摘要：為研究添加劑甲酸對紫花苜蓿（Medicago sativa L.）青貯品質(zhì)、有氧暴露后微生物數(shù)量以及瘤胃降解特性的影響，分別在新鮮紫花苜蓿中添加0（CK），4（FA1），6（FA2），8 mL·kg^-1（FA3）甲酸后，室溫青貯60 d。通過隸屬函數(shù)法比較青貯品質(zhì)，篩選出青貯效果最佳的處理，測定其有氧暴露后微生物數(shù)量及瘤胃降解率。結(jié)果表明：與CK組相比，添加不同水平甲酸均能顯著提高紫花苜蓿干物質(zhì)（Dry matter，DM）、粗蛋白（Crude protein，CP）、可溶性碳水化合物及乳酸含量（Plt;0.05），顯著降低中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）及酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）、pH值、氨態(tài)氮比總氮（Plt;0.05）。通過隸屬函數(shù)法篩選出FA2處理總隸屬度最高。FA2組在有氧暴露后第0～6天的pH值、酵母菌和好氧菌計數(shù)顯著低于CK組（Plt;0.05）。瘤胃降解特性中，F(xiàn)A2組DM，CP，NDF及ADF有效降解率較CK組顯著提高（Plt;0.05）。綜上，添加6 mL·kg^-1甲酸青貯效果最佳。

關(guān)鍵詞：甲酸；紫花苜蓿；青貯；有氧穩(wěn)定性；瘤胃降解

中圖分類號：S816.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1007-0435（2023）04-1264-09

Effects of Formic Acid Treatment on the Quality and Rumen

Degradation Rate of Alfalfa Silage

FENG Qi-xian ZHANG Lei LI Yan LING Wen-qing LI Jue ZHOU Yi YANG Fu-lin ZHOU Jing

（1. College of Animal Sciences （College of Bee Science），F(xiàn)ujian Agriculture and Forestry University， Fuzhou， Fujian

Province 350002， China； 2. China National Engineering Research Center of JUNCAO Technology， Fujian Agriculture and

Forestry University， Fuzhou， Fujian Province 350002， China）

Abstract：This study aimed to investigate the effect of formic acid addition on the quality，number of microorganisms after aerobic exposure and rumen degradation characteristics of alfalfa （Medicago sativa L.） silage. Firstly，the fresh alfalfa was treaded with 0 （CK），4 （FA1），6 （FA2），and 8 mL·kg^-1 （FA3） formic acid addition，respectively，then silaged under the room temperature for 60 days. Then，the group with the best treatment effect was selected by comparing the silage quality with the membership function method，and the number of microorganisms after aerobic exposure and rumen degradation rate were further determined. The results showed：compared to the CK group，the quality of alfalfa silage was improved significantly with the addition of different levels of formic acid，including the significant increments （Plt;0.05） of the dry matter （DM），crude protein （CP），water soluble carbohydrates （WSC） and lactic acid （LA） contents，along with a significant decreases （Plt;0.05） of the contents of neutral detergent fiber （NDF） and acid detergent fiber （ADF），pH value，and ammonia nitrogen to total nitrogen. Through the method of membership function，F(xiàn)A2 treatment got the highest total score by membership evaluation. The pH value，yeast and aerobic bacteria counts of the FA2 group after aerobic exposure for 0～6 days were significantly lower than those of the CK group （Plt;0.05）. The effective degradation rates of DM，CP，NDF and ADF in the FA2 group were significantly higher than those of CK group in terms of rumen degradation characteristics （Plt;0.05）. In conclusion，the addition of 6 mL·kg^-1 formic acid had the best effect for alfalfa silage additive treatment.

Key words：Formic acid;Alfalfa;Silage;Aerobic stability;Rumen degradation

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）是世界范圍內(nèi)重要的豆科牧草，被廣泛認(rèn)為是畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有能量供給、蛋白質(zhì)供應(yīng)和礦物質(zhì)補(bǔ)充能力的優(yōu)良牧草［1］。然而紫花苜蓿的收獲常受雨季干擾，新鮮的紫花苜蓿含水量較高，制成干草易受雨淋和霉變的影響導(dǎo)致營養(yǎng)損耗［2］。因此，在氣候不允許調(diào)制干草的情況下，通常會選用青貯的方法對其進(jìn)行保存。青貯是一種有效、廣泛的飼料長期保存技術(shù)，通過保存新鮮飼料，在幫助家畜度過冬季和干旱季節(jié)方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［3］。乳酸菌在青貯厭氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生乳酸，通過形成酸性環(huán)境來調(diào)節(jié)微生物群落，從而保存飼草養(yǎng)分［4］。然而，紫花苜蓿被認(rèn)為是一種青貯難以成功的牧草，主要是因為它具有高緩沖能力和低含量的可溶性碳水化合物（WSC），限制了乳酸的生產(chǎn)，導(dǎo)致牧草未能快速酸化［5］。因此，應(yīng)用添加劑降低紫花苜蓿青貯過程中的營養(yǎng)損失已成為研究者和生產(chǎn)者的共識。由于豆科青貯料的粗蛋白含量相對于其他草料更高，因此蛋白質(zhì)的保存尤為重要。甲酸作為發(fā)酵抑制劑已廣泛應(yīng)用于青貯生產(chǎn)，主要通過降低pH值，營造酸性環(huán)境來抑制不良微生物發(fā)酵，減少青貯過程中營養(yǎng)物質(zhì)的流失［6］。在動物生產(chǎn)中，限制發(fā)酵的添加劑相比促進(jìn)發(fā)酵的添加劑可能產(chǎn)生更高的瘤胃微生物能量，因為前者能使青貯料中保留更多的可溶性糖［7］。

消化率作為評價飼料價值的重要指標(biāo)之一，它影響飼料的攝入量，并在很大程度上取決于飼料的營養(yǎng)成分［8］。以往研究主要集中于有機(jī)酸對青貯發(fā)酵效果的探究，而青貯料的利用潛力高低不僅需要對其結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行化學(xué)分析還取決于動物體內(nèi)的消化情況［9-10］。動物對飼料的利用效率是動物生產(chǎn)研究中的一個重要過程［11］。瘤胃降解率的測定為確定青貯飼料營養(yǎng)價值提供了必要的信息，能夠驗證青貯料品質(zhì)的改善是否能轉(zhuǎn)化為更高的瘤胃降解率［12］。尼龍袋法廣泛用于探究飼料的瘤胃降解特性，是眾多飼料評估系統(tǒng)中的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，其優(yōu)點在于可直接測量瘤胃內(nèi)消化情況，準(zhǔn)確評估飼料營養(yǎng)價值［13］。張凡凡等［14］聯(lián)合接種布氏乳桿菌及纖維素分解菌有效改善青貯玉米的發(fā)酵品質(zhì)，但對NDF，ADF及有機(jī)物的有效降解率未產(chǎn)生顯著影響。鑒于此，本研究通過添加不同水平甲酸對紫花苜蓿青貯飼料營養(yǎng)品質(zhì)及發(fā)酵品質(zhì)的影響，并采用隸屬函數(shù)法篩選出適宜添加量，進(jìn)一步探究其對青貯紫花苜蓿有氧暴露后微生物數(shù)量和瘤胃降解特性的影響，旨在為紫花苜蓿青貯生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

本試驗紫花苜蓿于2021年5月份采自甘肅省定西市農(nóng)業(yè)試驗站，初花期進(jìn)行刈割，留茬高度為2～3 cm，青貯前用鍘刀切至1～2 cm備用。紫花苜蓿原料營養(yǎng)品質(zhì)見表1。甲酸（純度gt;99%）選購自福州麥力生物有限公司。

1.2試驗設(shè)計

采用單因素試驗設(shè)計，根據(jù)甲酸（Formic acid，F(xiàn)A）添加水平的不同，共分為4個處理組，其中添加量為0作為對照組（CK），其余3個水平分別為4（FA1），6（FA2）和8 mL·kg^-1（FA3），F(xiàn)A添加以鮮重為基礎(chǔ)進(jìn)行，將相應(yīng)水平FA用蒸餾水混至10 mL，對照組添加10 mL蒸餾水。各處理組設(shè)3個重復(fù)，每個重復(fù)稱取約400 g混勻后并噴灑相應(yīng)水平FA的青貯原料，立即裝入聚乙烯袋（24 cm×35 cm），用真空機(jī)抽真空密封后于室溫下（27℃）貯存。青貯60 d開袋取樣，稱取200 g烘干粉碎后測定營養(yǎng)成分，稱取10 g加水浸提測定發(fā)酵指標(biāo)，通過隸屬函數(shù)法綜合評價后篩選出最佳發(fā)酵處理組，并進(jìn)一步測定其對有氧穩(wěn)定性和瘤胃降解特性的影響。

于福建農(nóng)林大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院（蜂學(xué)學(xué)院）開展瘤胃降解試驗，選用3只體重相近（24.5±2.0）kg、體況良好、裝有永久性羊用瘺管（40 mm）的20月齡的閩東山羊。試驗羊為1公2母。試驗羊日糧組成包括粗料與混合精料其中以雜交狼尾草和羊草為粗料占比60%，混合精料成分為23%玉米、8%麥麩、6%全棉籽、3%預(yù)混料。試驗羊于每天9∶00及18∶30飼喂2次，自由采食及飲水。試驗前將各組青貯風(fēng)干樣品于65℃烘48 h，準(zhǔn)確稱取4 g過篩（40目）后青貯樣放至尼龍袋內(nèi)（孔徑300目，規(guī)格8 cm×13 cm）。每只山羊為一個重復(fù)，共三個重復(fù)，每個降解點每只羊設(shè)兩個平行，用一條尼龍繩固定，于晨飼前2 h放入待測。采用“同時放入，分別取出”的方法，在放袋后4，8，12，24，48及72 h于每只羊各取2個尼龍袋，3只羊同一時間點共取出6袋。到達(dá)各時間點后將尼龍袋取出后立即洗凈，于65℃烘干至恒重室溫下保存?zhèn)錅y。

1.3指標(biāo)測定與方法

1.3.1營養(yǎng)成分及發(fā)酵特征分析青貯60 d開袋后，采用四分法縮分200 g樣品于65℃烘至恒重后測定干物質(zhì)（Dry matter，DM）含量。樣品干燥后粉碎并過篩，參照Van Soest等［15］的方法測定中性洗滌纖維（Neutral detergent fiber，NDF）及酸性洗滌纖維（Acid detergent fiber，ADF）含量。粗蛋白（Crude protein，CP）及總氮（Total nitrogen，TN）含量通過KDN-103F型定氮儀測定［16］。采用蒽酮法測定可溶性碳水化合物（Water soluble carbohydrates，WSC）［17］。

每個青貯袋取10 g樣，按1∶9料液比加入90 mL蒸餾水，裝入錐形瓶并密封后于4℃浸提24 h，濾液經(jīng)4層紗布過濾獲得，隨即檢測pH，另分裝部分進(jìn)行氨態(tài)氮（NH₃-N）及有機(jī)酸濃度檢測。依據(jù)苯酚-次氯酸鈉比色法［18］測定NH₃-N含量，乳酸（Lactic acid，LA）、乙酸（Acetic acid，AA）和丙酸（Propionic acid，PA）含量參照張娟等［19］的方法測定。

1.3.2隸屬函數(shù)分析采用隸屬函數(shù)法對青貯紫花苜蓿營養(yǎng)品質(zhì)及發(fā)酵指標(biāo)進(jìn)行綜合評價，以DM，CP，WSC，LA為正向指標(biāo)，NDF，ADF，pH，AA，PA，BA，NH₃-N（%TN）為負(fù)向指標(biāo)，各隸屬度求和后將總隸屬度排序，得出最佳處理（綜合評價高以總隸屬度高為標(biāo)準(zhǔn)）［20］。計算公式如下：

U_x（+）=（X_i-X_min）/（X_max-X_min）

U_x（-）=1-（X_ij-X_min）/（X_max-X_min）

U_xA=∑ⁿ_j=₁U_x

式中：U_x（+）正為某指標(biāo)正向隸屬度，U_x（-）負(fù)為某指標(biāo)負(fù)向隸屬度；X_i為各指標(biāo)實際測定值；X_max為各指標(biāo)實際測定最大值；X_min各指標(biāo)實際測定最小值，U_xA為總隸屬度；i表示某一處理，j表示評價指標(biāo)，n為指標(biāo)數(shù)。

1.3.3有氧暴露后pH及微生物數(shù)量分析青貯60 d開袋后進(jìn)行有氧暴露6 d，并于暴露后的第0，3，6 d分別取樣，測定pH值、乳酸菌、酵母菌（Yeast）及好氧菌（Aerobic bacteria）的數(shù)量，每個時間點各組設(shè)置3個重復(fù)，用于評定苜蓿青貯料的有氧穩(wěn)定性。微生物計數(shù)參照宗成等［21］的方法采用平板計數(shù)法，分別選擇MRS，PDA和PCA培養(yǎng)基培養(yǎng)乳酸菌、酵母菌及好氧菌。有氧穩(wěn)定性通過開袋后pH值及微生物數(shù)量進(jìn)行分析。

1.3.4瘤胃降解率分析瘤胃降解率主要通過測定各組青貯料在肉羊瘤胃內(nèi)不同時間點的DM，CP，NDF和ADF的含量計算其降解率［22］。

各時間點某營養(yǎng)成分降解率的計算公式如下：

X=［（M_a-M_b）/M_a］×100

式中：X為某營養(yǎng)物質(zhì)實時降解率（%）；M_a為降解前某營養(yǎng)物質(zhì)重（g）；M_b為降解后某營養(yǎng)物質(zhì)重（g）。

參照?rskov等［23］建立的模型，進(jìn)行樣品降解率和參數(shù)的計算。

y=a+b（1-e^-ct）

ED=a+bc/（k+c）

式中：y為某成分在瘤胃t時刻的瘤胃降解率； ED為某成分瘤胃有效降解率（%）；a為快速降解部分（%）；b為慢速降解部分（%）；c為b的降解速率（%·h^-1）；k為營養(yǎng)物質(zhì)的瘤胃外流速率（%·h^-1），本試驗k取0. 0235 %·h^-1。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析

數(shù)據(jù)經(jīng)Excel 2019初步整理后，采用SPSS 25.0進(jìn)行單因素方差分析，并用Duncan氏法進(jìn)行多重比較，Plt;0.05表示差異顯著，結(jié)果通過平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2結(jié)果與分析

2.1甲酸對苜蓿青貯營養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)的影響

由表2可知，和CK組相比，添加FA可顯著抑制苜蓿青貯料的DM和CP含量的降解（Plt;0.05），其中FA2組CP含量最高，為29.11%。與CK組相比，F(xiàn)A1和FA2組顯著降低NDF和ADF含量（Plt;0.05），其中FA2組分別降低了6.44%和22.99%。FA2和FA3組WSC含量分別為3.39%和3.48%，顯著高于CK和FA1組（Plt;0.05）。

由表2可知，各處理組與CK組相比，pH，AA及NH₃-N含量均顯著降低（Plt;0.05），PA顯著升高（Plt;0.05），其中隨著FA添加量的增加，pH呈現(xiàn)顯著降低趨勢（Plt;0.05）。FA2和FA3組較CK和FA1組相比，LA含量得到顯著提高（Plt;0.05），其中FA2組LA含量最高，為3.55%。FA2和FA3組AA含量顯著高于FA1組（Plt;0.05），同時CK組AA含量最高，為0.43%。FA1、FA2組PA含量均為0.90%，顯著高于CK和FA3組（Plt;0.05）。FA2組BA含量顯著低于其他各組（Plt;0.05），為0.04%。FA2與FA3組NH₃-N水平差異不顯著，分別為0.59%和0.51%，均顯著低于其他組（Plt;0.05）。

2.2苜蓿青貯料隸屬函數(shù)分析

本試驗中，采用隸屬函數(shù)法綜合評價各處理對紫花苜蓿的青貯效果，結(jié)果如表3所示。通過比較各處理總隸屬度，各FA處理均增加了紫花苜蓿的隸屬函數(shù)值，提高了青貯品質(zhì)，其中FA2處理青貯效果最好，其總隸屬度值最大。因此，篩選FA2處理進(jìn)一步探究有氧暴露后pH值及微生物變化，并測定其瘤胃降解率。

2.3甲酸對苜蓿青貯料有氧暴露后pH值及微生物數(shù)量的影響

由表4可知，隨著有氧暴露天數(shù)的遞增，CK組pH值不斷升高（Plt;0.05）。較CK組相比，F(xiàn)A2組的pH值在有氧暴露第0，3，6 d均顯著降低（Plt;0.05），且呈先升高后降低的趨勢（Plt;0.05）。CK組LAB數(shù)量先降低后升高（Plt;0.05），在有氧暴露第0，6 d顯著高于FA2組（Plt;0.05）。FA2組的LAB數(shù)在有氧暴露第6 d顯著低于第0，3 d（Plt;0.05）。各組好氧菌計數(shù)隨著有氧暴露天數(shù)增加不斷提高（Plt;0.05），F(xiàn)A2組乳酸菌計數(shù)顯著低于CK組（Plt;0.05）。CK組酵母菌數(shù)在有氧暴露第6 d顯著增加（Plt;0.05），F(xiàn)A2組在有氧暴露期間均顯著低于CK組（Plt;0.05）。

2.4甲酸對苜蓿青貯瘤胃降解率及降解參數(shù)的影響

由表5可知，隨著青貯樣品在瘤胃內(nèi)降解時間的增加，CK和FA2組的四種營養(yǎng)成分降解率不斷升高。較CK組相比，F(xiàn)A2組樣品的干物質(zhì)降解率（Dry matter degradation，DMD）和粗蛋白降解率（Crude protein degradation，CPD）在各個降解時間點均顯著提高（Plt;0.05），降解24 h時，DMD和CPD分別提高了126.87%和27.75%，72 h時DMD和CPD分別為80.40%和80.01%分別提高了22.71%和7.45%。除瘤胃降解48 h外，與CK相比，F(xiàn)A2組中性洗滌纖維降解率（Neutral detergent fiber degradation，NDFD）均顯著提高（Plt;0.05），降解72 h時達(dá)到61.84%。瘤胃降解4 h，F(xiàn)A2組的酸性洗滌纖維降解率（Acid detergent fiber degradation，ADFD）顯著高于CK組（Plt;0.05），提高了57.67%，72 h時ADFD提高5.40%。

由表6可知，與CK組相比，F(xiàn)A2組的DM，CP，NDF和ADF快速降解部分、潛在可降解部分及有效降解率（ED）均顯著提高（Plt;0.05），其中ED分別提高了17.94%，11.32%，13.76%和7.68%（Plt;0.05）。

3討論

3.1甲酸對苜蓿青貯營養(yǎng)成分及發(fā)酵品質(zhì)的影響

牧草青貯過程中，細(xì)胞的呼吸作用與微生物對碳水化合物的利用導(dǎo)致青貯飼料的干物質(zhì)損失［24］。FA作為一種發(fā)酵抑制劑，具有生產(chǎn)成本低和酸化能力強(qiáng)的特點，通過抑制發(fā)酵過程中不良微生物活動，從而抑制蛋白質(zhì)分解［25］。青貯期間，植物蛋白酶被認(rèn)為在紫花苜蓿蛋白質(zhì)分解中起著重要作用［26］。本研究中，添加不同比例FA均顯著提高了青貯苜蓿DM及WSC含量并抑制了青貯過程中CP降解，可能是因為各FA處理中未解離酸使植物蛋白酶失活從而減少蛋白損失。紫花苜蓿青貯料中植物蛋白酶在pH值5.0～6.0有較高的活性，而CK組pH值（5.83）在此范圍內(nèi)，可能是其CP降解的主要原因［27］。青貯期間結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解是由酶、酸及微生物的活動造成。本研究中，添加FA使NDF及ADF值不同程度的降低，其中FA1及FA2組的NDF值均顯著低于CK組，但FA3組與CK差異并不顯著，表明適宜的FA添加量才能利于苜蓿的纖維降解［6］。王瑩等［28］研究發(fā)現(xiàn)，添加0.2%，0.4%和0.6% FA均能提高苜蓿青貯后WSC含量，與本試驗研究結(jié)果相似，這可能的原因是酸化環(huán)境抑制了好氧微生物的活動，從而使苜蓿原料中WSC含量得到了較好的保存［29］。通常優(yōu)質(zhì)的青貯飼料同時具備較低pH值及高乳酸含量［30］。本試驗中，基于FA的酸性作用各處理組pH值均顯著降低，且隨著FA添加量的增加呈顯著降低趨勢。有研究表明添加FA能夠可提高厭氧環(huán)境下乳酸菌的絕對優(yōu)勢，使發(fā)酵快速進(jìn)入乳酸菌發(fā)酵期，迅速縮短了此過程中與不良微生物對發(fā)酵底物的競爭，從而提高LA含量［31］。丁武蓉等［32］探究不同水平FA處理下胡枝子青貯的影響，發(fā)現(xiàn)添加2 mL·kg^-1 FA促進(jìn)乳酸發(fā)酵，而添加量達(dá)到6 mL·kg^-1時抑制乳酸菌活性，降低有機(jī)酸產(chǎn)量。本試驗中，F(xiàn)A添加組LA含量較CK組均顯著提高，隨著FA濃度提升，F(xiàn)A3組LA含量低于FA2組，表明高濃度的FA在抑制雜菌生長的同時，也可能會抑制乳酸菌的繁殖活動，選擇適宜的FA添加量才能保證苜蓿最佳發(fā)酵品質(zhì)［33］。LA與AA之間的比例關(guān)系通常被認(rèn)為是發(fā)酵的定性指標(biāo)［34］。Ren等［35］的報告指出LA與AA的比例超過3∶1時，表明乳酸菌是以同型乳酸菌發(fā)酵為主。本研究中，各FA處理顯著降低了AA含量，結(jié)合LA含量的提高，說明青貯添加FA可能是由同型乳酸菌主導(dǎo)的發(fā)酵。Yuan等［36］以FA添加量為4 g·kg^-1進(jìn)行苜蓿青貯時發(fā)現(xiàn)，青貯60 d后，F(xiàn)A處理組pH值，AA，NH₃-N和BA含量均得到有效降低，同時能夠抑制霉菌、酵母菌等不良微生物的數(shù)量，進(jìn)而較好地保存了苜蓿青貯原料DM含量。PA具有較強(qiáng)抗真菌性可抑制酵母菌的生長和減少氨的產(chǎn)生［37］。在本試驗中，各FA處理組的PA含量均較CK有所提高，同時NH₃-N含量顯著低于CK，表明FA的添加抑制了蛋白質(zhì)的分解。青貯料中發(fā)現(xiàn)了丙酸桿菌可以將LA和葡萄糖轉(zhuǎn)化為AA及PA，而各FA處理中是否存在該菌屬有待進(jìn)一步研究［38］。崔鑫［39］的研究指出，添加FA能夠降低青貯料pH值，AA和BA含量，提高DM和WSC含量，在整個青貯過程中TN含量無顯著變化，但隨著FA添加量的增加NH₃-N含量呈降低趨勢。陳盧亮等［40］以苜蓿為原料，探究發(fā)酵抑制劑在青貯上應(yīng)用效果時發(fā)現(xiàn)，當(dāng)FA添加量為0.5%時能夠顯著降低BA含量。丁酸的減少意味著梭菌生長被抑制［41］。在本試驗中，當(dāng)添加量為6 mL·kg^-1時，BA含量顯著低于CK組。在多指標(biāo)測定的背景下，通過隸屬函數(shù)法可以對事物進(jìn)行綜合性的評價［42］。當(dāng)前隸屬函數(shù)法已廣泛用于青貯飼料評價，可以避免單一指標(biāo)評價青貯品質(zhì)的片面性［43］。本研究中，將4個處理測定的11個指標(biāo)進(jìn)行總隸屬度比較，F(xiàn)A2組高于其他組，表明其青貯品質(zhì)最佳。

3.2甲酸對苜蓿青貯料有氧暴露后pH值及微生物數(shù)量的影響

反芻動物飼喂過程中，青貯飼料不可避免地與空氣接觸，造成青貯飼料部分有氧腐?。?4］。在有氧暴露過程中，好氧微生物繁殖增強(qiáng)是pH值升高主要原因之一，其中酵母菌繁殖活動增強(qiáng)，導(dǎo)致青貯料中的乳酸發(fā)生大量代謝，降低飼料營養(yǎng)品質(zhì)［45-46］。尹祥等［47］通過比較不同有氧暴露天數(shù)后pH值上升幅度來確定添加不同吸濕材料青貯象草的有氧穩(wěn)定性，以pH值上升幅度小作為有氧穩(wěn)定性好的標(biāo)準(zhǔn)。研究表明，青貯料有氧暴露后pH值提高0.5即視為好氧變質(zhì)［48］。本研究中，隨著與氧氣接觸時間的延長，CK處理的pH值顯著增加，但FA2組pH值始終維持在較低水平，且好氧菌和酵母菌增數(shù)幅度較低，有氧穩(wěn)定性有所提升。不同有氧暴露天數(shù)下，F(xiàn)A2組pH值變化呈現(xiàn)先顯著升高后顯著降低，可能是因為青貯結(jié)束后更高的LA及WSC含量提供了更多的微生物生長底物，使青貯料在有氧暴露條件下更不穩(wěn)定［49］。本研究中，F(xiàn)A2處理乳酸菌數(shù)量在有氧暴露6 d后顯著降低，可能是因為乳酸菌最適pH值為5.5～6，而FA2組的pH水平限制了乳酸菌菌體生長［38］。當(dāng)酵母菌數(shù)量超過5 lg cfu·g^-1 FW時，青貯料容易發(fā)生好氧變質(zhì)［50］。與CK相比，F(xiàn)A2組酵母菌及好氧菌數(shù)量在不同有氧暴露天數(shù)均顯著降低，但仍超過5 lg cfu·g^-1 FW的標(biāo)準(zhǔn)，可能是由于青貯60 d結(jié)束后乙酸水平偏低（0.12%）而不足以抑制酵母菌增殖［34］。此外，酵母菌也已被發(fā)現(xiàn)對FA具有耐受性［51］。

3.3甲酸對苜蓿青貯瘤胃降解率及降解參數(shù)的影響

尼龍袋法作為評價飼料利用難易程度的一種方法，常用于研究飼料在瘤胃中的降解率及利用率［52］。干物質(zhì)降解率反映了飼料在瘤胃內(nèi)的整體降解情況以及瘤胃可吸收營養(yǎng)物質(zhì)的量［53］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)A2處理下各時間點DMD均顯著高于CK處理，且24 h干物質(zhì)降解率達(dá)到67.59%，相較CK處理提高了25.56%，表明添加FA可促進(jìn)青貯苜蓿在瘤胃內(nèi)消化。此外，F(xiàn)A2組DMD在12～24 h時段漲幅最大，表明該時段FA2組快速降解，被試驗羊更快消化吸收。FA2組較高的DMD可能是因為其適宜的干物質(zhì)和粗纖維含量促進(jìn)了瘤胃蠕動［54］。李夢楚等［55］采用6.0 g·kg^-1FA青貯菠蘿莖葉，干物質(zhì)降解率相比對照組顯著提高，與本研究結(jié)果一致。飼料中CP的降解率主要由飼料CP含量和瘤胃內(nèi)滯留時間決定［56］。Ma等［52］的研究表明，CP有效降解率與其24 h瘤胃降解率相關(guān)性最高。本研究中，F(xiàn)A2組CP的24瘤胃降解率超過70%，較高的CP含量可能也是其降解率高的原因。FA通過酸解作用增強(qiáng)了對青貯苜蓿纖維結(jié)構(gòu)性碳水化合物的降解，增加了微生物對紫花苜蓿的可及性，因此相比CK組，F(xiàn)A組CP的快速降解部分和ED顯著上升，慢速降解部分有所下降［13］。CPD中快速降解部分占比高表明其具有較高的營養(yǎng)價值，快速降解部分分解的主要是非蛋白氮，是瘤胃微生物的生長所需的氮源［57］。NDFD和ADFD是衡量飼料結(jié)構(gòu)性碳水化合物利用程度的重要參數(shù)，其值大小可反映瘤胃內(nèi)飼料纖維組分的消化情況。牧草在瘤胃中的滯留時間的長短、纖維組成及瘤胃內(nèi)纖維素降解菌的活性高低皆為其利用程度的關(guān)鍵因素［58］。本研究中，F(xiàn)A2組較CK組NDF及ADF慢速降解部分顯著降低，同時快速降解部分及ED顯著升高，與許慶方等［59］的研究結(jié)果相似。這可能源于FA2組青貯結(jié)束時更低的NDF及ADF含量，有助于瘤胃中產(chǎn)消化酶的微生物附著使其纖維組分快速降解［14］。此外，牧草中潛在可降解部分的比例及其降解率對營養(yǎng)價值具有重要影響［60］。本研究中，F(xiàn)A組DM，CP，NDF及ADF潛在可降解部分均較CK組顯著提高。綜合各營養(yǎng)物質(zhì)在瘤胃內(nèi)降解情況可知，6 mL·kg^-1FA可顯著提高青貯苜蓿的瘤胃降解率。

4結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，添加不同比例FA均能有效改善紫花苜蓿青貯品質(zhì)，結(jié)合隸屬函數(shù)法得出6 mL·kg^-1 FA處理組青貯效果更佳。青貯60 d后，6 mL·kg^-1FA處理組CP，WSC及LA含量較高，ADF含量較低，在營養(yǎng)成分保存及發(fā)酵效果方面表現(xiàn)最佳；6 mL·kg^-1FA處理組有氧暴露6 d時，有效維持酸性環(huán)境，減少酵母菌及好氧菌生長，延緩了紫花苜蓿青貯后二次發(fā)酵；同時，6 mL·kg^-1FA處理組顯著提高紫花苜蓿青貯后的肉羊瘤胃降解率。綜上所述，本研究結(jié)果可為生產(chǎn)實踐中獲取更優(yōu)質(zhì)的苜蓿青貯料及在肉羊生產(chǎn)中的科學(xué)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］WANG C，HE L，XING Y，et al. Fermentation quality and microbial community of alfalfa and stylo silage mixed with Moringa oleifera leaves［J］. Bioresource Technology，2019（284）：240-247

［2］HUO W，WANG X，WEI Z，et al. Effect of lactic acid bacteria on the ensiling characteristics and in vitro ruminal fermentation parameters of alfalfa silage［J］. Italian Journal of Animal Science，2021，20（1）：623-631

［3］XIA T，WANG T，SUN J，et al. Modulation of fermentation quality and metabolome in co-ensiling of sesbania cannabina and sweet sorghum by lactic acid bacterial inoculants［J］. Frontiers in Microbiology，2022（13）：851271

［4］DU Z，LIN Y，SUN L，et al. Microbial community structure，co-occurrence network and fermentation characteristics of woody plant silage［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，2022，102（3）：1193-1204

［5］張歡，牟怡曉，張桂杰. 添加枸杞副產(chǎn)物對紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)及微生物多樣性的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2022，31（4）：136-144

［6］于浩然，格根圖，王志軍，等. 甲酸添加劑及青貯時間對紫花苜蓿青貯品質(zhì)的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2020，29（3）：89-95

［7］AKSU T，BAYTOK E，KARSL M A，et al. Effects of formic acid，molasses and inoculant additives on corn silage composition，organic matter digestibility and microbial protein synthesis in sheep［J］. Small Ruminant Research，2006，61（1）：29-33

［8］IOMMELLI P，ZICARELLI F，MUSCO N，et al. Effect of cereals and legumes processing on In Situ rumen protein degradability：a review［J］. Fermentation，2022，8（8）：363

［9］HE L，WANG C，XING Y，et al. Dynamics of proteolysis，protease activity and bacterial community of Neolamarckia cadamba leaves silage and the effects of formic acid and Lactobacillus farciminis［J］. Bioresource Technology，2019（294）：122127

［10］趙金鵬，趙杰，李君風(fēng)，等. 不同添加劑對水稻秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)和結(jié)構(gòu)性碳水化合物組分的影響［J］. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2019，42（1）：152-159

［11］DIAOX，DANG S，LIU S，et al. Determination of the appropriate ratio of sample size to nylon bag area for in situ nylon bag technique evaluation of rumen digestibility of feedstuffs in sheep［J］. Livestock Science，2020（241）：104254

［12］DAZA J，BENAVIDES D，PULIDO R，et al. Rumen in vitro fermentation and in situ degradation kinetics of winter forage brassicas crops［J］. Animals，2019，9（11）：904

［13］劉桃桃，王思偉，李秋鳳，等. 利用尼龍袋法比較3個全株玉米品種青貯前后肉牛瘤胃降解特性［J］. 草業(yè)學(xué)報，2021，30（1）：159-169

［14］張凡凡，張玉琳，王旭哲，等. 纖維素分解菌與布氏乳桿菌聯(lián)合接種對青貯玉米發(fā)酵品質(zhì)、有氧穩(wěn)定性和瘤胃降解參數(shù)的影響［J］. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2021，33（3）：1735-1746

［15］VAN SOEST P J，ROBERSTON J B，LEWIS B A. Methods for dietary fiber，neutral detergent fiber，and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition［J］. Journal of Dairy Science，1991，74（10）：3583-3597

［16］FENG Q，SHI W，CHEN S， et al. Addition of organic acids and Lactobacillus acidophilus to the leguminous forage Chamaecrista rotundifolia improved the quality and decreased harmful bacteria of the silage［J］. Animals，2022，12（17）：2260

［17］ARTHUR T T. An automated procedure for the determination of soluble carbohydrates in herbage［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，1977，28（7）：639-642

［18］BRODERICK G A，KANG J H. Automated simultaneous determination of ammonia and total amino acids in ruminal fluid and in vitro media［J］. Journal of Dairy Science，1980，63（1）：64-75

［19］張娟，史文嬌，韓雪林，等. 蘋果酸和嗜酸乳桿菌對圓葉決明青貯品質(zhì)及微生物多樣性的影響［J］. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2021，33（12）：6941-6952

［20］趙小雪，王仕玉，郭鳳根，等. 乳酸菌及纖維素酶對不同藜麥秸稈青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響［J］. 草地學(xué)報，2022，30（10）：2827-2833

［21］宗成，張健，邵濤，等. 添加劑對紫花苜蓿青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2020，29（12）：180-187

［22］盧德勛，謝崇文. 現(xiàn)代反芻動物營養(yǎng)研究方法和技術(shù)［M］. 北京：農(nóng)業(yè)出版社，1991：68-76

［23］RSKOV E R，MCDONALD I. The estimation of protein degradability in the rumen from incubation measurements weighted according to rate of passage［J］. The Journal of Agricultural Science，1979，92（2）：499-503

［24］WILLIAMS S D，SHINNERS K J. Farm-scale anaerobic storage and aerobic stability of high dry matter sorghum as a biomass feedstock［J］. Biomass and Bioenergy，2012（46）：309-316

［25］KUNG L，STOKES M R，LIN C J. Silage additives：silage science and technology［J］. Madison：American Society of Agronomy，2003（42）：305-360

［26］AMER S，HASSANAT F，BERTHIAUME R，et al. Effects of water soluble carbohydrate content on ensiling characteristics，chemical composition and in vitro gas production of forage millet and forage sorghum silages［J］. Animal Feed Science and Technology，2012，177（1-2）：23-29

［27］ZHAO S，YANG F，WANG Y， et al. Dynamics of fermentation parameters and bacterial community in high-moisture alfalfa silage with or without lactic acid bacteria［J］. Microorganisms，2021，9（6）：1225

［28］王瑩，玉柱. 不同添加劑對紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響［J］.中國草地學(xué)報，2010，32（5）：80-84

［29］吳長榮，代勝，梁龍飛，等. 不同添加劑對構(gòu)樹青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和蛋白質(zhì)降解的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2021，30（10）：169-179

［30］張佳偉，賈玉山，格根圖，等. 不同丙酸濃度對天然牧草青貯品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響［J］. 草地學(xué)報，2022，30（9）：2522-2528

［31］劉庭玉，賈玉山，侯美玲，等. 添加甲酸對天然草地牧草青貯品質(zhì)的影響［J］. 中國飼料，2019（21）：31-34

［32］丁武蓉，干友民，郭旭生，等. 甲酸對二色胡枝子青貯品質(zhì)的影響［J］. 草地學(xué)報，2008，16（1）：81-84

［33］ZHAO J，WANG S，DONG Z，et al. Effect of storage time and the level of formic acid on fermentation characteristics，epiphytic microflora，carbohydrate components and in vitro digestibility of rice straw silage［J］. Animal Bioscience，2021，34（6）：1038-1048

［34］MUCK R E，NADEAU E M G，MCALLISTER T A，et al. Silage review：Recent advances and future uses of silage additives［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（5）：3980-4000

［35］REN H，WANG C，F(xiàn)AN W，et al. Effects of formic or acetic acid on the storage quality of mixed air-dried corn stover and cabbage waste，and microbial community analysis［J］. Food Technology and Biotechnology，2018，56（1）：71

［36］YUAN X，WEN A，DONG Z，et al. Effects of formic acid and potassium diformate on the fermentation quality，chemical composition and aerobic stability of alfalfa silage［J］. Grass and Forage Science，2017，72（4）：833-839

［37］任海偉，竇俊偉，趙拓，等. 添加劑對玉米秸稈和萵筍葉混貯品質(zhì)的影響［J］.草業(yè)學(xué)報，2016，25（10）：142-152

［38］KUNG JR L，SHAVER R D，GRANT R J，et al. Silage review：Interpretation of chemical，microbial，and organoleptic components of silages［J］. Journal of Dairy Science，2018，101（5）：4020-4033

［39］崔鑫. 添加甲酸及混合青貯對紫花苜蓿發(fā)酵特性和營養(yǎng)品質(zhì)的影響［D］.南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2015：19-21

［40］陳盧亮，李靜.發(fā)酵抑制劑對紫花苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響［J］. 中國奶牛，2011（11）：54-57

［41］張海鉉，霍文婕，陳雷，等. 添加劑對紫花苜蓿青貯品質(zhì)及小腸可吸收氨基酸的影響［J］. 草地學(xué)報，2022，30（5）：1302-1309

［42］劉建寧，石永紅，吳欣明，等. 晉中盆地15個青貯玉米品種生產(chǎn)性能及營養(yǎng)價值評價［J］. 草地學(xué)報，2020，28（4）：1043-1049

［43］張志恒，王玉琴，任國艷，等. 基于主成分分析和隸屬函數(shù)分析評價不同添加劑處理的玉米秸稈青貯的發(fā)酵品質(zhì)［J］. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2022，34（4）：2677-2688

［44］BESHARATI M，PALANGI V，GHOZALPOUR V，et al. Essential oil and apple pomace affect fermentation and aerobic stability of alfalfa silage［J］. South African Journal of Animal Science，2021，51（3）：371-377

［45］WEISS K，KROSCHEWSKI B，AUERBACH H. Effects of air exposure，temperature and additives on fermentation characteristics，yeast count，aerobic stability and volatile organic compounds in corn silage［J］. Journal of Dairy Science，2016，99（10）：8053-8069

［46］TURAN A，NENC S S. Effect of cumin essential oil usage on fermentation quality，aerobic stability and in vitro digetibility of alfalfa silage［J］. Asian-Australasian Journal of Animal Sciences，2018，31（8）：1252

［47］尹祥，王詠琪，李鑫琴，等. 不同水分吸附材料對象草青貯發(fā)酵品質(zhì)及好氧穩(wěn)定性的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2021，30（7）：133-138

［48］MU L，XIE Z，HU L， et al. Lactobacillus plantarum and molasses alter dynamic chemical composition，microbial community，and aerobic stability of mixed （amaranth and rice straw） silage［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture，2021，101（12）：5225-5235

［49］WILKINSON J M，DAVIES D R. The aerobic stability of silage：key findings and recent developments［J］. Grass and Forage Science，2013，68（1）：1-19

［50］WANG M，YANG C，JIA L，et al. Effect of Lactobacillus buchneri and Lactobacillus plantarum on the fermentation characteristics and aerobic stability of whipgrass silage in laboratory silos［J］. Grassland Science，2014，60（4）：233-239

［51］MCDONALD P，HENDERSON A R，HERON S J E. The biochemistry of silage［M］. Kingston：Chalcombe Publications，1991：48-58

［52］MA Y，KHAN M Z，LIU Y，et al. Analysis of nutrient composition，rumen degradation characteristics，and feeding value of Chinese rye grass，barley grass，and naked oat straw［J］. Animals，2021，11（9）：2486

［53］王挺，宋磊，王旭哲，等. 番茄皮渣與高粱秸稈混貯的發(fā)酵品質(zhì)、瘤胃降解率及有氧穩(wěn)定性［J］. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2022，34（3）：1809-1819

［54］王挺，宋磊，王旭哲，等. 復(fù)合乳酸菌對番茄皮渣與苜?；旌锨噘A發(fā)酵品質(zhì)及瘤胃降解率的影響［J］. 草業(yè)學(xué)報，2022，31（10）：167-177

［55］李夢楚，王定發(fā)，周漢林，等.添加纖維素酶或甲酸對青貯菠蘿莖葉飼用品質(zhì)的影響［J］. 中國畜牧獸醫(yī)，2014，41（8）：95-100

［56］王吉東，周春元，呂佳穎，等.奶牛常用蛋白質(zhì)飼料和粗飼料的瘤胃降解特性研究［J］. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2022，34（2）：1000-1013

［57］XING B S，HAN Y，WANG X C， et al. Persistent action of cow rumen microorganisms in enhancing biodegradation of wheat straw by rumen fermentation［J］. Science of the Total Environment，2020（715）：136529

［58］高明，陸相龍，毛宏祥，等. 梯牧草和燕麥草的營養(yǎng)價值及其奶牛瘤胃降解特性［J］. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2022，48（3）：335-341

［59］許慶方，玉柱，李勝利，等. 甲酸或綠汁發(fā)酵液對苜蓿青貯影響的研究［J］. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（12）：1709-1714

［60］馬健，劉艷芳，杜云，等. 禾王草與奶牛常用粗飼料瘤胃降解特性的對比研究［J］. 動物營養(yǎng)學(xué)報，2016，28（3）：816-825

（責(zé)任編輯 劉婷婷）