劉延峰，鄧夢婷，陳 堅*

（1 江南大學未來食品科學中心 江蘇無錫 214122 2 江南大學工業(yè)生物技術教育部重點實驗室 江蘇無錫 214122）

1 微生物替代蛋白為可持續(xù)蛋白供給提供重要支撐

食物蛋白是人類最重要的營養(yǎng)素，具有構成和修補人體組織，構成酶、抗體和激素，運輸各類物質，調(diào)節(jié)體液平衡，維持神經(jīng)系統(tǒng)功能和提供能量等作用。作為人體生理、生化的重要組成部分，蛋白質是生命活動的主要承擔者[1]。攝入蛋白質的質量和數(shù)量直接影響人類健康[2-3]。根據(jù)《中國居民膳食營養(yǎng)素攝入量》中提出的建議，成年男性蛋白質攝入量應為65 g/d，女性蛋白質攝入量為55 g/d。對于某些人群，包括運動員、老年人和孕婦，研究表明，由于蛋白質對身體的積極作用，最佳的每日蛋白質攝入量應該高于普通人群的推薦量[4]。預計2050年世界人口將達到90 億，食品蛋白需求增量為30%至50%，達到2.65 億t（聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織，F(xiàn)AO，https：//www.fao.org/news/story/en/item/35571/icode/）。然而，現(xiàn)有的蛋白質獲取大量依賴于養(yǎng)殖業(yè)，存在環(huán)境污染較嚴重、土地占用和水耗較多的問題，面臨難以滿足人口持續(xù)增長和生活水平不斷提升對蛋白質需求增長的巨大壓力。傳統(tǒng)蛋白質生產(chǎn)方式不僅無法滿足人類未來生活需求，而且難以達到環(huán)境友好和資源節(jié)約。大規(guī)模、低成本、可持續(xù)的蛋白質生產(chǎn)方式亟需創(chuàng)新和發(fā)展。

習近平總書記在2022年“兩會” 期間指出，“要樹立大食物觀”“發(fā)展生物科技、生物產(chǎn)業(yè)，向植物、動物、微生物要熱量，要蛋白”。針對可持續(xù)、健康地滿足全球日益增長的蛋白質需求，尋找可持續(xù)的蛋白來源是有效、可行的解決辦法，是未來食品科技研發(fā)的重要方向。替代蛋白（Alternative protein） 通過對環(huán)境影響較小的蛋白來源進行蛋白生產(chǎn)，以替代現(xiàn)有的蛋白質來源。替代蛋白主要包括植物蛋白、藻類蛋白、昆蟲蛋白和微生物蛋白等。其中，微生物蛋白是利用可再生生物質原料等為底物，通過在發(fā)酵罐中培養(yǎng)微生物的方式制造蛋白，能夠利用更少的資源產(chǎn)出更多的蛋白質來源，具有制造效率高并且二氧化碳排放少的優(yōu)勢[5]。據(jù)測算，微生物蛋白合成效率是養(yǎng)殖方式獲取蛋白效率的上千倍，如果到2050年用真菌蛋白替代全球20%的牛肉消費，能夠減少每年56%的森林砍伐和相關二氧化碳排放[6]。

高效微生物蛋白制造一方面可以保障蛋白供給數(shù)量，保障國家發(fā)展和食物安全；另一方面，通過微生物制造獲得高品質蛋白能夠保障蛋白供給質量，滿足人民美好生活的需求。高品質蛋白主要體現(xiàn)在營養(yǎng)與功能性質方面，包括蛋白氨基酸組成與人體氨基酸模式相接近，蛋白性質能夠提升食品的感官品質，并且調(diào)控食品及組分在制備、加工、儲存和銷售過程的物理特性。建立基于微生物蛋白高效生物制造的食品蛋白資源供給體系，對于保障國家食品蛋白供給安全，助力國家“碳達峰”和“碳中和”達成，具有十分重要的戰(zhàn)略地位。

2 微生物替代蛋白生物制造進展

2.1 微生物菌體蛋白

通過對微生物進行培養(yǎng)，能夠獲得大量微生物細胞，進一步對微生物細胞進行加工，能夠獲得微生物菌體蛋白。微生物細胞中，來源于鐮孢霉（Fusarium venenatum） 的真菌蛋白（Mycoprotein）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的酵母蛋白（Yeast protein）是兩種代表性微生物菌體蛋白。

來源于鐮孢霉的真菌蛋白具有胞質富含蛋白，菌絲體富含纖維，細胞膜富含不飽和脂肪酸的特點。1984年，英國批準其作為食品，目前已有真菌蛋白的替代蛋白產(chǎn)品上市。它具有以下優(yōu)勢：真菌蛋白的蛋白消化率評分與牛肉糜、豌豆蛋白、昆蟲蛋白、大豆蛋白相近，甚至更高；生產(chǎn)1 kg 真菌蛋白的碳排放量僅為肉類的10%，而且所需用水量和耕地面積顯著降低；在促進肌肉生長和降低膽固醇水平方面具有潛在積極作用[7]。然而，霉菌發(fā)酵培養(yǎng)工藝控制和組織化加工工藝復雜是其劣勢。

來源于釀酒酵母的酵母蛋白具有富含蛋白質，長期應用于食品加工，風味被廣泛接受的特點。我國將酵母列為“其它食品”，屬于食品的一種。它的優(yōu)勢是：酵母蛋白含有全部必需氨基酸，屬于全價蛋白，營養(yǎng)豐富，能夠滿足人體營養(yǎng)的需求；發(fā)酵工藝成熟，制造效率高，適合于規(guī)?；圃?，所需用水量和耕地面積顯著降低；酵母蛋白無致敏成分，適合人群廣泛；無豆腥味，并且風味上能夠豐富肉味。然而，其在蛋白成纖、持水等質構和組織特性方面需要進行調(diào)控，工藝較復雜。

目前各類菌體蛋白各有優(yōu)、缺點，在生產(chǎn)成本、顏色氣味、質構加工等方面需根據(jù)各自特性有針對性地處理。例如，來源于鐮孢霉的真菌蛋白底物譜廣泛，制造成本低并且質構與真肉相仿；酵母蛋白制造過程的菌體培養(yǎng)主要是以糖類為底物，成本較低，蛋白加工后幾乎無特殊氣味，易于加工處理。為了進一步提升菌體蛋白制造數(shù)量與質量，擴展菌體蛋白應用，主要從以下4 個方面開展工作：1）建立可用于生產(chǎn)優(yōu)質蛋白的菌種資源庫；2）設計和改造微生物，使其成為優(yōu)質蛋白的細胞工廠；3） 研創(chuàng)微生物高效生物轉化蛋白關鍵核心技術；4）通過食品組分的重組加工，開發(fā)合成蛋白產(chǎn)品。

2.2 微生物合成乳蛋白

近年來，隨著食品合成生物學的快速發(fā)展，大量的細胞工廠被設計和構建用于高效合成重要的食品成分和食品功能因子，包括乳鐵蛋白和母乳寡糖等[8-13]。乳蛋白是天然奶的主要成分，具有高營養(yǎng)，易吸收，增強免疫力，抗氧化等特性，是非常重要的蛋白資源。與傳統(tǒng)牛奶的生產(chǎn)工藝相比，應用合成生物學生產(chǎn)乳蛋白具有以下優(yōu)勢：1） 通過在生物反應器中合成乳蛋白，避免傳統(tǒng)養(yǎng)殖生產(chǎn)方式造成的環(huán)境污染以及乳蛋白的抗生素和激素污染；2） 生產(chǎn)乳蛋白的微生物細胞工廠可使用廉價的培養(yǎng)基進行發(fā)酵，原料有葡萄糖、大豆蛋白胨、玉米糖漿、尿素和無機鹽，成本相對較低[14]；3）微生物發(fā)酵的優(yōu)點是周期短，發(fā)酵不受環(huán)境和天氣的影響。

通過合成生物學技術已實現(xiàn)利用畢赤酵母（Pichia pastoris）、大腸桿菌（Escherichia coli）等微生物來合成乳蛋白。完美日公司（https：//www.perfectdayfoods.com/learn-more/#background） 對乳蛋白表達及人造奶的生產(chǎn)進行了研究，核心技術包括將牛奶蛋白的DNA 序列導入酵母細胞，通過發(fā)酵生產(chǎn)酪蛋白和乳清蛋白。進一步將牛奶蛋白、水和其它成分進行混合，生產(chǎn)乳制品替代品。雖然利用微生物發(fā)酵法合成乳蛋白在國內(nèi)起步相對較晚，但是近年來也已取得顯著進展。在乳蛋白的表達方面，已實現(xiàn)利用大腸桿菌成功表達牛奶中7種主要蛋白（αs1-酪蛋白、αs2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、白蛋白）的異源表達且未被降解[15]，為后續(xù)乳蛋白高效表達奠定了基礎。利用畢赤酵母實現(xiàn)了人來源α-乳白蛋白分泌表達，產(chǎn)量達到56.3 mg/L[16]。

乳鐵蛋白是重要乳蛋白，具有抑制腸道致病菌等生理功能，應用領域廣泛。牛乳鐵蛋白是一種低濃度的抗菌劑和免疫調(diào)節(jié)劑，在牛奶中含量很低[17-19]。建立細胞工廠進行生物合成是實現(xiàn)乳鐵蛋白合成的有效策略。目前研究中，已實現(xiàn)紅平紅球菌（Rhodococcus erythropolis）成功表達牛乳鐵蛋白C 葉和N 葉[20]。Isui 等[21]采用硫氧還蛋白（Trx）和乳鐵蛋白作為轉錄融合蛋白的共表達策略，在大腸桿菌中表達和純化重組牛乳鐵蛋白，蛋白的質量濃度達到15.3 mg/L，純度為90.3%。此外，RbLf 對大腸桿菌BL21（DE3）和Mach1-T1 菌株的生長抑制率分別為87.7%和79.8%[21]。通過對密碼子使用的優(yōu)化和強啟動子AOX1 的篩選，牛乳鐵蛋白在畢赤酵母中得到高效表達。經(jīng)誘導、裂解、純化后分批發(fā)酵，最終RbLf 表達量為3.5 g/L。作為食品安全級菌株，枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是食品蛋白表達的理想宿主。研究人員通過啟動子優(yōu)化和密碼子工程，在枯草桿菌168 中表達牛乳鐵蛋白[22]。經(jīng)硫酸銨沉淀、Ni-NTA 親和層析、Superdex 200 層析3 步純化，乳鐵蛋白的得率為16.5 mg/L，純度為93.6%。最終，研究人員驗證了對大腸桿菌JM109、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的預期抗菌活性。

2.3 微生物合成卵清蛋白

雞蛋來源的蛋白是優(yōu)質蛋白和重要的食品蛋白資源。其中，卵清蛋白是一種典型的球狀蛋白，占蛋清中總蛋白的54%，相對分子質量為42.7 ku，等電點為4.5。卵清蛋白包含386 個氨基酸殘基，由單個二硫鍵和4 個游離巰基形成穩(wěn)定的直徑為3 nm 的球狀三維結構，由于卵清蛋白純化制備容易，且結構表征學研究完善，因此作為模式蛋白被廣泛應用于蛋白質構象、生化性質等研究。

基于食品合成生物學構建的細胞工廠，為卵清蛋白制造提供了新途徑。在已開展的研究中，多種微生物被用來合成卵清蛋白[23]。以大腸桿菌作為表達宿主細胞，通過基因工程實現(xiàn)了合成和分泌完整的雞卵清蛋白[24]。近期研究中，研究人員證明了卵清蛋白在大腸桿菌和枯草芽孢桿菌中合成和正確折疊[25-27]。雖然微生物合成的卵清蛋白沒有翻譯后修飾，但是它仍表現(xiàn)出與天然雞蛋卵清蛋白相似的抗原性和生物活性。此外，相關食品生物技術公司也致力于包括卵清蛋白等雞蛋來源蛋白的微生物生產(chǎn)，在多種微生物（如釀酒酵母和枯草芽孢桿菌）中生產(chǎn)兩種或兩種以上蛋清蛋白的組合。

3 未來微生物替代蛋白制造重點研究方向

為了進一步提升微生物蛋白制造效率，提升微生物蛋白的品質，實現(xiàn)微生物蛋白低成本和大規(guī)模生產(chǎn)，微生物蛋白相關研究需從以下4 個方面進一步加強：

1）高效構建蛋白生產(chǎn)的細胞工廠 基于元件挖掘、途徑調(diào)控、系統(tǒng)優(yōu)化等策略，建立芽孢桿菌、酵母、霉菌等蛋白生產(chǎn)的高效細胞工廠。

2）提升細胞生產(chǎn)蛋白效率 解決目標蛋白在不同細胞中高效合成與分泌問題；精準調(diào)控與優(yōu)化細胞代謝與細胞組分，提升蛋白產(chǎn)量；設計與重構代謝模塊，提高底物碳氮利用效率和能量代謝效率，提升蛋白得率；開展適應性進化與超高通量篩選相結合，獲得生長速率提升的菌株，提升蛋白生產(chǎn)強度。

3）蛋白質資源的低成本和大規(guī)模生產(chǎn) 在解決表達系統(tǒng)的抗逆性與穩(wěn)定性的基礎上，建立目標蛋白高效、大規(guī)模、低成本生產(chǎn)的關鍵核心技術體系；篩選、挖掘抗逆元件，改善表達系統(tǒng)穩(wěn)定性；通過功能蛋白高效表達系統(tǒng)進行功能模塊間作用機制解析和挖掘；借助發(fā)酵工程優(yōu)勢平臺，實現(xiàn)功能蛋白大規(guī)模、低成本生產(chǎn)，最終實現(xiàn)特定目標蛋白的大規(guī)模、低成本生產(chǎn)，建立食品領域蛋白生產(chǎn)的完整技術體系。

4）蛋白功能解析與特定蛋白生產(chǎn) 在確定未來食品中特定功能蛋白的組成和重大需求基礎上，解析其發(fā)揮特定功能的核心結構，創(chuàng)新功能蛋白理性設計體系，設計并建立具有特定新功能蛋白的普適性新方法和新技術，獲得決定特定功能的核心結構及分子折疊基礎，揭示決定特定功能的構效關系及作用機理；特定功能蛋白需求的理性定向設計以獲得性能提升的蛋白資源；解析和發(fā)現(xiàn)決定蛋白功能的新分子機制，開發(fā)設計和強化蛋白特定功能的普適性方法，以獲得一系列特定功能得到顯著提升的目標蛋白。

4 結語

綜上所述，傳統(tǒng)蛋白質生產(chǎn)方式不僅無法滿足人類未來生活需求，而且難以達到環(huán)境友好和資源節(jié)約，大規(guī)模、低成本、可持續(xù)的蛋白質生產(chǎn)方式亟需創(chuàng)新和發(fā)展。采用微生物蛋白等替代動物蛋白是食品和生物產(chǎn)業(yè)的必然方向。針對微生物替代蛋白生物制造，必須加強蛋白細胞工廠構建、蛋白合成效率提升和蛋白功能調(diào)控等技術的開發(fā)和應用，解決蛋白質資源等重大問題，搶占世界食品和生物的科技前沿和產(chǎn)業(yè)高地，造福人類。