摘要：本研究探討了外源H₂O₂引發(fā)后，燕麥（Avena sativa）種胚細胞和線粒體抗壞血酸（Ascorbic acid，AsA）-谷胱甘肽（Glutathione，GSH）循環(huán)的抗氧化性能的變化規(guī)律，以期為植物種子的長期貯藏技術研究提供理論依據(jù)。試驗以燕麥種子為材料，用濃度為0，0.96，1.92，3.84和7.68 mol·L^-1的H₂O₂引發(fā)12 h后，分析其種胚細胞和線粒體脂質(zhì)過氧化水平、AsA-GSH循環(huán)中酶促和非酶促抗氧化物質(zhì)的變化規(guī)律。結(jié)果表明：燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)AsA和GSH含量會隨外源H₂O₂濃度的增加而顯著降低（Plt;0.05），其AsA-GSH循環(huán)的酶活性、脫氫抗壞血酸和氧化型谷胱甘肽含量均呈先升后降的趨勢，其H₂O₂和丙二醛含量顯著升高（Plt;0.05），燕麥種子發(fā)芽率則顯著降低（Plt;0.05）。燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環(huán)的抗氧化功能變化對H₂O₂濃度升高的響應具有協(xié)同性，其抗氧化能力下降導致高濃度（≥1.92 mol·L^-1）外源H₂O₂引發(fā)下燕麥種子發(fā)芽率降低，而其AsA含量及再生能力的降低是造成這一現(xiàn)象的主要原因。

關鍵詞：抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)；線粒體；過氧化氫；燕麥；種子引發(fā)

中圖分類號：S512.6文獻標識碼：A文章編號：1007-0435（2023）04-1064-07

Response of AsA-GSH Cycles to Exogenous H₂O₂ Priming in the Embryonic

Cells and Mitochondria of Oat Seeds

LI Hong-yu， WANG Ya-cong， XIA Fang-shan WANG Bo， LI Yin-lin， ZHANG Jie-min

（College of Grassland Science， Shanxi Agricultural University， Taigu， Shanxi Province 030801， China）

Abstract：In this study，the changes in the antioxidant properties of ascorbic acid （AsA）-glutathione （GSH） cycles were explored as a response to exogenous H₂O₂ priming in the embryonic cells and mitochondria of oat （Avena sativa） seeds，which provided a theoretical basis for the long-term storage of plant seeds. Oat seeds were primed with 0，0.96，1.92，3.84 and 7.68 mol·L^-1 H₂O₂ for 12 h as the experimental materials，and the changes in lipid peroxidation and enzymatic and non-enzymatic antioxidants in AsA-GSH cycles were analyzed in both their embryonic cells and mitochondria. The results showed that the AsA and GSH contents were significantly decreased in the embryonic cells and mitochondria （Plt;0.05），and enzymatic activities of AsA-GSH cycles and contents of dehydroascorbate and oxidized glutathione were all with a pattern of increasing firstly and then decreasing. H₂O₂ and malondialdehyde contents were also significantly increased （Plt;0.05），and thus the germination percentage of oat seeds was reduced significantly （Plt;0.05）. Embryonic cells and mitochondria showed similar results of changes of AsA-GSH cycles in response to the increase of H₂O₂ concentration，and the damage on their antioxidant capacity resulted in the decrease of seed germination under priming with high concentration （≥1.92 mol·L^-1） of exogenous H₂O₂. It might be caused largely by the decrease of AsA content and its continuous production.

Key words：Ascorbic acid-glutathione cycles;Mitochondria;Hydrogen peroxide;Oat;Seed priming

種業(yè)是決定國家穩(wěn)定發(fā)展的基礎性和戰(zhàn)略性核心產(chǎn)業(yè)，已成為推動我國農(nóng)牧業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要引擎［1］。種子活力水平是直接決定著民族種業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的關鍵因素，其在儲藏中會因為活性氧（Reactive oxygen species，ROS）的不斷積累而逐步降低［2］。H₂O₂的產(chǎn)生與清除是植物維持細胞內(nèi)ROS動態(tài)平衡的關鍵環(huán)節(jié)，其過量積累成為引起貯藏種子活力不斷下降的關鍵原因［3-4］。線粒體是種胚細胞內(nèi)最主要的細胞器，其既是種胚細胞內(nèi)ROS產(chǎn)生的最主要來源，又是種胚細胞內(nèi)ROS攻擊的首要目標，因而是對種子劣變最敏感的細胞器［5］?？箟难幔ˋscorbic acid，AsA）-谷胱甘肽（Glutathione，GSH）循環(huán)是種子內(nèi)維持其壽命的諸多系統(tǒng)中最為活躍的核心環(huán)節(jié)，因而是種胚細胞和線粒體內(nèi)維持ROS穩(wěn)態(tài)的重要渠道［6-7］。研究發(fā)現(xiàn)，輕度老化會誘導植物種胚細胞和線粒體內(nèi)AsA-GSH循環(huán)中抗壞血酸過氧化物酶（Ascorbate peroxidase，APX），谷胱甘肽還原酶（Glutathione reductase，GR），超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD），脫氫抗壞血酸還原酶（Dehydroascorbate reductase，DHAR）和單脫氫抗壞血酸還原酶（Monodehydroasorbate reductase，MDHAR）活性升高，其H₂O₂和丙二醛（Malondialdehyde，MDA）含量維持一個相對較低的水平，因而其種子活力也基本未降低，但重度老化時則出現(xiàn)完全相反的現(xiàn)象［8-11］。外源H₂O₂引發(fā)下燕麥種胚細胞和線粒體中也發(fā)現(xiàn)了相似的變化規(guī)律［12-13］。老化燕麥種子的種胚細胞與線粒體在引發(fā)過程中會協(xié)同發(fā)揮作用，且線粒體是其發(fā)揮清除ROS作用的最主要部位［14］。然而，植物種胚細胞及線粒體AsA-GSH循環(huán)如何協(xié)同響應外源H₂O₂引發(fā)處理尚未見報道，其是否與老化種子的引發(fā)處理具有相同的規(guī)律也仍然不清楚。所以本試驗旨在探討燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環(huán)對不同濃度外源H₂O₂引發(fā)的響應，以驗證內(nèi)源H₂O₂含量變化與種子活力水平的內(nèi)在關系，從而為精確揭示種子老化的內(nèi)在抗氧化機制提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1H₂O₂引發(fā)處理

將均勻飽滿的‘太陽神’燕麥種子（具體來源及詳細信息見文獻［12-13］）分為約10 g每份，并參照文獻［15］的方法將其含水量調(diào)整至鮮重基礎約10%，然后用200 mL濃度分別為0，0.96，1.92，3.84和7.68 mol·L^-1的H₂O₂在室溫黑暗條件下浸泡12 h后，快速用蒸餾水沖洗3次，用濾紙吸掉其表層水分后，于室溫黑暗環(huán)境中風干至含水量10%（鮮重基礎）左右時進行密封，并于4℃下保存?zhèn)溆?。以未引發(fā)處理的燕麥種子作為對照（CK）。每個處理重復4次。

1.2發(fā)芽試驗

按照國際種子檢驗協(xié)會發(fā)布的種子檢驗規(guī)程（2017）［16］規(guī)定的條件進行，具體操作方法參照文獻［17］進行，并按照公式Gp=（G₁₀/N）×100%來計算其發(fā)芽率，式中Gp代表種子發(fā)芽率，G₁₀代表末次計數(shù)第10天時的正常發(fā)芽種子數(shù)，N代表供試發(fā)芽種子的總數(shù)［16］。

1.3生理指標的測定

提取種胚細胞粗酶液參考Kibinza等［18］的方法，具體操作參照文獻［12］進行；提取與純化種胚線粒體則參照Yin等［19］的方法，具體操作參照文獻［13］進行。測定可溶性蛋白和H₂O₂含量采用了建成生物工程研究所的試劑盒，測定MDA含量參考Bailly等［20］的方法，測定SOD活性參考Rao等［21］的方法，測定APX和DHAR活性參考Nakano等［22］的方法，測定MDHAR活性參考Arrigoni等［23］的方法，測定GR活性參考Esterbauer等［24］的方法，測定AsA和脫氫抗壞血酸（Dehydroascorbic acid，DHA）含量參照Kampfenkel等［25］的方法，測定GSH和氧化型谷胱甘肽（Oxidized glutathione，GSSG）含量參照Griffith［26］的方法。

1.4數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 21.0和Excel 2010統(tǒng)計軟件整理試驗數(shù)據(jù)，并進行方差分析，多重比較則用Duncans法（P＜0.05），以“平均值±標準誤”表示最后結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1燕麥種子發(fā)芽率的變化

由圖1可知，燕麥種子的發(fā)芽率在H₂O₂濃度為0 mol·L^-1時與CK無顯著性差異，但在H₂O₂濃度≥0.96 mol·L^-1時顯著低于CK（Plt;0.05），且在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時為0。

2.2燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)H2O2和MDA含量變化

燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)MDA和H₂O₂含量隨H₂O₂濃度的增大呈不斷上升趨勢（圖2）。0 mol·L^-1 H₂O₂引發(fā)時，燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)MDA，H₂O₂含量均與CK無顯著性差異，但0.96～7.68 mol·L^-1 H₂O₂引發(fā)時，燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)MDA和H₂O₂含量呈顯著升高趨勢（Plt;0.05），且均顯著高于CK（Plt;0.05）。H₂O₂濃度為0～1.92 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內(nèi)H₂O₂含量低于線粒體內(nèi)，但H₂O₂濃度為3.84 mol·L^-1和7.68 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內(nèi)H₂O₂含量則高于線粒體內(nèi)；H₂O₂濃度為0和0.96 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內(nèi)MDA含量低于線粒體內(nèi)，但H₂O₂濃度為1.92～7.68 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內(nèi)MDA含量則高于線粒體內(nèi)。

2.3燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)抗氧化酶活性變化

燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)SOD，APX，GR，MDHAR和DHAR活性隨H₂O₂濃度的增大呈先升后降趨勢（圖3）。H₂O₂濃度為0 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)SOD，APX，GR，MDHAR和DHAR活性都與CK無顯著性差異。種胚細胞SOD和GR活性在H₂O₂濃度為1.92 mol·L^-1時顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），但其種胚線粒體SOD和GR活性在0.96 mol·L^-1 H₂O₂引發(fā)時顯著高于其他濃度時（Plt;0.05）；種胚細胞及線粒體SOD活性在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時仍均顯著高于CK（Plt;0.05），種胚細胞GR活性在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時也仍顯著高于CK（Plt;0.05），但其種胚線粒體GR活性在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時則顯著低于CK（Plt;0.05）。種胚細胞APX活性在H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），其種胚線粒體APX活性在1.92 mol·L^-1 H₂O₂引發(fā)時顯著高于其他濃度時（Plt;0.05）；種胚細胞APX活性在H₂O₂濃度為3.84 mol·L^-1時已顯著低于CK（Plt;0.05），但其種胚線粒體APX活性在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時才顯著低于CK（Plt;0.05）。種胚細胞和線粒體MDHAR和DHAR活性在0.96 mol·L^-1 H₂O₂引發(fā)時均顯著高于其他濃度時（Plt;0.05）；種胚細胞MDHAR和DHAR活性在H₂O₂濃度為3.84 mol·L^-1時均已顯著低于CK（Plt;0.05），其種胚線粒體MDHAR活性則在H₂O₂濃度為1.92 mol·L^-1時就已顯著低于CK（Plt;0.05），而種胚線粒體DHAR活性則在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時才顯著低于CK（Plt;0.05）。

2.4燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)AsA含量變化

隨著H₂O₂引發(fā)濃度的增加，燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)AsA含量均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，而兩者DHA含量則均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（圖4）。H₂O₂濃度為0 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內(nèi)AsA含量顯著高于CK（Plt;0.05），但其種胚線粒體內(nèi)AsA含量則與CK無顯著性差異，燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)DHA含量均與CK無顯著性差異。燕麥種胚細胞和線粒體AsA含量均在H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時就顯著低于CK（Plt;0.05），在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時顯著低于其他濃度（Plt;0.05）；燕麥種胚細胞DHA含量在H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時快速上升，并顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），而其種胚線粒體DHA含量在1.92 mol·L^-1 H₂O₂引發(fā)時仍顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），且其種胚細胞和線粒體DHA含量均在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時仍顯著高于CK（Plt;0.05）。

2.5燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)GSH含量變化

隨著H₂O₂引發(fā)濃度的增加，燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)GSH含量均呈現(xiàn)逐漸下降趨勢，而其種胚細胞和線粒體內(nèi)GSSG含量則均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（圖5）。H₂O₂濃度為0 mol·L^-1時，燕麥種胚細胞內(nèi)GSH和GSSG含量均與CK無顯著差異。燕麥種胚細胞和線粒體GSH含量均在H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時已顯著低于CK（Plt;0.05），在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時顯著低于其他濃度（Plt;0.05）；燕麥種胚細胞和線粒體GSSG含量在H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時均顯著高于其他濃度時（Plt;0.05），而在7.68 mol·L^-1 H₂O₂引發(fā)時均顯著低于其他濃度時（Plt;0.05）；但燕麥種胚細胞GSSG含量在H₂O₂濃度為3.84 mol·L^-1時已顯著低于CK（Plt;0.05），而其種胚線粒體GSSG含量則在H₂O₂濃度為7.68 mol·L^-1時才顯著低于CK（Plt;0.05）。

3討論

H₂O₂在植物體內(nèi)所發(fā)揮的生理生化作用具有明顯的濃度效應，低濃度時是植物細胞內(nèi)抵御各種非生物脅迫的小分子信號物質(zhì)，但高濃度時則會引起植物細胞的程序性死亡［27-28］。因此，外源H2O2引發(fā)處理對種子萌發(fā)的影響與其濃度具有密切關系［17］。本試驗發(fā)現(xiàn)，低濃度（0.96 mol·L^-1）H₂O₂引發(fā)處理時，燕麥種子發(fā)芽率與濃度為0 mol·L^-1及CK間無顯著性差異，說明低濃度的H₂O₂引發(fā)能使高活力（發(fā)芽率可達100%）燕麥種子的發(fā)芽率保持較高水平，這與前人在水稻（Oryza sativa）［29］、臭椿（Ailanthus altissima）［30］及莖瘤芥（Brassica juncea）［31］等植物種子的研究中存在差異，主要是因為前人所有種子的發(fā)芽率幾乎都不高于80%，而低活力種子需要一定的H₂O₂誘導才能激活其萌發(fā)代謝及相關免疫反應［17］。高濃度（≥1.92 mol·L^-1）H₂O₂引發(fā)處理時，燕麥種子發(fā)芽率顯著降低（Plt;0.05），濃度為7.68 mol·L^-1時已基本喪失活力，這與在水稻［29］、臭椿［30］及莖瘤芥［31］等植物種子中的研究結(jié)論相似。這可能是高濃度H₂O₂處理使其在植物種子內(nèi)迅速積累而導致了細胞膜系統(tǒng)的損傷，從而造成種子內(nèi)電解質(zhì)和大量代謝物質(zhì)的外滲，最終表現(xiàn)為種子喪失活力［32］。

燕麥種子內(nèi)H₂O₂的過量積累會使其抗氧化酶活性大幅度降低，并導致其種胚細胞和線粒體發(fā)生脂質(zhì)過氧化損傷，表現(xiàn)為兩者MDA含量大量增加［9-10］。因此，高濃度H₂O₂引發(fā)處理引起的脂質(zhì)過氧化損傷可能是導致燕麥種子活力逐漸喪失的主要原因［17］。試驗中，燕麥種胚細胞和線粒體SOD，APX，GR，MDHAR和DHAR活性，以及兩者內(nèi)MDA，H₂O₂，AsA，GSH，DHA和GSSG含量變化均具有相同的規(guī)律，說明燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環(huán)對于外源H₂O₂引發(fā)的響應具有協(xié)同性，這與PEG引發(fā)下老化燕麥種子的響應一致［14］。低濃度（0.96 mol·L^-1）H₂O₂引發(fā)處理時，燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)H₂O₂含量已均顯著高于濃度為0 mol·L^-1及CK（Plt;0.05），這說明已經(jīng)造成了燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)H₂O₂積累，因而其MDA含量也顯著高于CK（Plt;0.05），表明發(fā)生了脂質(zhì)過氧化損傷。此時，燕麥種胚細胞和線粒體內(nèi)SOD，APX，GR，MDHAR和DHAR活性也均顯著高于濃度為0 mol·L^-1及CK（Plt;0.05），這說明此時燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環(huán)的關鍵酶仍具有較高的清除ROS的能力，因而其AsA和GSH含量會顯著低于濃度為0 mol·L^-1及CK（Plt;0.05），且其DHA和GSSG含量則均顯著高于濃度為0 mol·L^-1及CK（Plt;0.05），這說明AsA和GSH被作為AsA-GSH循環(huán)的底物而大量用于清除種胚細胞及線粒體內(nèi)ROS［33］。然而H₂O₂濃度為1.92 mol·L^-1時，盡管燕麥種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環(huán)的關鍵酶的活性仍保持較高水平，但其抗氧化能力已經(jīng)開始逐漸減弱，表現(xiàn)為其種胚細胞和線粒體MDHAR和DHAR活性顯著低于H₂O₂濃度為0.96 mol·L^-1時（Plt;0.05），其AsA和GSH含量也繼續(xù)顯著降低（Plt;0.05），因而其H₂O₂和MDA含量也繼續(xù)顯著增加（Plt;0.05），燕麥種子的發(fā)芽率也顯著降低（Plt;0.05）。種子內(nèi)AsA-GSH循環(huán)中MDHAR，DHAR及GSH的主要功能是使循環(huán)中AsA能夠再生［33］，因而高濃度H₂O₂造成AsA含量及其再生功能降低是導致燕麥種子活力喪失的主要原因，這是因為燕麥種子內(nèi)MDHAR和DHAR對于AsA的再生具有更重要的催化作用［15，34］。

4結(jié)論

燕麥種子發(fā)芽率在高濃度外源H₂O₂引發(fā)下降低是其種胚細胞和線粒體AsA-GSH循環(huán)的抗氧化功能降低造成的，二者對H₂O₂濃度升高的響應具有協(xié)同性，而種胚細胞和線粒體內(nèi)AsA含量及其再生功能降低是高濃度H₂O₂造成燕麥種子活力逐漸喪失的主要原因。

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（責任編輯 閔芝智）