén)、藍(lán)藻門(mén)和糖細(xì)菌門(mén)，在屬水平有普氏菌、擬桿菌屬、瘤胃球菌屬、奈瑟菌屬、嗜血桿菌屬、乳酸桿菌屬和厭氧球菌屬。隨著航行時(shí)間增加，菌群結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，菌群豐度多樣性分析顯示，航行過(guò)程中隨著航行時(shí)間的增加放線菌門(mén)持續(xù)增加，擬桿菌門(mén)持續(xù)減少，厚壁菌門(mén)先減少后增加，變形菌門(mén)先增加后減少。同時(shí)發(fā)現(xiàn)菌群有增減，如新增了綠彎菌門(mén)、遠(yuǎn)洋球菌和硬腦膜放線菌，疣微菌門(mén)逐漸消失。普氏菌屬和放線菌屬航行開(kāi)始后增加，分別在航行開(kāi)始后1個(gè)月和航行后3個(gè)月最高，之后開(kāi)始減少，雙歧桿菌屬和棒桿菌屬逐漸增多。在長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員咽部菌群中厚壁菌門(mén)占主導(dǎo)，擬桿菌門(mén)次之。分析原因有以下幾點(diǎn)：1)樣本來(lái)自長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員，隨行人員數(shù)量有限；2)環(huán)境影響，作業(yè)人員長(zhǎng)期處于高溫高濕的海洋生態(tài)環(huán)境中，極大影響了菌群的結(jié)構(gòu)變化；3)測(cè)序方法，采用Illumina平臺(tái)，所得的數(shù)據(jù)更全面詳細(xì)。

與航行前相比，航行1個(gè)月咽部出現(xiàn)噬纖維菌綱、鞘氨醇桿菌綱、厭氧繩菌綱、海洋桿菌屬、脫硫弧菌屬等水源性微生物，與正常人群咽部菌群構(gòu)成差異。其中硝化螺旋菌是一類(lèi)革蘭陰性菌，對(duì)水中植物非常重要，缺少會(huì)造成水生環(huán)境破壞，可導(dǎo)致魚(yú)類(lèi)死亡[6-7]。雙歧桿菌屬呈進(jìn)行性升高，所占比例高于正常人群，分析原因可能在航行過(guò)程中補(bǔ)充了此類(lèi)食物。雙歧桿菌是一種益生菌影響宿主的健康，在作業(yè)人員飲食中增加含有雙歧桿菌的酸奶，可避免缺少該種菌對(duì)身體造成不適[8-9]。

研究顯示，正常人咽部菌群主要有厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、梭桿菌門(mén)和變形菌門(mén)[10]。本研究長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員咽部菌群與正常人群基本一致，但新增藍(lán)藻門(mén)。藍(lán)藻門(mén)主要分布在淡水和海水中，長(zhǎng)期接觸易引起皮炎和中毒[11-13]。其次，隨著航行時(shí)間增加，擬桿菌門(mén)逐漸減少，疣微菌門(mén)航行后期逐漸消失。此外，糖細(xì)菌門(mén)是正常人群口腔微生物菌落的共生成員，在航海人員咽部比例增加。一些文獻(xiàn)報(bào)道航海人員口腔疾病多發(fā)[14-15]，糖細(xì)菌門(mén)的增加更易誘發(fā)航海人員口腔疾病。長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員工作繁重，缺少休息，導(dǎo)致機(jī)體免疫力降低，且長(zhǎng)期處于海上環(huán)境，心理上容易產(chǎn)生焦慮或抑郁[16-17]。以上因素均會(huì)影響菌群的代謝和生長(zhǎng)，導(dǎo)致咽部菌群結(jié)構(gòu)和多樣性發(fā)生變化，條件致病菌增加，從而影響長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員身體健康[18-19]。近年來(lái)，針對(duì)長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員咽部菌群研究較少，現(xiàn)階段我們對(duì)菌群的認(rèn)識(shí)不夠深入，針對(duì)文中面臨的問(wèn)題，綜合考慮以下幾點(diǎn)：采用新一代高通量測(cè)序法，增加標(biāo)本檢測(cè)數(shù)量，得到全面準(zhǔn)確的菌群變化特征，進(jìn)一步確認(rèn)低豐度的菌群，發(fā)現(xiàn)更具代表性的菌群[20]；將菌群分布及豐度變化特征與人員隨航癥狀和某些疾病進(jìn)行關(guān)聯(lián)，深入探討菌群微生態(tài)對(duì)長(zhǎng)航過(guò)程中疾病的相關(guān)性；通過(guò)服用某些益生菌干預(yù)菌群結(jié)構(gòu)變化，合理搭配飲食平衡，改善癥狀或預(yù)防治療疾病[21]。本研究重點(diǎn)采用高通量測(cè)序技術(shù)，在獲得咽部菌群多樣性方面積累了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對(duì)后續(xù)深入研究長(zhǎng)遠(yuǎn)航人員咽部菌群具有重要意義。

致謝：對(duì)項(xiàng)目組成員在標(biāo)本采集、標(biāo)本保存、實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析提供的幫助表示最誠(chéng)摯的謝意！