李鵬昊，鄭楷煉，許熊飛，金 鋼

海軍軍醫(yī)大學長海醫(yī)院肝膽胰脾外科，上海 200433

胰腺癌是預后極差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤。雖然近年來胰腺癌的診斷方法、治療手段與管理理念的不斷進步使得患者預后獲得較大改善，但其5年總體生存率仍不足10%，依然為“癌中之王”［1］。到目前為止根治性切除仍是胰腺癌最有效的治療手段，但是超過50%的胰腺癌患者確診時已出現明顯的遠處轉移［2］，喪失手術根治機會。胰腺癌預后差的主要原因在于胰腺癌細胞具有極易局部侵襲和遠處轉移的生物學特性，癌癥相關基因的可變剪接在胰腺癌侵襲轉移中可能發(fā)揮重要作用。Numb是一個進化上保守的基因，具有控制細胞不對稱分裂和決定細胞命運，調控細胞黏附與遷移、特定底物泛素化及多種信號通路等功能［3］，其復雜的生物學特性在胰腺癌中的作用日漸受到關注。Numb基因可發(fā)揮抑癌或促癌作用，產生這種功能差異的原因可能與可變剪接有關，然而Numb基因可變剪接的調節(jié)機制仍不完全清楚，所產生的剪接異構體在胰腺癌中的功能有待于進一步揭示。本文將對Numb基因及其剪接異構體的功能特點，及其對胰腺癌的影響進行系統(tǒng)綜述。

1 Numb基因及其可變剪接的研究

Numb是近20年來逐漸被認識的一類胞漿蛋白，而后發(fā)現，Numb與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關。在不同的腫瘤組織中，Numb表現出的抑癌/促癌作用也不同。在一些腫瘤中Numb高表達促進癌細胞生長。例如，在肺鱗癌中，高水平Numb可促進腫瘤細胞增殖和侵襲［4］；在肝癌中，腫瘤組織Numb水平顯著高于周圍正常組織且與不良預后相關［5］。而在乳腺癌中，Numb處于缺失狀態(tài)，Numb表達越低乳腺癌的惡性程度越高，其預后越差［6］。Numb也參與胰腺癌的發(fā)生發(fā)展及轉歸，胰腺癌組織標本中Numb的表達水平與腫瘤大小和腫瘤TNM分級、預后呈負相關，是患者預后情況的獨立預測指標［7－8］，提示Numb可能發(fā)揮抑癌功能。上述情況或可歸咎于各類異構體的結構差異［9］。

在哺乳動物體內，Numb的可變剪接根據其mRNA在磷酸酪氨酸結合（phosphotyrosine－binding，PTB）結構域是否有11個氨基酸的外顯子（Ex6）插入及在脯氨酸富集區(qū)域（proline rich region，PRR）是否有48個氨基酸的外顯子（Ex12）插入，產生4種不同的剪接異構體：Numb1（p72）、Numb2（p66）、Numb3（p71）和Numb4（p65）［10］。在所有異構體中，氨基端均包含PTB結構域，具有結合膜蛋白，參與細胞膜定位，調控胞吞等功能［11］；PRR結構域位于蛋白中間區(qū)域，參與胞內信號轉導并與細胞增殖與分化密切相關。根據PRR結構域中是否含有Ex12插入，Numb蛋白可分為PRRL（p72/p71）及PRRS（p66/p65）兩類。在正常的胰腺組織中PRRS的表達量遠高于PRRL，其Notch通路活性被抑制；而在胰腺癌組織中PRRL表達上調，PRRL/PRRS的比率明顯增高導致Notch1和Notch4的異常激活［7］；在肝癌中，Numb上調同樣以PRRL為主，高表達的PRRL表現出明顯的促增殖作用［5］。上述研究表明Numb的功能差異可能與剪接異構體類型相關，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。

2 胰腺癌中Numb剪接異構體對不同信號通路的影響

與其他實體腫瘤相比，胰腺癌微環(huán)境中含有大量的基質細胞和細胞外基質［12］，腫瘤細胞的分子生物學特征也更為復雜。Numb作為重要的抑癌/促癌分子在其他實體瘤中研究較為廣泛。然而，受限于胰腺癌復雜的分子機制和高度異質性，目前Numb在胰腺癌中的研究相對較少，其剪接異構體的不同功能與胰腺癌相關信號通路的關系更是鮮為人知。故Numb亞型和信號通路二者之間的關系值得進一步探討和研究，為確認胰腺癌治療的潛在靶分子提供理論基礎。

2.1 胰腺癌中Numb剪接異構體對Notch信號通路的影響 人類Notch途徑是一種進化上保守的信號轉導級聯(lián)反應，介導細胞增殖與凋亡、多能祖細胞分化等重要功能，從而調節(jié)組織、器官的分化和發(fā)育［13］。近年來，Numb蛋白對Notch信號通路的調控在胰腺癌中的生物學效應愈發(fā)受到重視。研究發(fā)現，Numb蛋白能夠多層面抑制Notch通路：Numb可以與AP－2結合抑制Notch膜蛋白的轉運和內吞［14－15］；Numb蛋白可以抑制Notch胞內結構域（Notch intracellular domain，NICD）共轉錄因子進入細胞核［16］；Numb蛋白可以直接與NICD結合引起NICD泛素化［17］。剪接異構體的變化也會影響其在Notch通路中的作用，PRRL表達增加激活Notch途徑，而PRRS抑制Notch活化及其下游基因的表達，表明Ex12的插入或缺失對Numb功能有重要影響［18］。

與其他實體腫瘤類似，Notch途徑在胰腺癌中高度失調，誘導腫瘤細胞放射抵抗與化學耐藥、腫瘤干細胞增殖、上皮間質轉化（epithelial－mesenchymal transition，EMT）等惡性生物學行為［19－20］。胰腺癌干細胞（pancreatic carcinoma stem cell，PaCSC）作為腫瘤微環(huán)境中的重要細胞亞群，其對稱分裂特性是導致腫瘤快速增殖、轉移、復發(fā)與耐藥的關鍵元兇［21－22］。研究［23］證實Notch1異常高表達在對稱分裂的PaCSC中普遍存在，使用槲皮素誘導提高胞內miR－200b－3p水平，降低Notch1/Numb比率可有效抑制PaCSC自我更新與增殖，促進其向成骨細胞、軟骨細胞與脂肪細胞分化，有效改善腫瘤組織的惡性生物學行為。EMT是指細胞失去部分上皮特性并獲得間充質特性的生物學過程［24］。在腫瘤組織中，腫瘤組織微環(huán)境變化（例如低氧）以及間質細胞釋放的各種細胞外信號和生長因子（例如TGFβ、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子、血小板衍生生長因子等）作用于腫瘤細胞并促進EMT誘導轉錄因子的表達，進而降低上皮相關標志（如E－Cadherin、上皮細胞黏附分子和cytokeratin等）蛋白表達而增加間質相關標志（如NCadherin、vimentin和fibronectin等）蛋白表達，啟動EMT［25］。大約80%的胰腺癌患者在初次診斷或術后復查時確診為轉移癌，EMT被證實為啟動和促進胰腺癌侵襲和轉移的關鍵動力［26］。開發(fā)靶向EMT的治療手段或是緩解胰腺癌患者體內腫瘤轉移與化學耐藥，改善預后的可行方案［27］。胰腺癌細胞中Numb表達與E－Cadherin呈正相關，與vimentin呈負相關，Numb和ECadherin共表達的胰腺癌患者預后更好，表明Numb可能參與胰腺癌EMT進程［28］。PRRL參與TGFβ1與表皮生長因子誘導的EMT，促進腫瘤細胞體外EMT樣形態(tài)變化、遷移和侵襲，提高皮下成瘤和肝轉移能力。不僅如此，在TGFβ1誘導的腫瘤細胞中還觀察到Notch1的NICD水平升高，使用Notch1抑制劑能夠顯著逆轉TGFβ1誘導的EMT，提示PRRL與Notch協(xié)同促進胰腺癌細胞EMT［29］。綜上，Numb剪接異構體是胰腺癌中Notch信號通路的重要調控因素。

2.2 胰腺癌中Numb剪接異構體對p53的影響 p53是一種應激傳感器，在細胞面對各種刺激如DNA損傷、癌基因激活、氧化應激和營養(yǎng)不良時被激活，被認為是最重要的腫瘤抑制因子［30］。野生型p53可通過阻滯細胞周期、促進凋亡等多種方式抑制腫瘤產生，而突變型p53卻能避免腫瘤死亡，具有強烈的致癌蛋白特性［31－32］。Numb通過與p53和Mdm2形成三聚體復合物，并與這兩種蛋白直接相互作用，抑制Mdm2介導的p53泛素化，從而穩(wěn)定p53水平，發(fā)揮抑癌作用［33］。敲除Numb導致細胞內p53水平與活性降低，繼發(fā)正常成熟上皮組織分化障礙、EMT、細胞干性重新獲得等形態(tài)學改變，為腫瘤發(fā)生提供重要條件［33］。Numb參與的p53調節(jié)過程與剪接異構體關系密切，其泛素化抑制作用主要由PTB介導［34］。免疫共沉淀實驗中可觀察到Numb－Mdm2或PTB－Mdm2二元復合物，表明Numb或PTB片段能夠獨立于p53與Mdm2相互作用。而Ex6的編碼片段對于這一結合過程至關重要，沉默全部Numb亞型或p72/p66可降低p53水平，沉默p71/p65則沒有顯著影響［35］。胰腺癌中p53與Numb的關系也被相繼證實。相比于p53突變體，胰腺癌細胞中野生型p53受Numb影響更大，過表達Numb顯著提高野生型而不是突變型p53水平，siRNA敲低Numb使野生型p53泛素化增強，細胞侵襲能力得到顯著提升［8］。綜上，Numb影響胰腺癌細胞中p53蛋白調節(jié)過程，不同亞型與胰腺癌p53蛋白的關系值得深究。

3 Numb及剪接異構體對胰腺癌治療的潛在影響

盡管胰腺癌新輔助治療與免疫療法的聯(lián)合使用使患者生存率進一步提高［36－37］，其特殊腫瘤微環(huán)境引起的耐藥仍是臨床治療的最大阻礙［38］。吉西他濱作為胰腺癌患者化療一線用藥之一，其耐藥性是導致患者預后不良的重要原因［39］。相比Numb表達正常的胰腺癌細胞，Numb低表達的胰腺癌細胞對吉西他濱的耐藥性顯著增強，這可能與野生型p53及凋亡相關蛋白caspase－3含量降低有關［40］，然而具體的分子機制尚不清楚。作為腫瘤治療的重要療法，放射治療在胰腺癌患者中的客觀反應率普遍低下［41］。高血糖記憶是糖尿病患者在嚴格血糖控制條件下由并發(fā)癥引起的功能失調［42］，被證明是胰腺癌患者放射抵抗的因素之一［43］。Numb在慢性高糖條件下的顯著下調與Notch途徑的異常激活在放射抵抗形成過程中起到關鍵作用，過表達Numb或使用二甲雙胍則能顯著逆轉這一過程，通過抑制Notch途徑提高高血糖記憶下胰腺癌的放射敏感性［43］。綜上，Numb基因參與胰腺癌細胞放射抵抗與化學耐藥的復雜過程，深入研究Numb及剪接異構體在胰腺癌中的具體功能，有利于解釋胰腺癌耐藥機理和提高治療效果。

4 總結

綜上所述，Numb是一個重要的細胞命運決定因子，產生的多種剪接異構體通過Notch、p53等信號通路在胰腺癌細胞增殖與分化、腫瘤侵襲與轉移和耐藥性等方面發(fā)揮不同功能，促進或抑制腫瘤進展。上文提到的干預環(huán)節(jié)和潛在治療靶點絕大多數處于前瞻性實驗階段，距離開展臨床實驗還有很長一段路要走。在晚期胰腺癌治療十分困難的前提下，迫切需要基于現有理論開發(fā)新的治療方法以改善胰腺癌治療現狀。因此深入了解Numb基因及剪接異構體功能并闡明其在胰腺癌中的作用具有重要意義，為改善胰腺癌的治療及患者預后提供新的理論和思路。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：李鵬昊負責擬定寫作思路，檢索文獻和論文撰寫；許熊飛、金鋼、鄭楷煉負責課題設計；鄭楷煉負責指導、修改論文并最終定稿。