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        若爾蓋高寒補播草地燕麥根際促生菌的篩選及促生特性研究

        2023-01-01 00:00:00王振龍杜江牛勇姚拓
        草地學(xué)報 2023年5期

        摘要:篩選若爾蓋高寒補播草地燕麥根際的植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR),可為生產(chǎn)適宜其微生物菌肥提供優(yōu)良菌種資源。本研究采用選擇性培養(yǎng)基篩選具不同功能的PGPR,并測定菌株的固氮酶活性、溶磷量、植物激素分泌量,16S rDNA基因序列與系統(tǒng)發(fā)育分析確定菌株的分類地位,促生試驗檢驗菌株的促生效果。結(jié)果表明,從燕麥根際初步篩選出12株促生特性優(yōu)良的PGPR,其中,7株具有多種促生特性,占總細菌數(shù)的58.33 %,以假單胞菌屬(Pseudomonas)為主,最終篩選出4株促生效果最好的PGPR,其中,菌株NCRS21、PCRS14對燕麥生長的促進作用顯著(Plt;0.05),菌株NCHP9、MCRS16對土壤速效磷含量的促進作用顯著(Plt;0.05)。因此,菌株NCHP9,MCRS16,PCRS14,NCRS21的促生能力穩(wěn)定,在生產(chǎn)適宜若爾蓋高寒補播草地的微生物菌肥方面具有應(yīng)用潛力。

        關(guān)鍵詞:植物根際促生菌;高寒補播草地;固氮菌;溶磷菌;燕麥

        中圖分類號:S812.4文獻標識碼:A文章編號:1007-0435(2023)05-1406-08

        Screening and Growth-promoting characteristics of Plant Growth-Promoting

        Rhizobacteria of Oat Rhizosphere in Alpine Reseeding Grassland of Zoige

        WANG Zhen-long DU Jiang NIU Yong YAO Tuo

        (1. College of Grassland Science, Gansu Agricultural University /Key Laboratory of Grassland Ecosystem of Ministry of Education,

        Lanzhou,Gansu Province 730070, China;2. Agriculture and Rural Bureau of Ledu District, Haidong, Qinghai Province 810700, China)

        Abstract:The Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) were screened from the rhizosphere of oat in Zoige alpine reseeding grassland,which provided excellent the PGPR resources for production of microbial fertilizer suitable for the alpine reseeding grassland in Zoige. In this study,PGPR with different functions was screened by selective mediums,and the activity of nitrogen-fixing enzyme,phosphorus solubilization content and plant hormone secretion of the strain were measured. The classification status of the strain were determined by16S rDNA gene sequence and phylogenetic analysis,and growth promoting effect of the strain was tested by growth promoting test. The results show that 12 strains PGPR with excellent growth-promoting characteristics were initially screened from the rhizosphere of oat. Among them,7 strains had multiple growth-promoting characteristics,accounting for 58.33% of the total bacteria count,and were dominated by Pseudomonas;and 4 strains PGPR with the best growth-promoting effect were screened out. Among them,strains NCRS21 and PCRS14 had significant promoting effects on the oat growth (Plt;0.05);and strains NCHP9 and MCRS16 had significant promoting effects on the soil available phosphorus content (Plt;0.05). Therefore,Strains NCHP9,MCRS16,PCRS14 and NCRS21 have a stable growth-promoting ability,which have a potential application in the production of microbial fertilizer suitable for reseeding grassland in the Zoige alpine region.

        Key words:Plant growth-promoting rhizobacteria;Alpine reseeding grassland;Azotobacter;Phosphate solubilizing bacteria;Oats

        若爾蓋縣位于黃河上游,是我國重要的水源涵養(yǎng)地和生態(tài)屏障區(qū),對其進行保護具有重要意義[1-2]。隨著氣候變化和人類對草地利用程度加強,若爾蓋縣的草地出現(xiàn)退化現(xiàn)象,為此,若爾蓋縣采取“施肥+補播+合理放牧”等措施對退化草地進行恢復(fù)治理,其中,補播的主要牧草品種為垂穗披堿草(Elymus nutans L.)和燕麥(Avena sativa L.)[3]。這些措施恢復(fù)了大面積的退化草地,但在草原地區(qū)大量施用化肥不僅成本高,而且容易導(dǎo)致土壤酸化板結(jié)、微生物群體結(jié)構(gòu)破壞、土壤微生物活性降低等環(huán)境問題[4]。為了解決這類問題,科研工作者對化肥的替代品開展研究,張萬通等[5]研究表明,在高寒草地中PGPR菌肥代替30%的氮肥,可增加土壤含水量和土壤全氮含量,從而促進植物生長和保護生態(tài)環(huán)境。從農(nóng)牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展及生態(tài)環(huán)境保護等多方面綜合考慮,認為微生物菌肥在高寒草地生態(tài)恢復(fù)中具有良好的應(yīng)用潛力[6],而植物根際促生菌(Plant growth-promoting rhizobacteria,PGPR)是生產(chǎn)微生物菌肥的重要菌種資源。因此,PGPR資源的篩選成為人們研究的熱點。

        PGPR是指生存于植物根際土壤中或附生于植物根系的一類有益微生物,可通過自身的生命活動,將土壤中以化合物形式存在的營養(yǎng)物質(zhì)釋放至土壤環(huán)境,提高土壤中氮、磷、鉀等有效養(yǎng)分含量,一些代謝產(chǎn)物能夠有效抑制植物病原菌的活性,改善土壤環(huán)境,促進植物生長發(fā)育,提升作物產(chǎn)量和品質(zhì)[7-8]。大量研究表明,PGPR對高寒退化草地的恢復(fù)具有顯著的促進作用[5-6,9]。張萬通等[5]研究表明,PGPR菌肥代替部分化肥在高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中能夠達到促進植物生長和保護生態(tài)環(huán)境的目的。PGPR對不同地區(qū)、不同環(huán)境具有不同的適應(yīng)性[8]。Strigul等[10]研究表明,引入微生物與原著微生物會發(fā)生競爭,從而影響引入微生物的生存與履行特定功能,同樣,宿主植物根系分泌物也影響引入微生物的生存與功能發(fā)揮。只有適宜若爾蓋高寒補播草地的PGPR,才能發(fā)揮最大作用,促進草地生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)。科研工作者已從不同地區(qū)、不同環(huán)境的草地中篩選出許多促生特性優(yōu)良的PGPR,并廣泛應(yīng)用于促進作物生長、改善土壤環(huán)境[11-14]。目前,國內(nèi)外關(guān)于從若爾蓋高寒補播草地篩選的PGPR資源鮮有報道。燕麥是一種優(yōu)質(zhì)牧草,同時作為脆弱生態(tài)系統(tǒng)恢復(fù)的人工建植草種,在我國高寒地區(qū)廣泛種植,其根際分布著優(yōu)良的PGPR資源[15-17]。因此,挖掘適宜若爾蓋高寒補播草地的PGPR資源,對若爾蓋高寒草地的恢復(fù)具有重要意義。

        本研究以若爾蓋高寒補播草地的燕麥為材料,從燕麥根際篩選PGPR,并進行促生特性研究及分類鑒定,旨在篩選出兼有固氮、溶磷、分泌植物激素的多種功能PGPR資源,為研制適宜若爾蓋高寒補播草地的微生物菌肥提供優(yōu)良的菌種資源。

        1材料與方法

        1.1樣地概況與樣品采集

        本研究選取四川省若爾蓋縣麥溪鄉(xiāng)的補播草地(北緯33°56′,東經(jīng)102°11′,海拔為3 513.47 m)為樣地。該地區(qū)冬春季長,嚴寒多風(fēng),夏秋季短,多雨潮濕;年均氣溫為1.2℃,常年處于低溫狀態(tài),屬于高寒地區(qū)[3]。從樣地中心開始,選取邊長為100 m的正方形為采樣區(qū),采用五點法取樣,每點相距100 m,選取長勢良好的燕麥,每點采集5株完整的燕麥根系,分別裝入自封袋中,并及時進行PGPR的分離與篩選。

        1.2PGPR的分離與篩選

        參照姚拓的方法[18],將燕麥根際分為3個區(qū)域,即根表土(Soil adhering to roots,RS)、根系表面(Rhizoplan or surface of roots,RP)和根內(nèi)(Histoplan or interior of roots,HP)。采用稀釋梯度法從上述三個區(qū)域分離PGPR,具體步驟參照馬文文[19]的方法。

        分別吸取200 μL各區(qū)域的10-5和10-6稀釋液,涂布在無氮培養(yǎng)基(Nitrogen free medium,NFM)[20]、NBRIP (National botanical research institute's phosphate)培養(yǎng)基[21]和有機磷培養(yǎng)基[22]上,3次重復(fù),置于16℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d (天),隨時觀察菌落的生長及溶磷圈產(chǎn)生情況,用滅菌牙簽挑取NFM培養(yǎng)基中生長較快、菌落較大的單菌落于新的NFM培養(yǎng)基中,即為固氮菌。用滅菌牙簽挑取NBRIP和有機磷培養(yǎng)基中菌落周圍出現(xiàn)透明圈(溶磷圈)的較大、形態(tài)不同的單菌落于新的培養(yǎng)基中,即為溶磷菌。在LB固體培養(yǎng)基上,分離菌株經(jīng)3次平板劃線法進行純化。將純化好的菌株于4℃冰箱保存,備用,同時用50%的甘油在-80℃冰箱中保存3份。

        1.3促生特性測定

        溶磷量測定:將篩選的溶磷菌接種于盛有50 mL NBRIP或有機磷液體培養(yǎng)基的三角瓶(150 mL)中,每株菌3次重復(fù),16℃、180 r·min-1培養(yǎng)10 d后,采用鉬銻鈧比色法測定溶磷量[22]。固氮酶活性測定:將篩選的固氮菌接種于裝有5 mL半固體NFM培養(yǎng)基的血清瓶(20 mL)中,每株菌3次重復(fù),16℃培養(yǎng)48 h后,采用乙炔還原法測定固氮酶活性[10]。分泌植物激素測定:將菌株接種于裝有50 mL King液體培養(yǎng)基的三角瓶(150 mL)中,每菌株3次重復(fù),以不接菌為對照,16℃、180 r·min-1培養(yǎng)10 d后[23],樣品處理參照王明月[24]的方法提取發(fā)酵液中的植物激素,采用高效液相色譜法測定植物激素[25]。

        1.416S rDNA基因擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析

        對促生特性優(yōu)良的菌株進行分子生物學(xué)鑒定。每株菌3次重復(fù),按照TaKaRa公司生產(chǎn)的DNA提取試劑,提取細菌基因組DNA,利用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')進行16S rDNA基因序列的PCR擴增。50 μL PCR反應(yīng)體系:2×Taq PCR Master-Mix 25 μL、DNA模板5 μL、正反向引物各1 μL、ddH2O 18 μL。參數(shù)設(shè)置:95℃預(yù)變性5 min;95℃變性30 s,55℃退火60 s,72℃延伸30 s,重復(fù)循環(huán)35次;72℃總延伸10 min;PCR產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠瓊脂糖電泳檢測[13]合格后,擴增的基因由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成測序。將完成測序的基因序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫中,利用BLAST程序進行同源序列比較分析后,分別下載相似度較高的標準菌株基因序列,采用Mega7.0軟件以鄰接法聚類分析,構(gòu)建所測菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹,Bootstrap值為 3 000。

        1.5植物促生試驗本研究篩選的促生特性優(yōu)良的PGPR為供試菌株,采用燕麥(Avena sativa. L)為指示植物,進行優(yōu)良菌株的促生試驗檢驗。具體過程如下:在16℃、180 r·min-1的條件下,供試菌株在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h,調(diào)整菌懸液OD600≈0.8 (細胞濃度約1010 CFU·mL-1)備用。燕麥種子經(jīng)1 %的NaClO溶液消毒5 min,無菌水沖洗3次,挑選大小一致的種子,每盆播20顆種子于花盆中(10 cm×10 cm×8 cm),土壤采自若爾蓋縣的補播草地。待出苗后,選取長勢一致的幼苗,每盆14株。出苗5 d后,每盆接種2 mL菌液,對照接種2 mL無菌LB液體培養(yǎng)基,3次重復(fù)。所有花盆置于光照培養(yǎng)室中,依據(jù)樣地的氣溫資料,設(shè)定25℃光照14 h,15℃黑暗10 h,濕度為60 %~70 %,光強度為6 000 lx,每2天澆水一次,確保植物生長所需的水分,32 d后收獲。

        測定指標:使用卷尺測量株高、游標卡尺測量莖粗、分析天平測量地上干重、鉬銻鈧比色法測定土壤速效磷含量[22]。

        1.6數(shù)據(jù)分析使用Microsoft Excel 2010整理數(shù)據(jù),使用Origin 2021、SPSS24.0對數(shù)據(jù)分別進行Pearson相關(guān)性分析、One Way ANOVA和Duncan法進行方差分析,使用Origin 2021、Mega7.0軟件作圖,采用灰色關(guān)聯(lián)分析評價菌株的促生效果。

        2結(jié)果與分析

        2.1燕麥根際促生特性優(yōu)良的PGPR

        通過測定菌株的促生特性,初步篩選出12株促生特性優(yōu)良的PGPR,其中,7株具有多種促生特性,占總細菌數(shù)的58.33%。從燕麥根際的RS,HP區(qū)域分離促生特性優(yōu)良的PGPR占比分別為75%,25%。各菌株具有的促生特性分別為溶磷、固氮、分泌植物激素,其中,溶有機磷量為9.30~9.58 μg·mL-1、溶無機磷量為323.86~472.60 μg·mL-1、固氮酶活性為52.81~203.51 nmol·h-1·mL-1。菌株P(guān)CRS4,PCRS14,PCHP3分泌的植物激素分別為吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)、玉米素(t-Z),分泌量分別為0.11~0.12 μg·mL-1、1.55~3.56 μg·mL-1、0.22~0.26 μg·mL-1,其中,菌株P(guān)CHP3不分泌IAA(表1)。

        2.216S rDNA基因擴增及系統(tǒng)發(fā)育分析

        基于各菌株的16S rDNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育分析可知,12株特性優(yōu)良的PGPR被區(qū)分為2個屬,8個種,以假單胞菌屬(Pseudomonas)為主,占總細菌數(shù)的91.67%,只有菌株NCRS21屬于不動桿菌屬(Acinetobacter)。假單胞菌屬中,菌株NCHP1初步鑒定為Pseudomonas simiae,菌株MCRS16初步鑒定為Pseudomonas carni,菌株P(guān)CRS13、PCRS5、PCRS15初步鑒定為Pseudomonas frederiksbergensis,菌株NCHP9初步鑒定為Pseudomonas baetica,菌株P(guān)CRS14、PCRS4初步鑒定為Pseudomonas fulva,菌株P(guān)CHP3、MCRS15初步鑒定為Pseudomonas arsenicoxydans,菌株P(guān)CRS12初步鑒定為Pseudomonas arsenicoxydans(圖1)。

        2.3植物促生試驗

        對12株促生特性優(yōu)良的PGPR進行接種燕麥促生試驗,各菌株對燕麥的生長具有顯著的促進作用(Plt;0.05) (圖2)。其中,菌株NCRS21對地上干重的促進作用最大,較CK增加23.31%,菌株NCHP9對莖粗的促進作用最大,較CK增加8.43%,菌株P(guān)CRS14對株高的促進作用最大,較CK增加12.60%。除菌株P(guān)CRS4外,其余菌株對土壤速效磷含量具有促進作用,其中,菌株MCRS16、NCHP9、PCRS13能夠顯著增加土壤速效磷含量(Plt;0.05),較CK分別增加193.97%,186.70%,73.83%。通過灰色關(guān)聯(lián)分析,篩選出4株對燕麥生長及土壤速效磷含量具有顯著促進作用的PGPR,其中,菌株NCRS21、PCRS14對燕麥生長的促進作用顯著(Plt;0.05),菌株NCHP9、MCRS16能顯著增加土壤速效磷含量(Plt;0.05)。

        2.4相關(guān)性分析

        Pearson相關(guān)性分析可知,株高、莖粗、地上干重與速效磷含量、溶無機磷量、IAA呈正相關(guān)性,溶有機磷量、固氮酶活性與地上干重呈正相關(guān)性,GA3、t-Z與株高呈正相關(guān)性(圖3)。各菌株通過不同的促生機制促進燕麥生長,其中,菌株通過分泌IAA和溶解無機磷促進燕麥的整體生長,通過溶解有機磷和生物固氮增加燕麥的地上干重,通過分泌GA3和t-Z增加燕麥的株高。同樣,土壤速效磷對燕麥的生長具有促進作用,菌株能夠通過溶解有機磷等途徑顯著增加土壤速效磷含量。

        3討論

        土壤微生物是表征土壤質(zhì)量變化的敏感指標,是土壤有機質(zhì)和養(yǎng)分循環(huán)的主要驅(qū)動者,對草地生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)具有不可替代的作用,因此,在恢復(fù)退化草地過程中,應(yīng)關(guān)注土壤微生物的變化[26-28]。馬麗萍等[29]研究表明,微生物菌肥的添加將增加土壤中有益微生物的數(shù)量和土壤速效養(yǎng)分含量,從而促進植物生長發(fā)育。在高寒退化草地中施用菌肥后,土壤養(yǎng)分隨微生物菌肥施用量和施用時間的增加,整體呈增加趨勢[6]。添加微生物菌肥的關(guān)鍵是擁有適應(yīng)性強、促生能力穩(wěn)定,且不引起植物病害的菌株[30]。適宜若爾蓋高寒補播草地的菌種資源對該地區(qū)草地恢復(fù)尤為重要。本研究在低溫條件下,從若爾蓋高寒補播草地燕麥根際初步篩選出12株促生特性優(yōu)良的PGPR,通過接種燕麥促生試驗,最終篩選出4株促生效果最好的PGPR,并能夠有效促進燕麥生長和增加土壤速效磷含量。因此,這4株菌可作為菌種資源,在生產(chǎn)適宜若爾蓋高寒補播草地的微生物菌肥方面具有應(yīng)用潛力。

        研究表明,有較好應(yīng)用前景或者已經(jīng)在農(nóng)業(yè)中廣泛應(yīng)用的PGPR一般都兼具多種促生特性,可以促進植物生長、改善土壤環(huán)境[31]。本研究發(fā)現(xiàn),在補播草地土壤中,接種促生特性優(yōu)良的PGPR對燕麥生長具有顯著的促進作用(Plt;0.05),其中,菌株NCRS21對地上干重的促進作用最大,較CK增加23.31%,菌株NCHP9對莖粗的促進作用最大,較CK增加8.43%,菌株P(guān)CRS14對株高的促進作用最大,較CK增加12.60%,其原因可能是菌株P(guān)CRS14具有溶磷、分泌植物激素兩種促生特性,菌株NCRS21、NCHP9具有較高的固氮酶活性。萬兵兵等[32]研究表明,接種具有多種促生特性的短小芽孢桿菌YM4能顯著促進玉米根系的生長及養(yǎng)分吸收。因此,在土壤中,接種具有多種促生特性或單一促生特性較強的PGPR對植物生長具有顯著的促進作用(Plt;0.05)。

        氮素是植物生長的主要限制因子,對促進植物生長發(fā)育及提高產(chǎn)量具有重要作用,尤其在高寒草地生態(tài)系統(tǒng)中,植物能直接利用的氮素十分有限,僅為銨態(tài)氮和硝態(tài)氮[11,33]。土壤中的固氮菌可通過生物固氮,將空氣中的氮氣轉(zhuǎn)化為植物可利用的銨態(tài)氮供植物利用[34]。本研究發(fā)現(xiàn),接種菌株NCRS21,NCHP9對燕麥生長具有顯著的促進作用(Plt;0.05),較CK分別增加了11.05%,7.45%,這2株菌的固氮酶活性分別為203.51和201.12 nmol·h-1·mL-1,同時,Pearson相關(guān)性分析表明,菌株的固氮酶活性與燕麥的地上干重呈正相關(guān)性,例如,菌株NCRS21對地上干重的促進作用最大,較CK增加23.31%。接種固氮菌對垂穗披堿草的根系發(fā)育、株高、莖粗和生物量積累均有顯著的促進作用(Plt;0.05)[11],因此,具有較高固氮酶活性的固氮菌能夠為植物生長提供必要的氮素,從而增加生物量積累。其原因可能是接種的固氮菌通過固氮酶將較高價態(tài)N2還原為低價態(tài)NH3,固氮酶活性越高,為植物提供氮素就越多,從而促進植物生長發(fā)育[35]。

        磷作為植物生長所需的重要養(yǎng)分之一。土壤中含有大量的磷,但可供植物利用的磷,卻只占很小的一部分。土壤中的磷主要以難溶性的化合物形式存在,而植物只能吸收一價態(tài)(H2PO-4)或二價態(tài)(HPO2-4)形式的可溶性磷[36]。土壤中溶磷菌可將難溶性的磷釋放出來,供植物吸收利用。通過Pearson相關(guān)性分析可知,土壤速效磷含量與溶有機磷量呈正相關(guān)性(圖3)。因此,添加溶磷菌可提高溶磷微生物的活性和數(shù)量,加快土壤中難溶性磷酸鹽的溶解,提高土壤中磷的有效性[37]。本研究接種燕麥促生試驗發(fā)現(xiàn),促生特性優(yōu)良的PGPR對土壤速效磷含量的增長率為0.7%~193.97%,同時發(fā)現(xiàn),菌株P(guān)CRS13,MCRS16接種于土壤時,土壤速效磷含量較CK分別增加73.83%,186.70%,其中,菌株MCRS16具有溶有機磷和溶無機磷的兩種促生特性,而菌株P(guān)CRS13只具有溶無機磷的促生特性。陳臘等[38]研究表明,具有溶解無機磷和溶有機磷能力的菌株MZ3能顯著增加土壤速效磷含量,從而促進玉米對磷的吸收。因此,具有2種溶磷特性的PGPR能顯著增加土壤速效磷含量,其原因可能是菌株MCRS16可通過多種溶磷途徑,如分泌有機酸和磷酸酶等,溶解土壤中含磷的難溶性化合物,顯著增加土壤速效磷含量[39],其具體原因還有待進一步研究。

        假單胞菌屬(Pseudomonas)是農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中研究最多,土壤中最豐富的菌群之一,也是一類主要的PGPR,在維持土壤肥力和土壤結(jié)構(gòu)等方面起著重要作用,常接種農(nóng)作物來提高產(chǎn)量[40-41]。本研究篩選的12株促生特性優(yōu)良的PGPR以假單胞菌屬(Pseudomonas)為主,占總細菌數(shù)的91.67%。同樣,楊婉秋等[13]、劉曉婷等[42]從四川省阿壩藏族羌族自治州紅原縣的草地中篩選的PGPR以假單胞菌屬(Pseudomonas)為主,與本研究結(jié)果一致。

        4結(jié)論

        本研究篩選出了4株促生效果最好的PGPR,分別為菌株NCHP9,MCRS16,PCRS14,NCRS21,其中,菌株NCRS21,PCRS14對燕麥生長有顯著的促進作用(Plt;0.05),菌株NCHP9,MCRS16對土壤速效磷含量的有顯著的促進作用(Plt;0.05)。因此,這4株菌可作為菌種資源,在生產(chǎn)適宜若爾蓋高寒補播草地的微生物菌肥方面具有應(yīng)用潛力。

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        (責(zé)任編輯 彭露茜)

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