宋松澤，齊 琳，張德宇，石煙祝，張菲婭，沈雁婕，葉棋濃，藺 靜

1 錦州醫(yī)科大學(xué)研究生培養(yǎng)基地(解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心)，北京 100048；2 解放軍總醫(yī)院第四醫(yī)學(xué)中心 檢驗科，北京 100048；3 錦州醫(yī)科大學(xué)，遼寧錦州 121001；4 軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院 生物工程研究所，北京 100850

腎透明細(xì)胞癌(clear cell renal cell carcinoma，ccRCC)是人體腎癌中最常見的病理亞型，其發(fā)生率逐漸增高，尋找早期診斷和預(yù)測預(yù)后的重要生物標(biāo)志物，對ccRCC的治療和預(yù)后判斷有重大意義?，F(xiàn)已明確，ccRCC是一種代謝性疾病，通常伴隨著葡萄糖代謝和三羧酸循環(huán)的重編程[1-2]。因此，探索糖代謝相關(guān)的重要基因和蛋白表達(dá)水平的變化，對于揭示ccRCC的發(fā)生發(fā)展具有重要意義。

連接糖酵解和三羧酸循環(huán)的丙酮酸脫氫酶復(fù)合物(pyruvate dehydrogenase complex，PDHC)位于真核細(xì)胞線粒體基質(zhì)中，包括丙酮酸脫氫酶(pyruvate dehydrogenase，PDH)、二氫硫辛酰胺乙酰轉(zhuǎn)移酶(dihydrolipoamide acetyltransferase，DLAT)和脂肪酰胺脫氫酶(dihydrolipoamide dehydrogenase，DLD)[3]。PDHC活性缺失與部分代謝紊亂疾病相關(guān)，如肌無力、乳酸中毒及神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病等[4-5]。丙酮酸脫氫酶E 1亞基α 1(pyruvate dehydrogenase E1 subunit alpha 1，PDHA1)作為PDHC催化反應(yīng)的起始酶，是決定丙酮酸進入三羧酸循環(huán)或糖酵解代謝途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一。近年研究發(fā)現(xiàn)，PDHA1的表達(dá)水平降低可能與部分癌癥的發(fā)生有關(guān)，如乳腺癌、胃癌、食管癌等[6-8]。然而，PDHA1是否能調(diào)節(jié)ccRCC生長和影響腫瘤預(yù)后尚不清楚。本研究通過生物信息學(xué)分析及體外細(xì)胞實驗探索PDHA1在ccRCC中的表達(dá)及其生物學(xué)功能，為進一步研究PDHA1抑制ccRCC的分子機制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

1 實驗細(xì)胞系 人ccRCC 786-O細(xì)胞系(中國科學(xué)院上海細(xì)胞研究所)。

2 主要試劑 胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)和PBS緩沖液；細(xì)胞培養(yǎng)板及一次性無菌10 mL移液管(無錫耐思生物科技有限公司)；pcDNA3.0-Flag-PDHA1表達(dá)載體由本室構(gòu)建；質(zhì)粒提取試劑盒和CCK-8試劑盒(南京諾唯贊生物科技股份有限公司)；4%多聚甲醛(廣州賽國生物科技有限公司)；抗Flag抗體(英國Abcam公司)。

3 數(shù)據(jù)資料采集 登錄癌癥基因組圖譜網(wǎng)站(the cancer genome atlas，TCGA；https://cancergenome.nih.gov)，在數(shù)據(jù)庫中下載ccRCC數(shù)據(jù)集的臨床資料及RNASEqV2信息。

4 ccRCC的表達(dá)分析和生存分析 從UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn)調(diào)取TCGA數(shù)據(jù)庫，分析PDHA1在ccRCC中的表達(dá)，并比較PDHA1高表達(dá)與低表達(dá)患者的無病生存期(disease free survival，DFS)和總生存期(overall survival，OS)差異。

5 基于PDHA1表達(dá)量的基因差異分析 采用R軟件的“DESeq2”程序包輔助編程，對高、低表達(dá)PDHA1的ccRCC RNA-seq數(shù)據(jù)進行分析，查找差異基因，對差異基因行基因本體(gene ontology，GO)注釋、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG)富集分析。

6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與Western blot檢測 ccRCC 786-O細(xì)胞以65% ～ 75%的密度均勻接種于2個6 cm皿中，同時加入4 mL含1%雙抗及10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基。將5 μL Lipofectamine 2000與195 μL NaCl溶液混勻，靜置5 min。隨后將10 μg的Flag-PDHA1與NaCl混勻，使其總量為200 μL。再將上述兩種混合液混勻共計400 μL，室溫靜置15 min，加入6 cm培養(yǎng)皿中。同樣方法轉(zhuǎn)染Flag空載體作為對照。6 h后換液，24 h后棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，將細(xì)胞收集于EP管中，離心棄去上清，加入細(xì)胞體積3倍的RIPA，冰浴30 min，再加與RIPA等量的SDS，沸水浴10 ～ 15 min，離心后取上清進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。以半干轉(zhuǎn)的方式轉(zhuǎn)膜，16 V，50 min。用含1 g脫脂奶粉的20 mL TBST封閉液封閉1 h，HRP-Flag抗體孵育1 ～ 2 h，TBST洗膜4次后，化學(xué)發(fā)光法顯色，壓片4 min，顯影。

7 CCK-8法檢測PDHA1對786-O細(xì)胞生長的影響 將Flag-PDHA1及Flag空載體分別轉(zhuǎn)染于786-O細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，胰酶消化3 ～5 min，用細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于96孔板每孔接種200 μL細(xì)胞懸液(細(xì)胞密度3 000/孔)，過表達(dá)Flag-PDHA1組和Flag空載體均設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后，吸去培養(yǎng)基，每孔加入100 μL稀釋后CCK-8反應(yīng)液(CCK-8與培養(yǎng)基按1∶10進行稀釋)。37℃下繼續(xù)培養(yǎng)1 h后測量第0、1、2、3、4天450 nm波長下光密度(optical density，OD)值。

8 克隆形成實驗 將轉(zhuǎn)染后的786-O細(xì)胞，以2 000個/孔的密度接種于6孔板中，過表達(dá)Flag-PDHA1組和Flag空載體組均設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)14 d后，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后，使用4%多聚甲醛固定，0.5%結(jié)晶紫染色，計數(shù)克隆數(shù)。

9 劃痕實驗 將786-O細(xì)胞按70%左右的密度均勻接種6孔板，分別轉(zhuǎn)染Flag-PDHA1及Flag空載體，每組設(shè)3個復(fù)孔。待細(xì)胞密度接近100%時，用高壓滅菌槍頭，垂直于細(xì)胞平面并勻速劃過細(xì)胞，PBS沖洗，鏡下隨機拍取3個位置，并做好標(biāo)記。常規(guī)培養(yǎng)24 h后，在標(biāo)記處拍照記錄，計算細(xì)胞相對遷移距離。

10 統(tǒng)計學(xué)方法 通過SPSS25.0和GraphPad Prism 8軟件對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。采用Mann-WhitneyU方法分析臨床資料組間PDHA1基因表達(dá)的差異，采用Kaplan-Meier繪制生存曲線。細(xì)胞實驗中，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PDHA1在腎癌患者中表達(dá)情況分析 本研究從TCGA數(shù)據(jù)庫中下載533例ccRCC組織以及72例癌旁正常組織的RNA-seq數(shù)據(jù)。分析發(fā)現(xiàn)，ccRCC組織中PDHA1 mRNA表達(dá)明顯低于癌旁組織(P＜0.01)。Ⅲ期ccRCC患者腫瘤組織中PDHA1 mRNA水平低于Ⅰ期患者(P＜0.01)。腫瘤分級為Ⅱ級和Ⅲ級的患者，腫瘤組織中PDHA1 mRNA水平明顯高于Ⅳ級患者(P＜0.01)。淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移與PDHA1 mRNA水平無關(guān)(P＞0.05；圖1)。

圖1 ccRCC組織中PDHA1表達(dá)水平 A：癌旁組織和ccRCC組織中表達(dá)差異；B：不同病理分期樣本中表達(dá)差異；C：不同分級樣本中表達(dá)差異；D：淋巴結(jié)未轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)移的樣本中表達(dá)差異Fig.1 PDHA1 expression levels in ccRCC A: Expression difference between adjacent tissues and ccRCC tissues; B: Expression levels in tissues of different cancer stages; C: Expression levels in tissues of different tumor grades; D: Expression levels in tissues with or without lymph node metastasis

以PDHA1表達(dá)水平的中位數(shù)為切點，將ccRCC患者分為PDHA1高表達(dá)組(258例)及PDHA1低表達(dá)組(258例)。生存曲線結(jié)果表明，高表達(dá)組患者無病生存期和總生存期更長(P＜0.01；圖2)。

圖2 ccRCC組織中PDHA1表達(dá)水平與臨床預(yù)后的關(guān)系A(chǔ)：無病生存期；B：總生存期Fig.2 Relationship between PDHA1 expression level and clinical prognosis in ccRCC A: DFS; B: OS

2 PDHA1高表達(dá)和低表達(dá)組間差異基因分析以中位數(shù)為分界點，將ccRCC患者分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，進行組間差異基因分析，篩選出705個差異基因，較PDHA1低表達(dá)組，PDHA1高表達(dá)組上調(diào)577個基因，下調(diào)128個基因(圖3)。為了解兩組差異基因的功能，對705個差異基因進行GO及KEGG分析。將GO注釋和KEGG通路分析的前15個結(jié)果繪制圖形，GO及KEGG分析結(jié)果均顯示，PDHA1調(diào)控ccRCC可能與凝血通路有關(guān)(圖4)。

圖3 PDHA1高表達(dá)與PDHA1低表達(dá)組間差異表達(dá)基因Fig.3 Differential expression genes between groups with high expression of PDHA1 and low expression of PDHA1

圖4 PDHA1高表達(dá)與PDHA1低表達(dá)組間差異基因的GO注釋(A)和KEGG通路(B)分析Fig.4 GO (A) and KEGG (B) pathway anotation between groups with high expression of PDHA1 and low expression of PDHA1

3 CCK-8實驗 Western blot實驗顯示，F(xiàn)lag-PDHA1轉(zhuǎn)染的786-O細(xì)胞成功表達(dá)PDHA1蛋白(圖5A)。另外，通過CCK-8方法觀察786-O細(xì)胞在第0、1、2、3、4天的生長情況，相比于空載體組，轉(zhuǎn)染Flag-PDHA1后，786-O細(xì)胞在第4天生長明顯受到抑制(P＜0.01；圖5B)。

圖5 PDHA1抑制786-O細(xì)胞增殖 A：Western blot；B：細(xì)胞生長曲線 (P＜0.01, vs Flag-PDHA1)Fig.5 PDHA1 inhibited proliferation of 786-O cells A: Western blot; B: Cell growth curves (P＜0.01, vs Flag-PDHA1)

4 克隆形成實驗 為了從多方面驗證PDHA1抑制786-O細(xì)胞生長，在786-O細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染Flag-PDHA1和Flag空載體，以2 000/孔的細(xì)胞密度鋪于6孔板。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Flag-PDHA1組的786-O細(xì)胞克隆數(shù)量顯著低于空載體組，再次說明PDHA1抑制786-O細(xì)胞增殖(P＜0.01；圖6)。

圖6 PDHA1抑制786-O細(xì)胞增殖A：克隆形成實驗；B：克隆數(shù)量Fig.6 PDHA1 inhibited the proliferation of 786-O cellsA: Colony formation assay; B: Colony number

5 細(xì)胞劃痕實驗 將Flag-PDHA1和Flag空載體分別轉(zhuǎn)染786-O細(xì)胞后，劃痕實驗顯示，與空載體組相比，F(xiàn)lag-PDHA1可明顯抑制786-O細(xì)胞的遷移能力(P＜0.01；圖7)。

圖7 PDHA1抑制786-O細(xì)胞遷移A：劃痕實驗；B：相對細(xì)胞遷移Fig.7 PDHA1 inhibited the migration of 786-O cellsA: Wound healing assay; B: Relative cell migration

討 論

糖代謝是生物體三大能量代謝之一，PDHA1作為連接糖酵解和三羧酸循環(huán)的平衡樞紐而被廣泛關(guān)注。由于ccRCC通常伴隨著葡萄糖代謝和三羧酸循環(huán)的重編程[1-2]，因此我們對PDHA1在ccRCC中的表達(dá)及影響進行了探討。

我們通過檢索TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，PDHA1在ccRCC組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織，PDHA1的表達(dá)與ccRCC分期和分級相關(guān)，并且與腎癌患者無病生存期和總生存期呈正相關(guān)。另外，體外細(xì)胞實驗顯示，786-O細(xì)胞高表達(dá)PDHA1后，細(xì)胞增殖、克隆形成和遷移能力均明顯減弱。因此，PDHA1的表達(dá)水平降低可能與ccRCC的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。與之相似，PDHA1的表達(dá)水平降低與乳腺癌、胃癌、食管癌等腫瘤的發(fā)生發(fā)展和預(yù)后也密切相關(guān)[6-10]。乳腺癌中，乙型肝炎X相互作用蛋白(hepatitis B X-interacting protein，HBXIP)通過穩(wěn)定缺氧誘導(dǎo)因子1α(hypoxia inducible factor-1，HIF-1α)提高miR-96的表達(dá)，miR-96在轉(zhuǎn)錄水平抑制PDHA1的表達(dá)，增強葡萄糖代謝重編程，從而促進乳腺癌細(xì)胞的生長[11]。PDHA1 mRNA高表達(dá)乳腺癌患者總生存期明顯高于低表達(dá)者[6]。胃癌中，細(xì)胞實驗顯示PDHA1低表達(dá)能促進糖酵解，并導(dǎo)致胃癌細(xì)胞增殖、克隆形成和侵襲[7]。胃癌組織中PDHA1表達(dá)也顯著下調(diào)，與預(yù)后不良相關(guān)[9]。食管癌的研究顯示，食管癌細(xì)胞中PDHA1基因被敲除后，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生代謝重編程，出現(xiàn)Warburg效應(yīng)以及細(xì)胞惡性程度增加[8]。PDHA1蛋白低表達(dá)與食管癌預(yù)后不良有關(guān)[10]。另外，在腎癌組織中，己糖激酶Ⅱ(hexokinase Ⅱ，HKⅡ)可增加PDHA1上Ser293位點磷酸化，PDHC活性降低，從而改變代謝途徑，促進了Warburg效應(yīng)[12]。

以上研究提示，PDHA1通過調(diào)控糖代謝抑制腫瘤細(xì)胞生長。除了調(diào)控糖代謝，PDHA1發(fā)揮作用也與其他機制有關(guān)。Chen等[13]報道頭頸鱗狀細(xì)胞癌中，PDHA1敲低表達(dá)后通過激活絲氨酸/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，Akt)和細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)通路促進細(xì)胞生長。另外，敲低PDHA1基因，可誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (epithelial-mesenchymal transition，EMT)，進而導(dǎo)致肺癌細(xì)胞對順鉑產(chǎn)生耐藥[14]。Sun等[15]發(fā)現(xiàn)高表達(dá)PDHA1可激活促凋亡BCL2關(guān)聯(lián)X蛋白(bcl-2 associated X protein，Bax)信號通路，調(diào)節(jié)下游蛋白半胱天冬酶3/9，進而誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

為了進一步探討PDHA1低表達(dá)促進ccRCC細(xì)胞生長的機制，我們對PDHA1高表達(dá)后的705個差異基因進行了GO注釋和KEGG富集分析，兩者均顯示PDHA1與凝血通路有關(guān)。多個研究顯示，止血因子和腫瘤的生物特征在多方面都存在相互聯(lián)系，腫瘤細(xì)胞能激活凝血系統(tǒng)，凝血因子參與腫瘤進展，凝血級聯(lián)反應(yīng)還可能特異性調(diào)節(jié)抗腫瘤免疫，凝血通路中相關(guān)分子有望成為新的抗腫瘤藥物靶標(biāo)[16-18]。因此，PDHA1可能通過凝血通路相關(guān)分子影響腫瘤進展。GO 注釋及KEGG富集分析為深入研究PDHA1在ccRCC發(fā)生發(fā)展中的機制提供了方向。