吳小穎，陳彤華，邢增麗，黃 霞，邢雪鳳

1 四川大學(xué)華西三亞醫(yī)院 婦產(chǎn)科，海南三亞 572000；2 海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 產(chǎn)科，海南?？?71000

宮頸癌是全球最致命的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病人數(shù)逐年增加，且85%的死亡病例發(fā)生在發(fā)展中國家[1-2]。盡管宮頸癌治療已取得了很大進(jìn)步，但患者的預(yù)后普遍較差[3]。微小RNA-25-3p(microRNA-25-3p，miR-25-3p)是與腫瘤密切相關(guān)的miRNA，在子宮內(nèi)膜癌和三陰乳腺癌等惡性腫瘤中被報(bào)道為促癌因子[4-5]；而在食管癌惡性腫瘤中被報(bào)道為抑癌因子[6]；在宮頸癌中miR-25-3p通過逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)增強(qiáng)宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感度[7]。鋅指E盒結(jié)合的同源盒蛋白2(zinc finger E-box binding homeobox 2，ZEB2)屬于結(jié)合E-box的鋅指蛋白家族，在腫瘤發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮多種作用[8]。ZEB2在宮頸癌中高表達(dá)，并促進(jìn)宮頸癌的增殖和侵襲能力[9]。miRNA主要是通過調(diào)控其靶基因發(fā)揮生物學(xué)作用[10]。我們采用Target Scan7.1軟件預(yù)測ZEB2是miR-25-3p的靶基因，而miR-25-3p能否通過靶向ZEB2在宮頸癌進(jìn)展中發(fā)揮作用尚不清楚。本研究旨在分析miR-25-3p與ZEB2在宮頸癌中表達(dá)的臨床意義和相關(guān)性，并進(jìn)一步分析miR-25-3p調(diào)控ZEB2在宮頸癌中的作用。

資料與方法

1 研究對象 納入四川大學(xué)華西三亞醫(yī)院2013年1月- 2014年12月治療的宮頸癌患者84例，獲取病理組織。另收集因良性疾病切除的正常宮頸組織40例作為對照組。所有患者或家屬均簽署知情同意書，本研究由四川大學(xué)華西三亞醫(yī)院倫理委員會(huì)審核通過。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)經(jīng)病理檢查確診患有宮頸癌；2)入組前未進(jìn)行手術(shù)、化療、放療等抗腫瘤治療；3)患者臨床病理資料和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)患有其他器官原發(fā)和轉(zhuǎn)移腫瘤；2)合并有心、肝、腎等重要臟器功能障礙；3)合并有血液系統(tǒng)疾病、免疫功能障礙。

2 研究對象分組及觀測指標(biāo) 以實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-25-3p、ZEB2 mRNA的相對表達(dá)量。統(tǒng)計(jì)患者5年隨訪資料，隨訪方式為門診復(fù)查和電話隨訪，分析患者的5年總生存(overall survival，OS)率。分組設(shè)計(jì)：1)按照miR-25-3p在宮頸癌組織中平均的相對表達(dá)量0.7為界，將84例宮頸癌患者分為miR-25-3p≥0.7高表達(dá)組(39例)和miR-25-3p＜0.7低表達(dá)組(45例)。2)以ZEB2 mRNA在宮頸癌組織中平均相對表達(dá)量1.33為界，將84例宮頸癌患者分為ZEB2 mRNA≥1.33高表達(dá)患組(43例)和ZEB2 mRNA＜1.33低表達(dá)組(41例)。3)根據(jù)ZEB2蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)情況將其分為ZEB2蛋白高表達(dá)組(48例)和ZEB2蛋白低表達(dá)組(36例)。

3 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器 TRIzol?試劑，日本Takara公司；陶瓷研缽，河北鼎盛隆華實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；三氯甲烷、異丙醇和乙醇，天津風(fēng)船試劑有限公司；EP管和槍頭，美國Axygen公司；DEPC水，北京索萊寶公司；Nanodrop2000分光光度儀，美國Thermo公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，美國Fermentas公司；OneStep RT-PCR Kit試劑盒，德國QIAGEN公司；miR-25-3p、ZEB2和內(nèi)參GAPDH引物，上海捷瑞生物工程有限公司；7500熒光定量PCR儀，美國ABI公司；DAB顯色試劑盒，丹麥DAKO公司；ZEB2一抗，美國proteintech公司。HeLa細(xì)胞，上?？茖W(xué)院細(xì)胞庫；細(xì)胞培養(yǎng)基、FBS和胰酶，美國Gibco公司；miR-25-3p mimic、ZEB2-wt(野生型)和ZEB2-質(zhì)粒mut(突變型)，上海吉?jiǎng)P基因有限公司；MTS試劑，英國Abcam公司；Boyden小室，美國BD公司。

4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測miR-25-3p、ZEB2 mRNA的相對表達(dá)量 將凍存的上述患者手術(shù)組織標(biāo)本放入研缽中研磨成組織粉末后，加入TRIzol?試劑將組織移至EP管中，加入三氯甲烷混勻，靜置后高速低溫離心30 min，吸取上層上清液移至新的EP管中，加入等體積的異丙醇混勻后高速低溫離心30 min，乙醇洗1次，加入DEPC水溶解RNA，經(jīng)Nanodrop2000測得其濃度。按照Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以85℃ 5 s，37℃15 min反應(yīng)條件將RNA逆轉(zhuǎn)為cDNA。以cDNA為模板，按照OneStep RT-PCR Kit試劑盒以95℃30 s和40個(gè)60℃ 30 s，72℃ 30 s循環(huán)進(jìn)行PCR反應(yīng)。7500熒光定量PCR儀檢測各個(gè)樣品的循環(huán)閾值(threshold cycle，Ct)。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，用2-ΔΔCt法 計(jì) 算miR-25-3p、ZEB2 mRNA的相對表達(dá)量。引物序列，miR-25-3p引物F：5′-CATTGCACTTGTCTCGGTCTGA-3′，R：5′-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3′；ZEB2引物F：5′-CAAGAGGCGCAAACAAGCC-3′，R：5′-GGTTGGCAATACCGTCATCC-3′；內(nèi)參GAPDH引物F：5′-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3′，R：5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。

5 免 疫 組 化(immunohistochemical，IHC)檢測ZEB2蛋白的表達(dá) 石蠟包埋的4 μm切片在60℃下烘烤2 h，采用二甲苯脫蠟15 min，放置遞減的乙醇進(jìn)行水化，放置枸櫞酸鈉修復(fù)液中高壓100℃煮3 min進(jìn)行抗原修復(fù)。PBS洗3次，每次5 min，采用10%山羊血清孵育石蠟切片30 min進(jìn)行非特異性抗原封閉，與ZEB2一抗4℃孵育過夜。PBS洗3次，每次5 min，與二抗孵育30 min。PBS洗3次，每次5 min，添加DAB顯色液進(jìn)行顯色。顯微鏡下觀察顯色，出現(xiàn)棕色時(shí)，將切片浸入蒸餾水中終止反應(yīng)。放置蘇木素中染色2 min，放置遞增的乙醇中脫水并固定。對染色結(jié)果進(jìn)行評分：1)腫瘤組織中陽性腫瘤細(xì)胞的百分比：0(0)，1(1% ～ 10%)，2(11% ～ 50%)，3(51% ～70%)和4(71% ～ 100%)；2)染色強(qiáng)度：0(無)，1(弱)，2(中)，3(強(qiáng))。染色分?jǐn)?shù)為陽性腫瘤細(xì)胞的比例 × 染色強(qiáng)度(0 ～ 12)。＞6分為ZEB2高表達(dá)，≤6分為ZEB2低表達(dá)。

6 HeLa細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 宮頸癌細(xì)胞HeLa復(fù)蘇后重懸至含有10% FBS的高糖培養(yǎng)基，放置細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)。每隔1 d更換1次培養(yǎng)基，48 h采用胰酶消化，進(jìn)行細(xì)胞傳代。以1.5 × 105/孔的細(xì)胞密度接種至6孔板中，分為NC組、miR-25-3p mimic組和miR-25-3p + oe-ZEB2組，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。NC組轉(zhuǎn)染lip2000和NC mimic，miR-25-3p mimic組轉(zhuǎn)染lip2000和 miR-25-3p mimic，miR-25-3p + oe-ZEB2組轉(zhuǎn)染lip2000和miR-25-3p mimic、ZEB2過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

7 miR-25-3p靶向調(diào)控ZEB2的檢測 Target Scan7.1軟件(http://www.targetscan.org)預(yù)測miR-25-3p與ZEB2的3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)。HeLa細(xì)胞以4 000/孔的細(xì)胞密度鋪至96孔板中，培養(yǎng)24 h后，NC + ZEB2-wt組細(xì)胞轉(zhuǎn)染lip2000和NC mimic、ZEB2-wt質(zhì)粒，miR-25-3p mimic + ZEB2-1-wt組細(xì)胞轉(zhuǎn)染lip2000和miR-25-3p mimic、ZEB2-wt質(zhì)粒，NC + ZEB2-mut組細(xì)胞轉(zhuǎn)染lip2000和NC mimic、ZEB2-mut質(zhì)粒，miR-25-3p mimic + ZEB2-mut組細(xì)胞轉(zhuǎn)染lip2000和miR-25-3p mimic、ZEB2-mut質(zhì)粒，放置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后更換培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染48 h后采用雙熒光素酶報(bào)道基因檢測試劑檢測各組細(xì)胞熒光素酶活性。

8 MTS實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖 收集NC組、miR-25-3p mimic組和miR-25-3p + oe-ZEB2組細(xì)胞，以1 500/孔的細(xì)胞密度接種至96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，放置細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)12 h后，每孔加入20 μL MTS試劑，并在細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，采用全酶標(biāo)儀檢測樣品在490 nm處的OD值(吸光度值)。

9 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲 收集NC組、miR-25-3p mimic組和miR-25-3p + oe-ZEB2組細(xì)胞，無血清細(xì)胞洗3次后，以1.5 × 105/孔的細(xì)胞密度接種至96孔板中，每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，放置細(xì)胞孵育箱中培養(yǎng)0 h、24 h、48 h和72 h后，每孔分別加入20 μL MTS試劑，并在細(xì)胞孵育箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h后，采用全酶標(biāo)儀檢測樣品在490 nm處的OD值(吸光度值)。

10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較兩組間的差異；多組間比較采用單因素方差分析，多組間的兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以Kaplan-Meier生存曲線及l(fā)og-rank檢驗(yàn)，分析miR-25-3p和ZEB2的表達(dá)水平對宮頸癌患者預(yù)后的影響。Pearson線性相關(guān)分析宮頸癌組織中miR-25-3p與ZEB2表達(dá)的相關(guān)性，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 研究對象一般情況 患者的平均年齡為(57.38±10.98)歲，≤55歲33例，＞55歲51例；組織類型：鱗癌60例，腺癌24例；組織學(xué)分級：低級39例，中高級45例；腫瘤直徑：≤4 cm 50例，＞4 cm 34例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移：有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例；肌層浸潤深度：淺肌層55例，深肌層29例；脈管癌栓：有脈管癌栓21例，無脈管癌栓63例；FIGO分期：Ⅰ ～Ⅱ期40例，Ⅲ ～ Ⅳ期44例。對照組平均年齡為(56.58±12.06)歲，≤55歲16例，＞55歲24例。

2 宮頸癌組織中miR-25-3p、ZEB2表達(dá)水平與患者臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系 miR-25-3p在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與患者的年齡、組織類型、組織學(xué)分級、腫瘤直徑和脈管癌栓均無關(guān)(P＞0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤深度和FIGO分期相關(guān)(P＜0.05)。ZEB2 mRNA及蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與患者的年齡、組織類型、腫瘤直徑、肌層浸潤深度和脈管癌栓均無關(guān)(P＞0.05)，與組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期相關(guān)(P＜0.05)。見表1。

表1 miR-25-3p和ZEB2在宮頸癌組織中的表達(dá)水平與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系Tab. 1 Relationship between expression levels of miR-25-3p and ZEB2 in cervical cancer and clinicopathological parameters

3 宮頸癌組織中miR-25-3p、ZEB2表達(dá)水平對患者預(yù)后的影響 84例宮頸癌患者中死亡55例，存活29例，5年總生存(overall survival，OS)率為34.52%。miR-25-3p高表達(dá)組的5年OS率為43.59%，miR-25-3p低表達(dá)組的5年OS率為26.67%，低表達(dá)組預(yù)后較差(P＜0.05)。ZEB2mRNA高表達(dá)組5年OS率為25.58%，ZEB2 mRNA低表達(dá)組5年OS率為43.90%，高表達(dá)組預(yù)后較差(P＜0.05)。ZEB2蛋白高表達(dá)組5年OS率與mRNA組趨勢一致。見表2，圖1。

圖1 Kaplan-Meier生存曲線分析miR-25-3p和ZEB2表達(dá)對宮頸癌患者預(yù)后的影響Fig.1 Kaplan-Meier survival curve analysis of the effect of miR-25-3p and ZEB2 expression on the prognosis of cervical cancer patients

表2 不同miR-25-3p、ZEB2 mRNA、ZEB2蛋白表達(dá)水平宮頸癌患者生存比較(n, %)Tab. 2 Comparison of survival of cervical cancer patients with different levels of miR-25-3p, ZEB2 mRNA and ZEB2 protein expression (n, %)

4 qRT-PCR檢測miR-25-3p、ZEB2 mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)水平 qRT-PCR檢測84例宮頸癌組織和40例宮頸正常對照組織中miR-25-3p、ZEB2 mRNA的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，miR-25-3p在宮頸癌組織中的表達(dá)(0.70±0.22)顯著低于其在宮頸正常對照組織中的表達(dá)(1.00±0.26)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.687，P=0.000)。ZEB2 mRNA在宮頸癌組織中的表達(dá)(1.33±0.43)顯著高于其在宮頸正常對照組織中的表達(dá)(1.00±0.31)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.864，P=0.000)。

5 IHC檢測ZEB2蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)水平 IHC檢測84例宮頸癌組織和40例宮頸正常對照組織中ZEB2蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，ZEB2 蛋白在宮頸癌組織中高表達(dá)率為57.14%(48/84)，顯著高于其在宮頸正常對照組織中的高表達(dá)率32.50%(13/40)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=6.584，P=0.010)。見圖2。

圖2 IHC檢測ZEB2蛋白的表達(dá)(200×)Fig.2 Expression level of ZEB2 protein detected by IHC (200×)

6 miR-25-3p與ZEB2 mRNA、ZEB2蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性 Pearson相關(guān)分析顯示，miR-25-3p與ZEB2 mRNA、ZEB2蛋白在宮頸癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.671，P=0.000；r=-0.592，P=0.000)。見圖3。

圖3 宮頸癌組織中miR-25-3p和ZEB2相對表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)散點(diǎn)圖(n=84)Fig.3 Scatter diagram of relative expression of miR-25-3p and ZEB2 in cervical cancer (n=84)

7 miR-25-3p對ZEB2的靶向調(diào)控作用 Target Scan7.1軟件在線預(yù)測顯示ZEB2的3’UTR區(qū)與miR-25-3p具有結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)道基因試驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC + ZEB2-wt共轉(zhuǎn)染組相比，miR-25-3p + ZEB2-wt共轉(zhuǎn)染組的熒光素酶活性降低(P＜0.05)，而NC + ZEB2-mut和miR-25-3p +ZEB2-mut組間的熒光素酶活性無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。見表3。

表3 各組熒光素酶活性Tab. 3 Luciferase activity in each group

8 qRT-PCR檢測miR-25-3p mimic和ZEB2過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效果 qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，NC組和miR-25-3p mimic組細(xì)胞中miR-25-3p的表達(dá)分別為1.03±0.04和6.54±1.29，與NC組相比，miR-25-3p mimic組細(xì)胞中miR-25-3p表達(dá)顯著增加(t=7.395，P=0.002)，miR-25-3p mimic成功轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞。NC組、miR-25-3p mimic組和miR-25-3p + oe-ZEB2組細(xì)胞中ZEB2的表達(dá)分別為1.04±0.03、0.52±0.14和0.73±0.08，與NC組相比，miR-25-3p mimic組細(xì)胞中ZEB2的表達(dá)顯著降低(LDS-t=6.726，P=0.001)，表明miR-25-3p負(fù)調(diào)控ZEB2的表達(dá)。與miR-25-3p mimic組相比，miR-25-3p + oe-ZEB2組細(xì)胞中ZEB2的表達(dá)顯著增加(LDS-t=2.716，P=0.035)，表明ZEB2過表達(dá)質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)染宮頸癌HeLa細(xì)胞。見圖4。

圖4 miR-25-3p與ZEB2啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)Fig.4 Binding sites of miR-25-3p and ZEB2 promoter region

9 MTS檢測miR-25-3p靶向ZEB2對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響 MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-25-3p mimic組和miR-25-3p + oe-ZEB2組細(xì)胞增殖能力顯著降低(P＜0.05)；與miR-25-3p mimic組相比，miR-25-3p + oe-ZEB2組細(xì)胞增殖能力顯著增加(P＜0.05)。見圖5。

圖5 MTS實(shí)驗(yàn)檢測miR-25-3p靶向ZEB2對宮頸癌細(xì)胞增殖能力的影響 (aP＜0.05，vs NC組；bP＜0.05， vs miR-25-3p mimic組)Fig.5 Effect of miR-25-3p targeted ZEB2 on the proliferation of cervical cancer cells detected by MTS test (aP＜0.05, vs NC group; bP＜0.05, vs miR-25-3p mimic group)

10 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測miR-25-3p靶向ZEB2對宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響 Boyden實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與NC組相比，miR-25-3p mimic組和miR-25-3p+oe-ZEB2組細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P＜0.05)；與miR-25-3p mimic組相比，miR-25-3p+oe-ZEB2組細(xì)胞侵襲能力顯著增加(P＜0.05)。見圖6、圖7。

圖6 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測miR-25-3p靶向ZEB2對宮頸癌細(xì)胞侵襲能力的影響 (aP＜0.05，vs NC組；bP＜0.05，vs miR-25-3p mimic組)Fig.6 Effect of miR-25-3p targeted ZEB2 on the invasive ability of cervical cancer cells detected by Boyden test (aP＜0.05, vs NC group; bP＜0.05, vs miR-25-3p mimic group)

圖7 Boyden實(shí)驗(yàn)檢測宮頸癌細(xì)胞侵襲能力Fig.7 The invasive ability of cervical cancer cells detected by Boyden test

討 論

miRNA屬于一類小的內(nèi)源性非編碼RNA，長度為21 ～ 24個(gè)核苷酸，其在一系列腫瘤惡性生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲[11-12]。miR-25-3p是位于染色體7q22.1上MCM7癌基因的內(nèi)含子13的簇成員，其表達(dá)失調(diào)可導(dǎo)致包括惡性腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。研究報(bào)道m(xù)iR-25-3p依據(jù)不同的腫瘤類型可發(fā)揮癌因子和抑癌因子。miR-25-3p的過表達(dá)顯著促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[4]。miR-25-3p上調(diào)促進(jìn)了骨肉瘤細(xì)胞的生長、侵襲和耐藥性，并且骨肉瘤組織中miR-25-3p的高表達(dá)與患者臨床預(yù)后呈負(fù)相關(guān)[14]。而盧沐[6]報(bào)道m(xù)iR-25-3p抑制食管癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。已有研究報(bào)道在宮頸癌順鉑耐藥細(xì)胞中miR-25-3p表達(dá)降低，miR-25-3p的異位表達(dá)逆轉(zhuǎn)了EMT表型并促使宮頸癌細(xì)胞對順鉑敏感度增加[7]。而miR-25-3p在宮頸癌組織中的表達(dá)及作用未知，本文采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)miR-25-3p在84例宮頸癌組織中的表達(dá)顯著低于在40例宮頸對照組織中的表達(dá)水平，并且miR-25-3p的表達(dá)水平與宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肌層浸潤深度和FIGO分期顯著相關(guān)。表明miR-25-3p表達(dá)降低參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。此外，生存分析顯示miR-25-3p低表達(dá)的宮頸癌患者預(yù)后較差，提示miR-25-3p可能是宮頸癌患者預(yù)后標(biāo)志物。

在既往研究中，miR-25-3p在腫瘤中通過靶向BTG2和NOTCH1等基因發(fā)揮作用[4-6]。通過與靶基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合而負(fù)調(diào)控靶基因的表達(dá)是miRNA發(fā)揮生物學(xué)功能的作用機(jī)制[10]。Target Scan7.1生物學(xué)信息軟件預(yù)測及雙熒光素酶報(bào)告基因結(jié)果顯示ZEB2基因是miR-25-3p的直接靶基因。本文采用qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)ZEB2 mRNA和蛋白在84例宮頸癌組織中的表達(dá)顯著高于在40例宮頸對照組織中的表達(dá)水平，并且ZEB2 mRNA和蛋白與miR-25-3p在宮頸癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。ZEB2是由位于人的染色體2上Zfhx1 B基因編碼的蛋白質(zhì)分子，其中間結(jié)構(gòu)是可變區(qū)，每側(cè)有兩個(gè)獨(dú)立且高度保守的鋅指簇[15]。ZEB2最重要的功能是參與EMT，即誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化為具有高侵襲性和遷移能力的間充質(zhì)表型，從而導(dǎo)致間充質(zhì)標(biāo)志物(N-鈣黏著蛋白和波形蛋白)的獲得以及上皮標(biāo)記物(E-鈣黏著蛋白)的丟失[16]。Ye等[9]研究發(fā)現(xiàn)ZEB2在宮頸癌組織中過表達(dá)，與我們的研究一致，并且他們研究發(fā)現(xiàn)ZEB2在宮頸癌組織中與miR-377的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，是miR-377的靶基因。同時(shí)本文分析發(fā)現(xiàn)ZEB2 mRNA和蛋白表達(dá)水平與宮頸癌的組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和FIGO分期相關(guān)。本文采用生存分析顯示ZEB2 mRNA和蛋白高表達(dá)的宮頸癌患者預(yù)后較差，提示ZEB2可能是宮頸癌患者預(yù)后標(biāo)志物。miR-25-3p是否通過負(fù)調(diào)控其靶基因ZEB2參與宮頸癌的惡性進(jìn)展，本文在細(xì)胞水平進(jìn)行了功能學(xué)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示miR-25-3p顯著抑制了宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，但ZEB2可以逆轉(zhuǎn)miR-25-3p在宮頸癌中發(fā)揮的抑癌作用，因此miR-25-3p是通過負(fù)調(diào)控ZEB2抑制宮頸癌細(xì)胞的惡性進(jìn)展。

綜上所述，miR-25-3p在宮頸癌組織中低表達(dá)，ZEB2 mRNA和蛋白在宮頸癌組織中高表達(dá)，兩者的表達(dá)水平在宮頸癌中呈負(fù)相關(guān)，miR-25-3p是靶向負(fù)調(diào)控ZEB2抑制宮頸癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力，miR-25-3p和ZEB2可能是治療宮頸癌的潛在靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。