摘要：葡萄風(fēng)信子（Muscari spp.）為百合科葡萄風(fēng)信子屬植物的總稱，該屬植物多具有稀少的正藍(lán)色花色，是研究單子葉植物花青苷合成機(jī)理的模式材料。為開(kāi)發(fā)一種高效的葡萄風(fēng)信子遺傳轉(zhuǎn)化體系，本試驗(yàn)以葡萄風(fēng)信子常見(jiàn)種亞美尼亞（M. armeniacum）、栽培品種‘黑眼睛’（M. aucheri ‘Dark Eyes’）為材料，用葉片和花蕾分別誘導(dǎo)獲得愈傷組織，對(duì)愈傷組織的潮霉素敏感性進(jìn)行測(cè)試，對(duì)根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行優(yōu)化。試驗(yàn)結(jié)果表明：葡萄風(fēng)信子亞美尼亞和‘黑眼睛’愈傷組織的潮霉素臨界濃度分別為150 mg·L- 1和120 mg·L- 1。GUS染色結(jié)果顯示不同基因型、不同農(nóng)桿菌菌株及不同功率超聲處理的愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率差異不顯著。而液體培養(yǎng)的花源愈傷組織能獲得更高的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率，為葡萄風(fēng)信子遺傳轉(zhuǎn)化的最優(yōu)受體。其最高瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率為98.73%。試驗(yàn)共獲得了209塊抗性愈傷組織，經(jīng)PCR和RT-PCR檢測(cè)，陽(yáng)性率可達(dá)90%。本研究為在葡萄風(fēng)信子中快速有效的開(kāi)展基因功能研究奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：葡萄風(fēng)信子；愈傷組織；根癌農(nóng)桿菌；遺傳轉(zhuǎn)化

中圖分類號(hào)：S682.2+9文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）03-1234-08

Optimization of Agrobacterium Tumefaciens-Mediated Genetic Transformation

System based on Callus of Grape Hyacinth

TIAN Shu-ting， CAO Xiao-yun， SHI Chun-ying， DU Ling-juan

（College of Landscape Architecture and Art， Northwest Aamp;F University， Yangling， Shaanxi Province 712100， China）

Abstract：Grape hyacinth （Muscari spp.） included all species in the Muscari genus of Liliaceae，and is a model plant for the mechanism study on anthocyanin synthesis in monocots due to its rare blue color. In this study，the hygromycin sensitivity of callus induced from a common species M. armeniacum and the cultivar of M. aucheri ‘Dark Eyes’ were tested，and an optimized genetic transformation system based on callus and Agrobacterium tumefaciens was developed. The results showed that the critical concentrations of hygromycin were 150 mg·L-1 and 120 mg·L-1for leaf-and-flower-derived calli of M. armeniacum and M. aucheri ‘Dark Eyes’，respectively. There were no significant differences of transformation efficiencies among different genotypes，among different Agrobacterium strains and among different ultrasonic power，based on GUS staining. The highest transient genetic transformation efficiency of 98.73% was received for flower-derived calli cultured in liquid culture method. A total of 209 pieces of resistant calli were obtained，and the transformation success rate was 90% based on examinaitons of PCR and RT-PCR. The present study provides an efficient technical support for the functional researches of genes in grape hyacinth.

Key words：Grape hyacinth;Callus;Agrobacterium tumefaciens;Genetic transformation

葡萄風(fēng)信子（Muscari spp.），又名藍(lán)壺花，引自歐洲，是百合科葡萄風(fēng)信子屬植物的總稱，多年生球根花卉，因其花型奇特似葡萄而得名。葡萄風(fēng)信子適應(yīng)性強(qiáng)，花期較早，花色艷麗，且多呈現(xiàn)自然中稀少的正藍(lán)色，具有較高的觀賞和科研價(jià)值，是研究單子葉植物花青苷生物合成和花色形成機(jī)理的模式材料［1］。早期葡萄風(fēng)信子的研究主要集中在物候觀測(cè)、花期調(diào)控、倍性鑒定、組培再生、離體開(kāi)花、花色形成及相關(guān)成分測(cè)定等方面［2-6］。近年來(lái)，隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多與葡萄風(fēng)信子花青苷合成相關(guān)的基因被分離出來(lái)［7-9］，基因功能的解析已成為當(dāng)前研究的主要目標(biāo)。然而，葡萄風(fēng)信子缺乏高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系，這限制了其基因功能的深入研究。

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化作為基因工程最常用的方法之一，廣泛應(yīng)用于植物的各個(gè)研究領(lǐng)域當(dāng)中［10］。并在禾本科、百合科、蘭科等單子葉植物中，展現(xiàn)出極大的應(yīng)用潛力［11-13］。葡萄風(fēng)信子農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化也有了少量的研究，影響轉(zhuǎn)化效率的因素如篩選及抑菌抗生素的適宜濃度、菌株載體組合、乙酰丁香酮（Acetosyringone，AS）濃度等均已得到了初步的篩選。Suzuki等［14］通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉源胚性愈傷的轉(zhuǎn)化方法，首次得到了葡萄風(fēng)信子‘藍(lán)珍珠’（M. armeniacum ‘Blue Pearl’）轉(zhuǎn)基因植株的生產(chǎn)系統(tǒng)；試驗(yàn)顯示，EHA101/pIG121Hm的菌株/載體組合、100 μmol·L^-1 AS和0.1％Tween20存在時(shí)能獲得更高的轉(zhuǎn)化效率。許勝［15］在建立葡萄風(fēng)信子‘白葡萄’（M. botryoides ‘Album’）葉源愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系時(shí)發(fā)現(xiàn)，預(yù)培養(yǎng)3 d、侵染5 min、菌液濃度為0.7、共培養(yǎng)3 d的愈傷組織抗性芽分化數(shù)最高。經(jīng)PCR檢測(cè)，抗性芽的轉(zhuǎn)化率為1.56％。張海芹等［16］以葡萄風(fēng)信子亞美尼亞的葉源愈傷組織為受體，初步建立了葡萄風(fēng)信子亞美尼亞的遺傳轉(zhuǎn)化體系；結(jié)果表明，當(dāng)農(nóng)桿菌菌液OD600為0.5、侵染20 min、共培養(yǎng)4 d、80 W功率超聲波預(yù)處理3 min時(shí)，其GUS的瞬時(shí)表達(dá)效率最高，為75.36%；經(jīng)PCR和RT-PCR檢測(cè)，得到抗性植株的陽(yáng)性率為3%。盡管如此，由于存在轉(zhuǎn)化效率低、穩(wěn)定性差等因素，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法在葡萄風(fēng)信子基因工程研究中尚未得到高效利用。因此，對(duì)已有研究結(jié)果進(jìn)行整合優(yōu)化，建立一套高效可用的葡萄風(fēng)信子愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系以用于基因功能的解析，具有重要的實(shí)踐意義。

草地學(xué)報(bào)第31卷第4期田淑婷等：農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葡萄風(fēng)信子愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系的優(yōu)化本研究在綜合前人研究結(jié)果及潮霉素敏感性試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，比較不同基因型、農(nóng)桿菌菌株、愈傷來(lái)源、培養(yǎng)方式及不同超聲處理功率對(duì)GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響，旨在優(yōu)化葡萄風(fēng)信子愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系，為在葡萄風(fēng)信子中快速有效地開(kāi)展基因功能的深入研究提供技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1植物材料供試材料葡萄風(fēng)信子亞美尼亞（M. armeniacum）、‘黑眼睛’（M. aucheri ‘Dark Eyes’）栽種于西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院苗圃中，于4月盛花期采取葉片和花蕾，經(jīng)75%酒精30 s和10%次氯酸鈉10 min消毒后切成1 cm左右的小段，接種于愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)。愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基配方為4.43 g·L^-1MS+30 g·L^-1蔗糖+3 g·L^-1植物凝膠+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.1 mg·L^-16-BA，pH = 5.8～6.0。每隔15 d更換一次培養(yǎng)基，45 d后將誘導(dǎo)的愈傷組織分別置于固體或液體的相同培養(yǎng)基中繼代保存。

1.1.2菌株與載體菌株為根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105和GV3101，感受態(tài)購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。載體pCAMBIA1304由本實(shí)驗(yàn)室保存，其T-DNA區(qū)段上攜帶GUS（β-gulcuronidase）報(bào)告基因和潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因（Hyg）作為選擇標(biāo)記基因。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1葡萄風(fēng)信子愈傷組織潮霉素敏感性試驗(yàn)選取1 g生長(zhǎng)狀態(tài)一致的亞美尼亞和‘黑眼睛’的葉源（黃色顆粒狀）和花源（淡黃松散狀）愈傷組織，分別轉(zhuǎn)入含不同潮霉素（Hygromycin，Hyg）濃度的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上（0，90，120，150，180 mg·L^-1），于24℃黑暗條件下培養(yǎng)，35 d后統(tǒng)計(jì)愈傷組織的鮮重變化和生長(zhǎng)狀況。每處理重復(fù)3次。

1.2.2根癌農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備pCAMBIA1304載體經(jīng)凍融法分別轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105和GV3101。取200 μL菌液，置于5 mL含50 mg·L^-1 Kan，25 mg·L^-1 Rif的液體LB培養(yǎng)基中，28℃，180 r·min^-1搖床上振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。后于離心機(jī)中5 000 r·min^-1離心10 min，棄上清，用制備好的重懸液將菌體重懸，調(diào)OD600至0.5。28℃，180 r·min^-1避光振蕩培養(yǎng)1～2 h。

重懸液配方：4.43 g·L^-1MS+30 g·L^-1蔗糖+10 mol·L^-1 MES+100 μmol·L^-1 AS+0.1% Tween20，pH為5.8～6.0。

1.2.3不同基因型和農(nóng)桿菌菌株對(duì)GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響將經(jīng)固體培養(yǎng)的亞美尼亞和‘黑眼睛’的花源愈傷組織分別加入含50 mL無(wú)菌水的三角瓶中，置于超聲波清洗儀中，80%（500 W），3 min。后分別加入制備好的重懸菌液，震蕩侵染20 min，無(wú)菌濾紙吸干表面菌液，接種于預(yù)先配置好的共培養(yǎng)基上。于24℃黑暗條件下共培養(yǎng)4 d。每處理重復(fù)3次。

共培養(yǎng)基配方：4.43 g·L^-1MS+30 g·L^-1蔗糖+3 g·L^-1植物凝膠+1.0 mg·L^-12，4-D+0.1 mg·L^-16-BA+10 mmol·L^-1 MES+100 μmmol·L^-1 AS+0.1% Tween20，pH為5.8～6.0。

1.2.4不同愈傷來(lái)源和培養(yǎng)方式對(duì)GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響將經(jīng)固體培養(yǎng)和液體培養(yǎng)后的亞美尼亞葉源愈傷組織和花源愈傷組織分別加入含50 mL無(wú)菌水的三角瓶中，置于超聲波清洗儀中，80%（500 W），3 min。后加入制備好的重懸菌液pCAMBIA1304-GV3101，侵染及共培養(yǎng)方式同上。每處理重復(fù)3次。

1.2.5不同超聲處理功率對(duì)GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響將經(jīng)液體培養(yǎng)的亞美尼亞花源愈傷組織加入含50 mL無(wú)菌水的三角瓶中，置于超聲波清洗儀中，分別于不同功率60%～100%（500 W）下超聲處理3 min。后加入制備好的重懸菌液pCAMBIA1304-GV3101，侵染及共培養(yǎng)方式同上。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.2.6脫菌及篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將愈傷組織轉(zhuǎn)至含300 mg·L^-1Carb的抗生素水中震蕩10 min，后用無(wú)菌水震蕩清洗3～5次，濾紙吸干后接種至篩選培養(yǎng)基中，于24℃，3000 lux光下進(jìn)行篩選培養(yǎng)。每15～20 d繼代一次，至新的抗性愈傷長(zhǎng)出。

篩選培養(yǎng)基配方：4.43 g·L^-1MS+30 g·L^-1蔗糖+3 g·L^-1植物凝膠+1.0 mg·L^-1 2，4-D+0.1 mg·L^-1 6-BA+300 mg·L^-1Carb+150 mg·L^-1Hyg，pH=5.8～6.0。

1.2.7GUS瞬時(shí)表達(dá)的組織化學(xué)測(cè)定共培養(yǎng)結(jié)束后，從各處理中分別稱取1 g脫菌的愈傷組織于離心管中，并加入10 mL GUS染液使其完全浸沒(méi)，于37℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)24～36 h。培養(yǎng)結(jié)束后用75%的酒精進(jìn)行脫色，至陰性對(duì)照完全無(wú)色時(shí)記錄GUS的瞬時(shí)染色情況。每組處理各重復(fù)3次。GUS染液參照J(rèn)efferson等的方法配制。

根據(jù)染色程度，將愈傷組織劃分為4個(gè)等級(jí)：未染色（-）、染色較淺（+）、染色適中（++）、染色較深（+++）。體式顯微鏡下的著色情況如圖1所示。

1.2.8轉(zhuǎn)化愈傷組織的PCR和RT-PCR檢測(cè)采用CTAB法提取愈傷組織DNA。依據(jù)RNA提取試劑盒（美國(guó)Omega公司）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（艾科瑞生物科技有限公司）的使用說(shuō)明，提取愈傷組織的RNA，并反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。

以抗性愈傷組織的DNA或cDNA為模板，對(duì)GUS基因的插入及轉(zhuǎn)錄情況進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測(cè)，PCR引物如表1所示（擴(kuò)增片段大小為557 bp）。反應(yīng)體系及程序設(shè)置參照2×Taq Master mix使用說(shuō)明。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后于凝膠成像儀下觀察并拍照。

2結(jié)果與分析

2.1葡萄風(fēng)信子愈傷組織潮霉素敏感性試驗(yàn)

由圖2可知，亞美尼亞葉源（圖2A）和花源（圖2B）愈傷組織對(duì)潮霉素的敏感性均較弱。潮霉素濃度為90～150 mg·L^-1時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)速度出現(xiàn)了不同程度的減緩。當(dāng)潮霉素濃度高于150 mg·L^-1時(shí)，亞美尼亞葉源和花源愈傷組織均停止生長(zhǎng)并出現(xiàn)輕微的褐化現(xiàn)象，35 d后測(cè)得的愈傷組織鮮重低于初始值1 g。因此，潮霉素濃度150 mg·L^-1可以作為亞美尼亞葉源和花源愈傷組織篩選的臨界濃度。

圖3可知，‘黑眼睛’葉源（圖3A）和花源（圖3B）愈傷組織對(duì)潮霉素的敏感性稍強(qiáng)于亞美尼亞。潮霉素濃度為90～120 mg·L^-1時(shí)，愈傷組織生長(zhǎng)速度出現(xiàn)了顯著的減緩。當(dāng)潮霉素濃度高于120 mg·L^-1時(shí)，‘黑眼睛’葉源和花源愈傷組織均停止生長(zhǎng)并出現(xiàn)輕微的褐化現(xiàn)象，35 d后測(cè)得的愈傷組織鮮重低于初始值1 g。因此，潮霉素濃度120 mg·L^-1可以作為‘黑眼睛’葉源和花源愈傷組織篩選的臨界濃度。

2.2葡萄風(fēng)信子愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化

葡萄風(fēng)信子愈傷組織轉(zhuǎn)化的過(guò)程如圖4所示。選取生長(zhǎng)健壯植株的葉或花誘導(dǎo)獲得愈傷組織（圖4A-C），于無(wú)菌水中進(jìn)行超聲預(yù)處理后加入制備好的重懸菌液震蕩侵染（圖4D），并于共培養(yǎng)基上避光培養(yǎng)（圖4E）。4 d后脫菌并取部分愈傷組織進(jìn)行GUS染色（圖4F），其余轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行轉(zhuǎn)化愈傷組織的篩選（圖4G）。1個(gè)月左右愈傷組織開(kāi)始褐化，約2個(gè)月后待新的抗性愈傷組織產(chǎn)生后（圖4H），將其轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)（圖4I）。

2.2.1不同基因型和農(nóng)桿菌菌株對(duì)GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響表2可知，亞美尼亞和‘黑眼睛’的花源愈傷組織在2種農(nóng)桿菌菌株GV3101和EHA105侵染時(shí)均能獲得較高的GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率，且各處理間未表現(xiàn)出顯著差異。其瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率分別為（85.59±7.09）%，（85.01±7.85）%及（81.94±6.03）%，（84.64±3.09）%。而其中，亞美尼亞的愈傷組織在2種農(nóng)桿菌侵染時(shí)著色更深，分別有（33.74±6.40）%和（44.93±3.17）%表現(xiàn)為中等著色，（13.89±4.94）%和（13.51±3.63）%表現(xiàn)為強(qiáng)的著色；而‘黑眼睛’僅有（14.54±1.96）%和（19.73±2.56）%表現(xiàn)中等著色，（13.66±3.51）%和（14.49±4.41）%表現(xiàn)強(qiáng)的著色。因此，確定葡萄風(fēng)信子遺傳轉(zhuǎn)化的最適基因型為亞美尼亞，但二者整體差異不顯著。而GV3101和EHA105均可作為葡萄風(fēng)信子遺傳轉(zhuǎn)化的適宜菌株。

2.2.2不同愈傷來(lái)源和培養(yǎng)方式對(duì)GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響表3可知，經(jīng)固體和液體培養(yǎng)的亞美尼亞葉源和花源愈傷組織的GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率有較大差異，表現(xiàn)為液體培養(yǎng)的花源愈傷gt;固體培養(yǎng)的花源愈傷gt;液體培養(yǎng)的葉源愈傷組織gt;固體培養(yǎng)的葉源愈傷組織。經(jīng)液體培養(yǎng)的花源愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，可達(dá)（98.73±0.67）%。同時(shí)，液體培養(yǎng)的花源愈傷組織著色最深，分別有（68.12±4.65）%和（15.52±2.26）%表現(xiàn)為中等或強(qiáng)的著色。經(jīng)固體培養(yǎng)的葉源愈傷組織瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率最低，為（73.72±6.87）%，且其愈傷組織著色最淺，僅有（13.62±4.86）%和（2.74±0.02）%的愈傷組織表現(xiàn)為中等或強(qiáng)的著色。而經(jīng)液體培養(yǎng)的葉源愈傷組織和經(jīng)固體培養(yǎng)的花源愈傷組織在本次試驗(yàn)中的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率未表現(xiàn)出顯著差異，分別為（86.08±4.50）%和（90.00±4.00）%。其中，固體培養(yǎng)的花源愈傷組織表現(xiàn)出更深的著色，有（35.62±3.47）%和（10.85±4.51）%表現(xiàn)為中等或強(qiáng)的著色，而液體培養(yǎng)的葉源愈傷組織僅為（14.19±7.25）%和（3.22±4.55）%。因此，經(jīng)液體培養(yǎng)的花源愈傷組織可作為葡萄風(fēng)信子遺傳轉(zhuǎn)化最優(yōu)的愈傷來(lái)源和培養(yǎng)方式。

2.2.3不同超聲處理功率對(duì)GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的影響表4可知，不同超聲功率處理下的亞美尼亞花源愈傷組織的GUS瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率均較高，且各處理之間未表現(xiàn)出顯著差異。其最高瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率達(dá)（97.95±2.78）%。因此，無(wú)須超聲處理即可作為葡萄風(fēng)信子遺傳轉(zhuǎn)化的適宜方式。

2.3轉(zhuǎn)化愈傷組織的PCR和RT-PCR檢測(cè)

試驗(yàn)最終獲得209塊抗性愈傷組織，隨機(jī)抽選30塊進(jìn)行轉(zhuǎn)化愈傷組織的分子檢測(cè)。結(jié)果顯示，有27塊擴(kuò)增出了557 bp的目的片段，陽(yáng)性率可達(dá)90%。而未轉(zhuǎn)化的愈傷組織中沒(méi)有檢測(cè)到目的片段的存在。該試驗(yàn)結(jié)果初步表明，目的片段已成功整合到葡萄風(fēng)信子愈傷組織的基因組DNA中，并成功實(shí)現(xiàn)了目的片段的轉(zhuǎn)錄。部分抗性愈傷的PCR和RT-PCR擴(kuò)增情況如圖5，圖6所示。

3討論

高效的遺傳轉(zhuǎn)化體系在植物基因功能研究和新品種選育等方面有著至關(guān)重要的作用。其中農(nóng)桿菌的侵染、植物的應(yīng)答以及轉(zhuǎn)化細(xì)胞的再生等因素均會(huì)對(duì)其轉(zhuǎn)化效率產(chǎn)生影響［17］。以往葡萄風(fēng)信子的研究多集中在轉(zhuǎn)化過(guò)程中，對(duì)轉(zhuǎn)化受體的優(yōu)化研究較少，且各研究間較為獨(dú)立，相關(guān)結(jié)論尚未得到整合利用。因此，本試驗(yàn)綜合利用前人研究結(jié)果，并在此基礎(chǔ)上完成進(jìn)一步的優(yōu)化。

為了成功實(shí)現(xiàn)植物遺傳轉(zhuǎn)化，需要建立一套高效穩(wěn)定的受體體系。不同篩選標(biāo)記及其臨界濃度的選擇對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化的效率和植株再生有著重要的影響。過(guò)高濃度的篩選抗生素導(dǎo)致植物細(xì)胞的損傷，濃度過(guò)低則無(wú)法有效的篩選轉(zhuǎn)化細(xì)胞［18-19］。Suzuki等［20］研究了幾種篩選及抑菌抗生素對(duì)葡萄風(fēng)信子‘藍(lán)珍珠’胚性愈傷組織生長(zhǎng)和體胚發(fā)生的影響。得到愈傷組織潮霉素篩選的臨界濃度為75 mg·L^-1，而卡那霉素對(duì)愈傷和體胚的抑制作用較??；張海芹［21］在研究對(duì)葡萄風(fēng)信子亞美尼亞愈傷組織的抗生素臨界濃度進(jìn)行篩選時(shí)發(fā)現(xiàn)，愈傷組織的潮霉素致死濃度為210 mg·L^-1。本試驗(yàn)確定了亞美尼亞葉源和花源愈傷組織潮霉素的適宜濃度為150 mg·L^-1。與張海芹［21］的結(jié)果存在一定差異，可能與處理時(shí)愈傷組織的生長(zhǎng)狀態(tài)及接種方式有關(guān)。植物遺傳轉(zhuǎn)化效率取決于植株對(duì)農(nóng)桿菌侵染的敏感性，不同基因型對(duì)不同農(nóng)桿菌菌株的敏感程度存在不同［22］。在本試驗(yàn)中，2種不同菌株GV3101和EHA105對(duì)亞美尼亞和‘黑眼睛’愈傷組織的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率影響并不顯著，其遺傳轉(zhuǎn)化均較為容易，表明該體系對(duì)葡萄風(fēng)信子具有廣泛的適用性。此外，轉(zhuǎn)化受體的生長(zhǎng)狀態(tài)對(duì)轉(zhuǎn)化效率也有重要的影響。研究表明，活躍松散的愈傷組織通常能獲得更高的遺傳轉(zhuǎn)化率［22-23］。Suzuki等［14］比較了幾種受體類型對(duì)葡萄風(fēng)信子‘藍(lán)珍珠’轉(zhuǎn)化效率的影響，表明以胚性培養(yǎng)物為轉(zhuǎn)化受體優(yōu)于葉、根、鱗莖和花梗的可能原因是胚性培養(yǎng)物具有較高的細(xì)胞分裂活性而有利于接受外源基因的轉(zhuǎn)化。Cohen等［24］發(fā)現(xiàn)經(jīng)液體培養(yǎng)得到的麝香百合（Lilium longiflorum）和圣星百合（Ornithogalum dubium）的松散愈傷組織的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率是固體培養(yǎng)的50～70倍。本研究也呈現(xiàn)出相似的結(jié)果。在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同愈傷來(lái)源和培養(yǎng)方式下的愈傷組織在生長(zhǎng)狀態(tài)和增殖速度等方面表現(xiàn)出顯著的差異。液體培養(yǎng)的花源愈傷組織較為疏松活躍的狀態(tài)更有利于瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率的提高，這可能是其較高的分生能力有利于農(nóng)桿菌的侵染。此外，初代培養(yǎng)的花源愈傷組織在轉(zhuǎn)化時(shí)具有更高的GUS染色率，呈現(xiàn)較深的著色。繼代半年后，葉源和花源愈傷組織間的差異隨愈傷組織生長(zhǎng)狀態(tài)的接近而逐漸縮小，且愈傷組織的侵染效率也隨著生長(zhǎng)的減緩而逐漸降低（數(shù)據(jù)未顯示）。負(fù)壓和超聲處理是遺傳轉(zhuǎn)化中兩種常用的造傷處理方法，適宜程度的機(jī)械損傷有利于促進(jìn)農(nóng)桿菌的侵入，從而提高植株的轉(zhuǎn)化效率［25-26］。本試驗(yàn)中，超聲處理對(duì)愈傷組織的轉(zhuǎn)化效率影響較小，經(jīng)液體培養(yǎng)的花源愈傷組織無(wú)需超聲處理即可獲得較高的瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率。優(yōu)化后遺傳轉(zhuǎn)化體系將瞬時(shí)遺傳轉(zhuǎn)化效率提高至（98.73±0.67）%，同時(shí)獲得的抗性愈傷組織的陽(yáng)性率也得到了顯著的提升，高達(dá)90%。

傳統(tǒng)的遺傳轉(zhuǎn)化往往依賴于高效的植株再生體系，實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作難度大［27］。近年來(lái)，人們利用轉(zhuǎn)化愈傷組織的表型變化直接進(jìn)行色素、抗性等相關(guān)基因功能的鑒定，獲得了較好的成效［28-32］。因此，如何利用優(yōu)化后的體系更為高效地開(kāi)展葡萄風(fēng)信子基因功能的鑒定，尚需進(jìn)行進(jìn)一步的探索。

4結(jié)論

本研究建立了一種高效的根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葡萄風(fēng)信子愈傷組織遺傳轉(zhuǎn)化體系。利用該體系獲得的最高瞬時(shí)轉(zhuǎn)化效率為98.73%，并成功獲得了轉(zhuǎn)基因愈傷組織。優(yōu)化后的體系為在葡萄風(fēng)信子中高效進(jìn)行基因功能的研究提供技術(shù)支持，為葡萄風(fēng)信子的分子改良育種提供參考。

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（責(zé)任編輯 彭露茜）