謝能 曹其新 王金武

1 上海市醫(yī)療器械化妝品審評核查中心 （上海 200020）

2 上海交通大學 （上海 200240）

3 上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院 （上海 200011）

內(nèi)容提要： 針對目前生物打印中常用的工藝進行歸納總結(jié)，明確相應的關鍵工藝參數(shù)和要求，并對打印材料提出相應的要求，為后期生物打印醫(yī)療器械的質(zhì)量控制摸索出一條道路。

增材制造技術作為數(shù)字化制造技術，已經(jīng)逐漸滲入到多個生產(chǎn)、生活領域。其在醫(yī)療器械領域的應用也越來越廣泛，生物打印在軟骨、人造皮膚、人工血管上均取得了突破性的進展。生物打印為人類器官組織再生提供了一個全新的發(fā)展方向，被譽為未來30年的發(fā)展突破性領域。目前生物打印主要包括了凝膠與細胞的混合打印，其主要的問題是孔隙結(jié)構(gòu)的聯(lián)通關系，外部輪廓形狀與邊緣部分的孔隙率不足，精度不足，以及多噴頭中材料和結(jié)構(gòu)的梯度精度的控制問題。本文嘗試針對目前常規(guī)使用的生物打印工藝加以總結(jié)和探討，明確相應的打印工藝規(guī)范要求，為后期實際生物打印醫(yī)療器械產(chǎn)品的質(zhì)量控制，摸索出一條路徑。

1.生物打印的客觀需求

目前，骨科植入物多為金屬或者塑料類（聚醚醚酮）。這類材質(zhì)可以作為假體植入人體，在物理性能上予以功能的恢復，但由于不具備血運功能，不可自我修復。植入患者需面對二次手術等相應的后期問題。生物打印技術內(nèi)部多采用多孔結(jié)構(gòu)，而多孔結(jié)構(gòu)有利于細胞的遷移、分化及骨長入，生物打印植入物的孔隙率、聯(lián)通性，包括多孔組織的降解速率均對后期的組織修復，患者康復效果均有至關重要的影響。所以生物打印在骨植入物方面具有廣闊的應用前景。

而在器官移植領域，目前供體大量的缺失，不少腎臟、眼角膜疾病患者在等待合適供體的過程中，器官功能已走向衰竭。同時，部分接受了臟器移植的患者在手術后因需長期服用免疫抑制劑來抑制排異反應，導致身體抵抗力的大幅下降，最終造成臟器多種并發(fā)癥。在可預見的將來，大量采用自體干細胞誘導生成的生物打印產(chǎn)品及器官將解決目前醫(yī)療領域中器官移植出現(xiàn)的諸多問題及不良反應。

金屬、塑料類產(chǎn)品的無血運及此造成的手術二次翻修問題，以及供體移植類產(chǎn)品的缺失和對應的排異反應，均為生物打印技術的出現(xiàn)做了完美的鋪墊。

2.生物打印工藝難點

細胞所處的整體環(huán)境，對于細胞的誘導分化是至關重要的。在長期的工程實踐中，對于生物細胞的培養(yǎng)過去停留在二維水平，即通過培養(yǎng)皿進行指定細胞的培養(yǎng)。在二維培養(yǎng)環(huán)境中即使添加了諸多的細胞因子和誘導物質(zhì)，仍無法有效模擬細胞在具體三維結(jié)構(gòu)中產(chǎn)生的定向分化。如已知的成骨細胞，在骨中的不同位置均會出現(xiàn)不同的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。而生物打印在細胞誘導分化上，首次提出制造一個三維仿真的模擬環(huán)境，通過提供細胞在三維結(jié)構(gòu)下培養(yǎng)，利用不同的力學和微循環(huán)環(huán)境進行誘導分化，提供了重要的細胞演化基礎。

目前使用的脊柱退化治療中采用干細胞直接注入的方式存在運動代謝問題，導致細胞數(shù)量的不足，細胞生存微環(huán)境不理想導致細胞作用機制不暢，培養(yǎng)一段時間之后，細胞會啟動凋亡機制，數(shù)量開始急劇減少。而三維環(huán)境下進行培養(yǎng)因為具有合理的細胞機制，營養(yǎng)輸送渠道和力學、化學性能的反饋，可以持續(xù)地釋放相應的細胞因子，保證了細胞的存活和增殖[1]。

在生物打印領域中還需要關注以下幾方面的發(fā)展，以多細胞、多材料打印基于組織結(jié)構(gòu)的類似植入體，才能更好地促進細胞誘導、分化，所以需要精準地控制細胞材料，進行組織結(jié)構(gòu)打印，從物理、生物性能上與原有組織進行高度匹配匹配。針對性的工藝發(fā)展，目前生物打印工藝為通用型工藝，針對不同的臨床要求及組織器官特點，應開展具有針對性的組織打印的工藝研究，以完美適配臨床不斷發(fā)展的需求。目前生物打印工藝的規(guī)范化尚存不足，應促進整個工藝的標準化、流程化、系列化、規(guī)范化，進而推動生物打印醫(yī)療器械在實際應用中的推廣與應用。

3.常規(guī)生物打印工藝總結(jié)與探討

3.1 擠出生物打印工藝

目前生物3D打印領域采用的工藝方法為擠出沉積成型法。該方法將所得的數(shù)字模型結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槎鄬咏Y(jié)構(gòu)，通過逐層打印所得結(jié)構(gòu)層面，并在特定區(qū)域內(nèi)打印相對應的活細胞。目前該方法多采用多噴頭方式。

3.1.1 擠出生物打印系統(tǒng)主要構(gòu)成

擠出生物打印系統(tǒng)分為運動控制、溫度控制、供料控制、軟件系統(tǒng)和無菌控制系統(tǒng)。

運動控制系統(tǒng)由XY平面運動機構(gòu)和Z軸的升降機構(gòu)組成。在打印開始階段，將模型切片及代碼轉(zhuǎn)換成可操控的工作驅(qū)動命令。XY平面運動機構(gòu)，根據(jù)實際的驅(qū)動指令，運動到指定的位置后，完成一層的運動軌跡掃描后，再按照規(guī)定的厚度下降至指定的位置。

溫度控制系統(tǒng)包含三個主體，即：①材料儲存溫度控制系統(tǒng)。無論是水凝膠及細胞，其保存均有不同的溫度要求，需要有不同的溫度儲存控制系統(tǒng)加以控制。②艙室溫度控制系統(tǒng)，控制成型腔室的溫度，來保證支撐凝膠的達到充分的支撐強度，細胞能在合適的成型溫度中植入支架。③擠出系統(tǒng)的溫度控制，包括噴嘴的溫度的精確實時反饋及相應的控制。

擠出生物打印使用的供料擠出系統(tǒng)，考慮到使用凝膠的黏度和彈性的不同，以及細胞的保護作用，目前多采用氣壓加杠桿擠出的方式，通過絲桿的精度控制來控制擠出。

在擠出生物打印過程中，軟件系統(tǒng)包括三維成型軟件，切片軟件及控制軟件。三維成型軟件將掃描的數(shù)據(jù)進行三維化處理，形成對應的三維數(shù)字模型。在模型基礎上加以設計修改，完成支架系統(tǒng)的設計，形成合理的孔隙結(jié)構(gòu)及支撐結(jié)構(gòu)。隨后一般以STL文件格式輸出（STL格式是一種三角片化的數(shù)據(jù)文件格式）。STL數(shù)據(jù)模型導入切片軟件，按照規(guī)定的層厚，將模型予以切片，切片數(shù)據(jù)導入下位控制軟件中，形成可以運動控制的驅(qū)動命令并加以執(zhí)行。

生物打印系統(tǒng)與其他增材制造工藝不同的一點是需要有實時的無菌控制系統(tǒng)。正常的金屬塑料打印過程中均無無菌控制的要求，而由于生物打印系統(tǒng)中含有大量的活細胞，無法進行二次滅菌處理，故在打印過程中應進行無菌控制，以保證產(chǎn)品的無菌。如艙室系統(tǒng)的進出分系統(tǒng)均有高效過濾裝置，保證內(nèi)部循環(huán)系統(tǒng)的空氣潔凈度級別達到對應的無菌要求。在整個無菌艙室中應進行對應的氣流測試，以保證在艙室內(nèi)無氣流死角，防止細菌的滋生和蔓延。同時由于供料系統(tǒng)軟管內(nèi)均接觸到對應的活細胞及凝膠物料，均應進行對應的無菌化處理和控制，保證產(chǎn)品的無菌性能。

3.1.2 多噴頭打印

在打印控制參數(shù)中有噴頭規(guī)格大小，噴頭內(nèi)徑的粗細選擇，相對應的噴頭的位置以及切片的參數(shù)，同時包括運動控制參數(shù)。如走絲的間距，每層的厚度，打印物料的擠出速度擠出速率等。

擠出生物打印通過構(gòu)建模型號將凝膠液化，噴嘴溫度設置為液化溫度，逐點擠出在固定的位置上。然后通過低溫艙室進行凝膠的固化。等上一層的凝膠固化后，再打印下一層的凝膠。

在實際打印過程中，由于生物組織材料的復雜性，不同區(qū)域需打印不同配比和種類的材料、細胞，所以在實際打印過程中，多需采用多噴頭組合打印的方式，不同噴頭對應不同的組織材料。

當設定程序中到達某一指定位置后，需切換到不同的打印組織時，打印噴頭開關會自動關閉回位。另一個噴頭經(jīng)過XY方向的自動誤差補償，來到指定的位置繼續(xù)后續(xù)打印，以形成生物組織的復雜梯度要求和精度控制要求。

3.1.3 工藝要求

通過前期多方的試驗、驗證研究，生物打印建立的三維空間結(jié)構(gòu)和孔隙組織，對細胞的有著良好的誘導和保護作用，在打印過程中不同的工藝參數(shù)對產(chǎn)品的最終性能均有不同的影響。如噴頭直徑不同，造成的凝膠流速不同，進而導致對應的凝膠濃度、打印速度、打印絲距均有發(fā)生變化，故有必要對打印參數(shù)進行研討和驗證，以明確合理的打印工藝窗口。打印過程參數(shù)包括XY軸移動速度、層厚、擠出速度、絲間距、噴頭溫度、成型室溫度、延遲時間、凝膠濃度等相應參數(shù)，明確對應的打印參數(shù)之間的相互作用關系，形成合理的工藝窗口。

3.1.3.1絲間距

水凝膠擠出到指定凝固層，從液態(tài)變成固態(tài)需要一定的固化時間。從噴嘴出來的絲橫截面近乎于圓形。絲到達固定位置時，由于重力作用絲橫截面形狀會改變?yōu)榻鼨E圓形。當絲間距設置過小時，從噴頭擠出的絲會由于重力作用變形，相近的絲可能發(fā)生粘連造成孔隙的消失，影響后期營養(yǎng)物質(zhì)的傳遞，最終導致細胞的凋亡。

絲間距設置過大時，由于從噴頭擠出到固化需要相應的時間，造成絲的懸空部分過長，由于重力作用發(fā)生垮塌現(xiàn)象，造成斷絲現(xiàn)象，并隨著打印層數(shù)的不斷增加垮塌處越來越明顯，造成整個打印結(jié)構(gòu)的失真，最終導致打印的失敗。

3.1.3.2層高

層高設置對打印的影響巨大。當層高設置過小時，針頭噴出的凝膠量過大，將針頭淹沒，在打印移動中把該層的凝膠刮破帶跑。

當層高過大時，凝膠從噴嘴到指定位置需相應的時間，而在此過程中凝膠已固化，無法與下層凝膠組織產(chǎn)生良好的粘連作用，造成打印位置的偏移，結(jié)構(gòu)的失真，最終造成打印的失敗。

3.1.3.3填充結(jié)構(gòu)

不同的填充結(jié)構(gòu)對應不同的打印要求。對于偏重于結(jié)構(gòu)精度的產(chǎn)品，多向重復掃描填充結(jié)構(gòu)可防止因某個打印點斷絲造成的結(jié)構(gòu)塌陷產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)影響，保證產(chǎn)品的精度。對于偏重于力學性能的產(chǎn)品，雙向掃描填充結(jié)構(gòu)可使整個空間的力學性能趨于穩(wěn)定，具有良好的支撐效果，便于營養(yǎng)物質(zhì)的滲透。

3.1.3.4噴嘴溫度

水凝膠在不同溫度下的狀態(tài)是不同的。當噴嘴溫度過低時，水凝膠在噴嘴內(nèi)已部分的凝膠化，形成顆粒狀小顆粒，在擠出噴嘴時容易和噴嘴形成切割力。對凝膠造成剪切作用，使部分的物理性能下降，最終造成產(chǎn)品的物理性能不足，同時細胞也會在該過程中受到剪切力的損害。當溫度過高時，噴嘴內(nèi)擠出的凝膠為純液體狀，在降落到指定位置時，無法形成對應的絲狀結(jié)構(gòu)，而成為液體狀散布在指定區(qū)域四周，造成打印的失敗。

3.1.3.5材料濃度

水凝膠濃度與其具有的材料性能存在相互影響關系。濃度低時，凝膠成型差，需要凝成膠體的時間長。對應的艙室溫度也需要更低，應選擇合適的材料濃度，以達到最佳的凝膠時間。

3.1.3.6掃描速度

當掃描速度過快時，絲狀凝膠尚未落到固定位置，而會發(fā)生偏移，形成結(jié)構(gòu)的失真。同時過快的掃描速度，導致絲內(nèi)部的張力過大，在成型后容易發(fā)生應力變形，導致結(jié)構(gòu)變形和孔隙的消失。當掃描速度過慢時，絲狀凝膠會發(fā)生堆積。堆積的部分凝膠會導致打印面的凹凸不平，使打印結(jié)構(gòu)缺失，同時堆積的凝膠可能會和噴嘴發(fā)生接觸，導致整個打印面的刮擦和破壞。

3.1.3.7打印艙室溫度和無菌控制

打印艙室的溫度與凝膠成型、細胞存活存在密切的關系。當艙室溫度過高時，凝膠的成型速度降低，造成成型面無法按照預定時間固體化。部分區(qū)域仍為液體，接著下一層絲繼續(xù)覆蓋，形成垮塌造成整個打印面的破損，結(jié)構(gòu)的缺失。打印艙室溫度過低時，絲狀凝膠會迅速地進行固體化。在打印過程中，凝膠離開噴嘴，迅速的凝固，造成絲材黏結(jié)力大幅度的下降。與下層的絲狀體無法形成牢固的連接，造成整個打印面的偏離和缺失。同時，艙室應進行無菌化的處理，染菌環(huán)境會導致部分的艙室會導致整個產(chǎn)品的無菌狀態(tài)失效，待產(chǎn)品植入人體后，導致炎癥及其他的不良反應。

3.1.3.8打印路徑的規(guī)劃

由于絲材打印有一定的延遲性，從噴頭降落到指定位置有延遲時間。當遇到拐彎點時，應設置有控制噴嘴關閉延遲時間，保證在拐點處沒有過量的凝膠堆積。

3.2 同軸擠出工藝

目前在擠出生物打印工藝，利用表面張力及剪切力獲取成型材料，但是無法獲得微小直徑的液滴。有研究團隊，嘗試采用共軸氣流剪切方式獲取微小液滴，從而實現(xiàn)快速制造細胞包裹的微小凝膠球[2]。通過氣流剪切力，來克服凝膠與噴頭間的表面張力。在同軸噴頭中，噴頭外側(cè)噴射氣流，內(nèi)側(cè)噴射含細胞的水凝膠，實現(xiàn)了快速可控的微結(jié)構(gòu)生物打印。

在結(jié)構(gòu)上該打印噴頭與塑料軟管相連，每種塑料管內(nèi)有不同的材料。不同直徑的金屬毛細針管包含在噴頭內(nèi)部。金屬毛細管上連接頭與打印噴頭相連接，保證不同材料的擠出。噴頭與氣壓噴嘴相連通。

在實際打印過程中，噴頭直徑、氣壓對于成型尺寸有不同的要求。當氣壓過大時，噴頭處的氣體流量迅速提高，在噴頭處產(chǎn)生的剪切力迅速增大，使液體形成液滴過小。氣壓過低時，液滴直徑過大，多細胞液滴含量迅速上升。當噴頭直徑變小時，氣體經(jīng)過噴頭的剪切力迅速增大，液滴直徑變小，含單細胞的液滴數(shù)量迅速增大。

3.3 噴墨式生物打印

噴墨式生物打印主要分為熱泡噴墨和壓電噴墨打印方式。其中熱泡噴墨是在噴嘴附近利用加熱元件在腔體內(nèi)產(chǎn)生蒸氣泡，進而帶動氣泡，向下擠壓，推出生物墨水。壓電噴射生物打印主要是在噴嘴上方采用壓電陶瓷片，以金屬薄片復合。當通電產(chǎn)生信號驅(qū)動后，膜片開始上下振動，膜片下壓帶動液體受擠壓。當壓力超過液體表面張力的臨界值時，液滴從噴嘴擠出。當膜片恢復形變液體腔內(nèi)產(chǎn)生負壓，吸取儲液艙內(nèi)的液體補充腔體。這種打印方式產(chǎn)生的打印顆粒直徑微小，可用于生物傳感器的打印。噴墨打印需要的生物墨水黏度較低，不利于在加工過程中控制細胞包被。同時為了達到在成型面上的迅速固化，保證結(jié)構(gòu)精度，這類成型凝膠固化時間通常都極短，容易在打印過程中發(fā)生噴嘴堵塞，造成打印失敗等情況。

3.4 激光輔助生物打印技術

激光輔助生物打印技術使用激光源，通過激光直接照射玻璃基質(zhì)后的吸收層，吸收層對應位置受熱后，使黏附在其上的生物墨水融化，噴射液滴到指定的位置[3]。該工藝打印速度快，激光不直接接觸細胞，受損害程度小，但是工藝局限性大，通用性差需要針對特定結(jié)構(gòu)設計。

激光輔助打印技術中，針對激光器有多種的激光參數(shù)需要進行驗證，包括但不限于激光波長、激光能量、對應的生物墨水的黏度、金屬吸收層的吸收系數(shù)等。當激光單位能量密度過小時，金屬吸收層能量吸收過少，無法形成噴射液滴。激光能量密度過大時，生物墨水會在金屬黏附層直接爆裂，無法形成射流。應進行驗證，形成一個合理的工藝參數(shù)窗口。激光在加熱金屬吸收層時，會使金屬吸收層產(chǎn)生蒸發(fā)，導致打印物中含有金屬殘留物[4]。

3.5 光固化打印

光固化打印是采用照射源，照射液面，形成投影面。使被照射的液體材料（一般為光敏樹脂或光敏凝膠類物質(zhì)，包含細胞）形成對應的固化層，逐層打印，最終形成樣品[5]。該打印方式相對擠出速度上有明顯的提高，但是光引發(fā)劑一般對細胞具有傷害作用，且光源直接照射到細胞表面，對細胞也具有一定的損傷作用。

在光固化打印中，應考慮打印的層厚、曝光強度等。

3.6 靜電輔助打印

靜電輔助生物打印是在金屬噴頭與底板間制造一個高壓靜電場，使含有細胞的凝膠獲得電場力的作用，克服表面張力從而形成可調(diào)直徑打印材料的生物打印技術。相比傳統(tǒng)的技術及氣壓剪切擠出打印，由于電場力的可控可調(diào)，當電場力的拉力與液體表面張力達到了一個臨界值，就會形成一個圓錐角，俗稱為泰勒錐[6]。電場力進一步加大，隨后液滴離開噴嘴，噴射到底板上。

由于靜電場電壓可調(diào)，意味著電場力可以調(diào)節(jié)大小，以獲得更微小的噴射液滴直徑。同時由于凝膠為導電物質(zhì)，所以會在電場中形成電磁屏蔽，保證細胞不會受到電場力的作用，對細胞不造成靜電場的傷害。應注意以下幾點：①擠出氣壓。當電場強度較低時，液滴直徑與擠出氣壓呈相關關系，氣壓越大液滴直徑越小。當電場強度達到一定強度時，擠出氣壓對液滴造成的影響可以忽略。②電場強度。當電場強度上升時，液滴直徑變小，當上升到臨界值后，液滴的直徑不再變化。③噴嘴直徑。當針頭噴嘴直徑變小時，液滴也變小，但具有一定的臨界值。

3.7 后處理

后處理主要采用了交聯(lián)的方式[7]。生物打印部分的原料經(jīng)過打印后，要進行相應的交聯(lián)，主要包含物理交聯(lián)和化學交聯(lián)兩種。物理交聯(lián)通過疏水作用、離子作用來發(fā)生交聯(lián)反應，最大限度免于化學污染。另一種是化學交聯(lián)，通過化學反應來達到交聯(lián)，保證物理結(jié)構(gòu)性能的達標。

3.8 材料

3.8.1 天然類原材料

生物材料包括天然衍生聚合物凝膠、膠原、殼聚糖。

目前廣泛用于生物打印的水凝膠溶液。水凝膠是作用于人體修復用的組織工程支架的基礎支撐材料，為誘導細胞的分化提供三維的基礎環(huán)境。水凝膠同時具有黏性和彈性，表現(xiàn)為蠕變等物理特性，在高溫狀態(tài)下變?yōu)橐簯B(tài)，而在低溫下凝固為固態(tài)。水凝膠內(nèi)液相轉(zhuǎn)變?yōu)楣滔嗟呐R界點，被稱為凝膠點。在30 C時，水凝膠不溶于水，當溫度逐步升高，凝膠開始逐步分解。一般來說凝膠隨著溫度不斷升高，黏度也會相應地上升。

還有海藻酸鈉溶液。海藻酸鈉粉末提取于天然海藻中，是細胞壁和細胞間間質(zhì)的組成部分，能接近于細胞外基質(zhì)。粉末無色無味，在食品工業(yè)中應用廣泛，具有性質(zhì)穩(wěn)定，價格低廉的優(yōu)勢。不同種類的天然海藻酸鈉由于采摘季節(jié)不同在分子排列上具有不同，應保持海藻酸鈉粉末批間差的一致性。

3.8.2 化學合成類

一類是化學合成材料，如聚乙二醇等[8]。生物打印中，存在單純利用水凝膠（含細胞）進行的生物打印，在結(jié)構(gòu)剛度、體內(nèi)代謝降解速度上存在改進空間。目前已采用化學合成類材料加以改性，進而提高材料性能。

3.8.3 細胞

細胞是生物打印中重要的組成部分，主要為原代細胞和干細胞[9]。干細胞能夠誘導、分化成多種功能性組織特異的細胞，而這些干細胞的誘導分化需要一個穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)。有對應的力學反饋、化學信號刺激，進行誘導和分化[10]。由于打印主要使用自體干細胞來源，可以大大避免排異反應帶來的免疫難題，是極有價值的應用方向。對于使用來自異體的胚胎干細胞存在較大的倫理爭議及遠期的免疫排斥風險，故不建議考慮。

4.展望

有部分專家學者進一步提出了原位生物打印的概念，在人體內(nèi)部重新構(gòu)建對應的三維結(jié)構(gòu)，進一步提供人體內(nèi)所特有的電化學刺激信號等，模擬完善了人體的生物、化學反應過程，為細胞的誘導分化提供了必要的環(huán)境，這是下一步的研究方向。只有對于生物打印工藝的不斷探索和總結(jié)，才能為后期大規(guī)模的臨床應用開辟道路和指引方向。