摘要：青貯飼料在畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中占有非常重要的地位，但是青貯發(fā)酵過程中亞硝酸鹽積累會(huì)嚴(yán)重危害動(dòng)物生產(chǎn)性能及奶肉品質(zhì)。亞硝酸鹽中毒是家畜在臨床上常見的一種食源性的疾病，家畜輕度中毒會(huì)影響其生長發(fā)育，重度中毒甚至?xí)?dǎo)致家畜死亡。因此，為減少家畜因食用青貯引發(fā)亞硝酸鹽中毒的現(xiàn)象，同時(shí)提高青貯質(zhì)量安全，本文闡述了青貯亞硝酸鹽的危害、來源、轉(zhuǎn)化途徑、青貯過程中亞硝酸鹽降解途徑及調(diào)控措施，以期為青貯中亞硝酸鹽降解及調(diào)控提供有效參考。

關(guān)鍵詞：青貯；亞硝酸鹽；轉(zhuǎn)化途徑；降解途徑；調(diào)控措施

中圖分類號(hào)：S816.5+3文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：1007-0435（2023）04-0943-09

Research Progress on Nitrite Transformation Pathway and its Influencing

Factors in Silage

AN Jiang-bo LIU Ming-jian LIU Wei BAI Bao-chao JING Zhi-wei WANG Rui-feng WANG Zhi-jun GE Gen-tu JIA Yu-shan

（1.Colleg of Grassland Resources and Environment， Inner Mongolia Agricultural University/Key Laboratory of Forage Cultivation

Processing and High Efficient Utilization， Ministry of Agriculture， Hohhot， Inner Mongolia 010019， China； 2.Inner Mongolia Yihe

Lvjin Agricultural Development Co.， Ltd.， Chifeng， Inner Mongolia 025550， China）

Abstract：Silage plays a very important role in the process of animal husbandry production，but the accumulation of nitrite during silage fermentation is seriously harmful to animal production performance，milk and meat quality. Nitrite poisoning is a common foodborne disease to livestock. Mild poisoning can affect the growth and development of livestock，severe poisoning can even lead to the death of livestock. To reduce the risk of nitrite in silage and improve the quality of silage and secure the safety of silage，this paper described the hazards，sources，transformation pathways，nitrite degradation pathways and control measures during the silage process，to provide an effective reference for nitrite degradation and regulation in silage feed.

Key words：Silage;Nitrite;Transformation pathways;Degradation pathway;Control measures

亞硝酸鹽（Nitrite，NIT）是一種常見的有毒有害物質(zhì)，是評(píng)估飼料安全的重要指標(biāo)。當(dāng)飼料中亞硝酸鹽含量過高時(shí)，不僅會(huì)嚴(yán)重影響動(dòng)物生產(chǎn)性能，更能引起動(dòng)物急性中毒或者導(dǎo)致癌變。而硝酸鹽（Nitrate）含量較高的植物更容易造成亞硝酸鹽的積累，富含硝酸鹽的飼料主要有以白菜（Brassica rapa var. glabra Regel）、菠菜（Spinacia oleracea L.）為主的菜葉類植物以及馬鈴薯（Solanum tuberosum L.）、甜菜（Beta vulgaris L.）等塊莖植物等［1］。青貯飼料既能減少飼料原料中營養(yǎng)物質(zhì)的散失，也可抑制和降低有害微生物的生長繁殖［2］。青貯可以保持青綠多汁飼料的營養(yǎng)特性，延長飼草的保存時(shí)間，有助于解決季節(jié)和年度飼草不平衡關(guān)鍵問題。特別在內(nèi)蒙古地區(qū)，冬春時(shí)節(jié)寒冷漫長，青綠飼草和青貯飼草的缺乏制約了畜牧業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，對牧草采取青貯措施是穩(wěn)定高效利用牧草資源、緩解內(nèi)蒙古地區(qū)冬春季節(jié)畜禽飼草料緊缺等實(shí)質(zhì)性問題的有效手段［3］。因?yàn)閷δ敛葜衼喯跛猁}毒性的忽視，家畜家禽因采食飼草而引起中毒的不良現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了重大損失。

為此，探究青貯中亞硝酸鹽的危害、來源、轉(zhuǎn)化及降解途徑不僅可以提高人民對于亞硝酸鹽危害的認(rèn)知，進(jìn)一步減少亞硝酸鹽中毒事件的發(fā)生，更是對我國青貯飼料安全評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)有重要的意義。

1亞硝酸鹽的危害

亞硝酸鹽是常見的天然有毒有害物質(zhì)，也是世界公認(rèn)的強(qiáng)致癌物。我國飼料原料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)將玉米、餅粕類、麥麩等其他飼料和配合飼料中亞硝酸鹽含量限量值統(tǒng)一規(guī)定在≤15 mg·kg^-1，將濃縮飼料和精料補(bǔ)充料中亞硝酸鹽含量規(guī)定在≤20 mg·kg^-1［4］。

不同的動(dòng)物對亞硝酸鹽的敏感程度有很大差異，研究表明［5］豬對亞硝酸鹽的敏感程度最高，其亞硝酸鈉致死量為70～75 mg·kg^-1 BW（Body weight），其次為牛、羊、馬，其中牛的硝酸鈉致死量為650～750 mg·kg^-1 BW，亞硝酸鈉致死量為150～170 mg·kg^-1 BW；綿羊的硝酸鈉致死量為1 000 mg·kg^-1 BW［6］；母羊的硝酸鉀安全量為1 000 mg·kg^-1 BW，按干物質(zhì)計(jì)算為1.5%，其死亡量則為2%［5］。反芻動(dòng)物和單胃動(dòng)物亞硝酸鹽中毒的原因不同，單胃動(dòng)物亞硝酸鹽中毒主要是外源性亞硝酸鹽直接進(jìn)入消化道，吸收進(jìn)入血，由于亞硝酸鹽氧化性強(qiáng)，能將血液中的2價(jià)鐵氧化為3價(jià)鐵，進(jìn)而阻止血紅蛋白與氧氣結(jié)合，造成動(dòng)物缺氧窒息，引發(fā)全身組織嚴(yán)重的急性損傷，攝入過量亞硝酸鹽更有甚者會(huì)引起死亡［7］。然而反芻動(dòng)物大多數(shù)是由于食用大量的含有硝酸鹽的飼料，攝入硝酸鹽的量與瘤胃內(nèi)環(huán)境還原能力失去平衡，將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽后被吸收入血而引起的中毒［8］。在酸性條件下，亞硝酸鹽與飼料中或動(dòng)物胃內(nèi)的某些仲胺反應(yīng)，也可以生成N-亞硝基化合物，包括遺傳毒性和致癌的N-亞硝胺，對反芻動(dòng)物造成更嚴(yán)重的危害［9-10］。硝酸鹽、亞硝酸鹽以及N-亞硝基化合物的暴露、相互轉(zhuǎn)化會(huì)傷害動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)和骨骼系統(tǒng)，甚至能誘使子代發(fā)生基因突變，造成先天畸形［11］。

2亞硝酸鹽的微生物代謝途徑轉(zhuǎn)化

目前，有關(guān)青貯微生物多樣性研究的報(bào)道較多。研究表明乳桿菌（Lactobacillus）、不動(dòng)桿菌（Acinetobacter）、芽孢桿菌（Bacillus）、假單胞菌屬（Pseudomonaceae）、腸桿菌（Enterobacter）等為青貯中常見菌［12-13］，這些細(xì)菌均可能參與到青貯氮素生物地球化學(xué)循環(huán)當(dāng)中。亞硝酸鹽是氮素生物地球化學(xué)循環(huán)的中間產(chǎn)物，作用于亞硝酸鹽的微生物種類繁多，因此生成與降解亞硝酸鹽的途徑也有多種。生物地球化學(xué)循環(huán)中的氮素循環(huán)途徑中，不同生成途徑與降解途徑的關(guān)鍵基因不同，其反應(yīng)底物與產(chǎn)物也均不相同。其中亞硝酸鹽可能經(jīng)過反硝化作用（Denitrification）、硝化作用（Nitrification）、硝酸鹽氨化作用（Dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA）和厭氧氨氧化作用（Anammox）進(jìn)行轉(zhuǎn)化，反應(yīng)式如圖1所示［14］。

2.1反硝化作用（Denitrification）

反硝化作用是指在微氧或厭氧條件下，硝酸鹽、亞硝酸鹽被反硝化細(xì)菌等多種微生物異化還原成NO，NO₂或N₂等分子態(tài)氮釋放到大氣中的過程［15-16］。反硝化微生物主要分布在細(xì)菌當(dāng)中，除此之外部分古菌、真菌也屬于反硝化微生物［17-19］。pH值、溫度、有機(jī)碳和無機(jī)氮含量等環(huán)境因素均可能在一定程度上影響反硝化細(xì)菌的結(jié)構(gòu)與功能［20］。目前已知的反硝化細(xì)菌中已多達(dá)80個(gè)屬［21］，主要分布于熱袍菌門（Thermotogae）、產(chǎn)金菌門（Chrysiogenetes）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）和變形菌門（Protebacteria）中。常見有奈瑟菌科（Neisseriaceae）、硝化細(xì)菌科（Nitro bacteriaceae）、紅螺菌科（Rhodospirillaceae）和芽孢桿菌科（Bacillaceae）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、假單胞菌屬等菌群［22-23］。

2.2硝化作用（Nitrification）

硝化作用（Nitrification）是微生物將有機(jī)或無機(jī)氮素化合物轉(zhuǎn)化為硝態(tài)氮的過程，在該過程中亞硝酸鹽屬于中間產(chǎn)物。

硝化微生物可分為自養(yǎng)硝化和異養(yǎng)硝化微生物。自養(yǎng)硝化微生物硝化過程分別由氨氧化細(xì)菌（Ammonia oxidizing bacteria，AOB）和亞硝酸氧化細(xì)菌（Nitrite oxidizing bacteria，NOB）完成。其中，氨氧化細(xì)菌主要是將氨轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，亞硝酸鹽氧化細(xì)菌則是將亞硝酸鹽轉(zhuǎn)化為硝酸鹽。AOB主要包括變形菌綱β亞綱的亞硝化螺菌屬（Nitrosospira）、亞硝化單胞菌屬（Nitrosomonas）和γ亞綱的亞硝化球菌屬（Nitrosococcus），亞硝酸鹽氧化細(xì)菌一般有變形菌綱β亞綱的硝化刺菌屬（Nitrospina）、變形菌綱γ亞綱的硝化桿菌屬（Nitrobacter）、硝化球菌屬（Nitrococcus）和屬于硝化螺菌門的硝化螺菌屬（Nitrospira）等［24-26］。

異養(yǎng)硝化微生物主要集中在細(xì)菌的變形菌門（Protebacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）以及真菌的子囊菌門（Ascomycota）、擔(dān)子菌門（Basidiomycota）的部分真菌類群［27-32］，該類群可在有氧條件下將氨、銨或有機(jī)態(tài)氮氧化為羥胺、硝酸鹽和亞硝酸鹽［33］。目前報(bào)道較多的有不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、無色桿菌屬（Achromobacter）［34-36］。

2.3硝酸鹽氨化作用（Dissimilatory nitrate reduction to ammonium，DNRA）

硝酸鹽氨化作用（DNRA）是指在厭氧條件下硝酸鹽經(jīng)硝酸鹽還原酶作用轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，進(jìn)一步被微生物異化還原成銨的過程［37］。第一步反應(yīng)與反硝化作用相同，都是在硝酸鹽還原酶的作用下將硝酸鹽還原為亞硝酸鹽。DNRA菌按呼吸類型可分為微嗜氧菌、好氧菌、兼性厭氧菌以及專性厭氧菌四類，以兼性厭氧菌最為廣泛，并且大多數(shù)DNRA菌屬于異養(yǎng)型，需要發(fā)酵碳源獲得電子供體［38］。DNRA與反硝化過程都屬于異養(yǎng)過程，均在厭氧或缺氧環(huán)境下進(jìn)行，且都需要碳源作為電子供體，硝酸鹽為電子受體，二者是協(xié)同競爭關(guān)系。在相同條件下，反硝化作用所需的自由能小于比DNRA反應(yīng)所需的自由能，因此多數(shù)情況下硝酸鹽氨化作用比反硝化作用更難發(fā)生［39-41］。有效碳含量、碳源種類、硫化物含量、pH值、氧化還原電位和鹽濃度等環(huán)境因子都會(huì)影響DNRA反應(yīng)和反硝化作用競爭［42］。

2.4厭氧氨氧化作用（Anammox）

厭氧氨氧化作用（Anammox）是在厭氧條件下，厭氧氨氧化細(xì)菌將NH⁺₄作為電子供體，NO^-₂作為電子受體，將氨態(tài)氮（NH⁺₄-N）和亞硝態(tài)氮（NO^-₂-N）轉(zhuǎn)化為N2的生物氧化過程。目前已知的進(jìn)行厭氧氨氧化作用的細(xì)菌類群主要為浮霉?fàn)罹浚≒lanctomycetales）［43］，其中Candidatus Brocadia，Candidatus Kuenenia，Candidatus Scalindua，Candidatus Anammoxoglobus，Candidatus Jettenia，Candidatus Anammoximicrobium和Candidatus Brasilis七個(gè)屬為主要厭氧氨氧化作用的細(xì)菌類群［44］。

3青貯亞硝酸鹽來源

3.1青貯前原料亞硝酸鹽來源

硝酸鹽雖基本不會(huì)對畜禽產(chǎn)生直接造成的危害，但在一些條件下硝酸鹽會(huì)轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，可對畜禽產(chǎn)生嚴(yán)重威脅。若飼料本身含有高含量的硝酸鹽，必須對其進(jìn)行嚴(yán)格處理與妥善保存，否則會(huì)造成亞硝酸鹽含量急劇上升，甚至可能形成毒性更強(qiáng)的亞硝基化合物。牧草中硝酸鹽的積累主要取決于牧草種類和收獲前的環(huán)境條件，也與牧草品種、發(fā)育階段、取樣部位以及牧草的個(gè)體差異有關(guān)，此外，外界環(huán)境條件如地理位置、土壤成分、水分、溫度、光照等因素，以及刈割、施肥等農(nóng)業(yè)技術(shù)措施也會(huì)影響植物中硝酸鹽的積累［45-46］。促進(jìn)硝酸鹽生成和吸收的措施有改良土壤品質(zhì)、大量澆水、重施氮肥等，而日照時(shí)長不足、使用除草劑等會(huì)抑制植物對硝酸鹽的利用以及阻礙其蛋白同化，這些因素均會(huì)造成植物中硝酸鹽大量累積［47］。

在青貯原料中所含亞硝酸鹽含量較高的主要為菜葉類，其中菜葉類gt;根莖類gt;果實(shí)類gt;其他類［48］。韓丹蕊等［49］以呼倫貝爾草原16種牧草作為試驗(yàn)材料，發(fā)現(xiàn)不同種類牧草青貯飼料之間亞硝酸鹽含量有極顯著差異，亞硝酸鹽含量最高的是灰蒿（Artemisia L.），達(dá)2.45 mg·kg^-1；最低的是黃芪（Astragalus membranaceus （Fisch.） Bunge），為0.10 mg·kg^-1。馮鵬等［50］在研究不同比例玉米（Zea mays L.）與沙打旺（Astragalus laxmannii Jacquin）混合青貯時(shí)發(fā)現(xiàn)，青貯可以降低各處理的亞硝酸鹽含量，其中沙打旺單貯的原料以及青貯樣品中的亞硝酸鹽含量均高于其他處理，這也表明不同的青貯原料對硝酸鹽、亞硝酸鹽的敏感度也不同。韓立英等［51］研究表明施用尿素（50 kg·hm^-2）顯著提高玉米青貯原料以及青貯中亞硝酸鹽含量，并且在第6天的亞硝酸鹽含量比第0天增加了2.13倍。收割后的青綠玉米中亞硝酸鹽的含量隨著留茬高度的增加而降低，隨貯藏時(shí)間的增加而升高，至最高值后又緩慢降低［52］。李小梅［53］研究表明，在高施氮水平下（450 kg·hm^-2），第一茬和第二茬多花黑麥草（Lolium multiflorum Lamk.）在各追施比例下的硝酸鹽含量均超過0.25%DM，能不同程度的危害家畜安全。由于干旱脅迫，未進(jìn)行灌溉處理青貯玉米植株不能正常利用硝酸鹽，導(dǎo)致大量硝酸鹽、亞硝酸鹽累積在植物體內(nèi)，并且亞硝酸鹽含量超出0.5%的臨界值［54］。

3.2青貯后亞硝酸鹽的積累

青貯過程中所含亞硝酸鹽主要來自硝酸鹽等含氮物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，這個(gè)轉(zhuǎn)化主要是由于微生物的參與。青貯過程中亞硝酸鹽的降解主要與乳酸菌的生長有關(guān)，而亞硝酸鹽的積累更多地依賴于其他微生物（如大腸桿菌Escherichia coli）［55］。大腸桿菌等腸細(xì)菌在青貯飼料中屬于有害菌，可分解青貯飼料中的糖類物質(zhì)和蛋白質(zhì)，產(chǎn)生生物胺和支鏈脂肪酸，使青貯品質(zhì)下降，并且它還能將青貯中的硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽［56-57］。

硝酸鹽可以被硝酸鹽還原細(xì)菌還原為亞硝酸鹽，在青貯前期由于環(huán)境中乳酸菌數(shù)量較低，無法抑制其它菌生長，致使溫度升高，導(dǎo)致硝酸鹽還原菌快速生長繁殖、數(shù)量驟升，將飼料中的硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽。目前青貯中硝酸鹽降解可能與泛菌（Pantoea）、假單胞菌、不動(dòng)桿菌、沙雷氏菌（Serratia）、水桿菌（Aquabacterium）、腸桿菌（Enterobacter）和乳球菌（Lactococcus）等［58-59］有關(guān)。研究表明［60］硝酸鹽還原菌的生長受培養(yǎng)基最初的pH值所影響，硝酸鹽還原菌生長的最適pH值為7.0～7.9，當(dāng)pH值低于5.2時(shí)，未發(fā)現(xiàn)此菌的生長。

4青貯過程中亞硝酸鹽的降解途徑

4.1青貯過程中乳酸菌對亞硝酸鹽的影響

大量研究表明青貯可以有效降解亞硝酸鹽［61-62］。在青貯期間，乳酸菌可通過代謝生成有機(jī)酸、亞硝酸鹽還原酶、乳酸菌素等產(chǎn)物，這些產(chǎn)物在降解亞硝酸鹽過程中起到直接或間接作用［63-64］。研究發(fā)現(xiàn)植物乳桿菌（L. plantarum）、短乳桿菌（L. brevis）、腸膜明串珠菌（Leuconostoc mesnteroides）、啤酒片球菌（Pediococcus cereuisiae）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis subsp.lactis）等乳酸菌均具有良好的產(chǎn)酸能力，能使發(fā)酵過程中的pH值迅速降低以降解亞硝酸鹽，同時(shí)還能抑制其他有害微生物的繁殖，如大腸桿菌［65］。

在青貯發(fā)酵階段初期，由于青貯中還存有少量氧氣，導(dǎo)致大腸桿菌等其他好氧細(xì)菌快速繁殖，這些微生物將硝酸鹽轉(zhuǎn)化為亞硝酸鹽，可能使亞硝酸鹽含量呈上升趨勢［66］。隨著青貯時(shí)間的延長，發(fā)酵過程中氧氣逐漸減少，使乳酸菌在厭氧狀態(tài)下快速生長，從而取代大腸桿菌等其他微生物成為優(yōu)勢菌種。此時(shí)，降解亞硝酸鹽主要通過乳酸菌產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶降解亞硝酸鹽，pH值通常在4.5左右［67］。當(dāng)?shù)竭_(dá)發(fā)酵后期時(shí)，乳酸菌產(chǎn)生大量酸性物質(zhì)，pH值降至4.0以下，此時(shí)降解亞硝酸鹽主要為酸降解［67］。由于乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生大量有機(jī)酸，使發(fā)酵液pH值迅速降低，從而抑制有害微生物生長繁殖，降解亞硝酸鹽［68］。例如，乳酸桿菌產(chǎn)酸能力強(qiáng)于乳酸球菌，在進(jìn)行到發(fā)酵后期時(shí)乳酸桿菌通過酸降解的方式降解亞硝酸鹽的能力要高于乳酸球菌［69］。吳征敏［70］在菠蘿渣中應(yīng)用不同添加劑，共設(shè)置13個(gè)處理組，其中添加乳酸菌處理組的亞硝酸鹽含量顯著下降。從發(fā)酵蔬菜中分離得到一株植物乳桿菌DMDL9010，在MRS培養(yǎng)基中加入亞硝酸鹽（10 mg·L^-1），發(fā)酵24小時(shí)后MRS培養(yǎng)基中亞硝酸鹽含量基本為0，這也表示植物乳桿菌有較好的降解亞硝酸鹽的能力［71］。沈昳瀟等［72］通過研究不同乳酸菌對酸白菜中亞硝酸鹽的影響，發(fā)現(xiàn)復(fù)合乳酸菌有明顯的互作作用，且將不同乳酸菌進(jìn)行復(fù)配對亞硝酸鹽含量有明顯的影響，復(fù)合乳酸菌處理發(fā)酵速度最快，其亞硝酸鹽含量遠(yuǎn)低于單一菌種處理組。

4.2青貯過程中有機(jī)酸對亞硝酸鹽含量的影響

有機(jī)酸具有一定的還原性，而亞硝酸鹽具有強(qiáng)氧化性，青貯中亞硝酸鹽可能與有機(jī)酸進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，以降低亞硝酸鹽的含量。乳酸菌利用碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生乳酸、乙酸等有機(jī)酸，其中乳酸是乳酸菌發(fā)酵過程中的主要代謝產(chǎn)物。乳酸菌產(chǎn)酸降解亞硝酸鹽是在酸性條件下，過量的H⁺與NO^-₂反應(yīng)生成NO，NO₂，從而降解亞硝酸鹽的過程，反應(yīng)式為2 NO^-₂+H⁺NO₂↑+NO↑+H₂O。在大白菜發(fā)酵過程中，硝酸鹽含量呈先下降后穩(wěn)定的趨勢，而亞硝酸鹽的含量在pH值低于4.5時(shí)先升高后下降［73］。并且酸對亞硝酸鹽的降解率高于亞硝酸鹽還原酶，當(dāng)pH值低于4.0時(shí)，不僅能夠抑制硝酸鹽還原酶的活性，從而抑制硝酸鹽被還原成亞硝酸鹽過程，達(dá)到抑制泡菜中亞硝酸鹽生成的作用，而且低pH值能夠加速亞硝酸鹽的降解，提高亞硝酸鹽還原酶活性，可進(jìn)一步減少發(fā)酵過程中的亞硝酸鹽含量［74］。因此，酸降解是乳酸菌降解亞硝酸鹽的重要方式，明確青貯發(fā)酵過程中有機(jī)酸種類及其對亞硝酸鹽的降解機(jī)理是研究青貯中酸降解的核心。

國內(nèi)外研究清除亞硝酸鹽的有機(jī)酸主要有抗壞血酸（Ascorbic acid）、檸檬酸（Citric acid）、醋酸（Acetic acid）、乳酸（Lactic acid）等，其中對抗壞血酸研究較為深入?？箟难嶙鳛檫€原劑可將亞硝酸鹽還原為NO，而抗壞血酸則被氧化為脫氫抗壞血酸，但反應(yīng)液的pH值大于4.0時(shí)，亞硝酸鹽基本上不發(fā)生降解［75-76］。也有研究表明在發(fā)酵過程中添加抗壞血酸不僅可以降低亞硝酸鹽的含量，而且可有力防止亞硝胺的形成［77］。目前的研究主要是將檸檬酸、醋酸、乳酸等作為酸性物質(zhì)，通過調(diào)節(jié)其溶液的pH值以清除亞硝酸鹽［78-80］，就目前而言，對各種有機(jī)酸降解亞硝酸鹽降解規(guī)律和作用機(jī)理研究較少，亟待深入研究。

不同種類的有機(jī)酸對不同原料的發(fā)酵中的亞硝酸鹽含量影響有所不同。鄒輝等［81］研究了7種有機(jī)酸對亞硝酸鹽降解的能力，其中草酸、蘋果酸降解能力最強(qiáng)，丙酸、乳酸降解能力最弱。楊晶［82］對植物乳桿菌5-7-3發(fā)酵過程中的有機(jī)酸含量與亞硝酸鹽含量做相關(guān)性分析，結(jié)果表明植物乳桿菌5-7-3發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸含量與亞硝酸鹽含量呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中蘋果酸、乳酸相關(guān)性最強(qiáng)，酒石酸、檸檬酸的相關(guān)性最弱。徐柯等［83］以豇豆為原料制作泡菜，結(jié)果表明添加檸檬酸0.3%能最大程度的降解泡菜中的硝酸鹽、亞硝酸鹽，使其含量分別達(dá)到97.86 mg·kg-1與2.33 mg·kg-1。商景天［84］對泡菜在自然發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸種類進(jìn)行分析，結(jié)果表明在72 h反應(yīng)周期內(nèi)，6種有機(jī)酸均能降解亞硝酸鹽，其中草酸、酒石酸降解亞硝酸鹽能力最高，乙酸降解能力最低；亞硝酸鹽降解率隨有機(jī)酸起始濃度的增加而增大，升高溫度也能提高有機(jī)酸對亞硝酸鹽的降解能力。

4.3青貯過程中亞硝酸鹽還原酶降解亞硝酸鹽

亞硝酸鹽是生物生境中硝酸鹽還原或氨氧化形成的生物氮循環(huán)的重要組成部分。厭氧或微氧條件下，部分細(xì)菌將亞硝酸鹽當(dāng)作電子受體或氮源。亞硝酸鹽氧化性極強(qiáng)，其還原被視為是一個(gè)同化、呼吸或異化的過程。硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase，NR）首先將硝酸鹽降解為亞硝酸鹽后，亞硝酸鹽還原酶（Nitrite reductase，NiR）將亞硝酸鹽降解為N2或NH+4，減少了亞硝態(tài)氮在環(huán)境中的積累，最終氨參與到蛋白質(zhì)的合成反應(yīng)中。硝酸鹽還原酶是亞硝酸鹽還原酶的限速酶。同時(shí)，亞硝酸鹽還原酶在環(huán)境中有亞硝酸鹽存在的情況下能被誘導(dǎo)生成，因此是一種誘導(dǎo)酶［85］。

按照反應(yīng)物和輔助因子的不同，亞硝酸鹽還原酶分為銅型亞硝酸鹽還原酶（CuNiRs）、細(xì)胞色素cd1型亞硝酸鹽還原酶（cd1 NiRs）、多聚血紅素c亞硝酸鹽還原酶（ccNiRs）和鐵氧化還原蛋白依賴的亞硝酸鹽還原酶（FdNiRs）［86］等類型。

目前，對銅型亞硝酸鹽還原酶催化機(jī)制研究最為透徹，研究顯示：CuNiRs還原NO^-₂的步驟包括NO^-₂與酶的結(jié)合、還原反應(yīng)、結(jié)合的中間產(chǎn)物脫水以及NO的釋放和酶的重新形成。其中，NO^-₂與氧化形式的T2Cu中心結(jié)合而替換一個(gè)可溶性分子，并在Asp98殘基和NO-2的一個(gè)氧原子間形成氫鍵。當(dāng)電子從T1Cu傳遞到T2Cu后，該氫鍵的質(zhì)子從Asp98殘基轉(zhuǎn)移到底物的氧原子上形成中間產(chǎn)物O=N-O-H，該氧原子的N-O鍵隨后斷裂并形成產(chǎn)物NO在活性中心被釋放［87］。

研究發(fā)現(xiàn)，多種微生物（包括真菌、細(xì)菌）可由亞硝酸鹽誘導(dǎo)產(chǎn)生亞硝酸鹽還原酶再降解亞硝酸鹽［88］。目前，關(guān)于對乳酸菌所產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶性質(zhì)的研究文獻(xiàn)比較多，溫度、pH值、碳源、氮源、底物濃度等均能夠影響酶催化效率。付豪等［89］通過篩選多種乳酸桿菌后得出鼠李糖乳桿菌N-6所產(chǎn)生的亞硝酸鹽還原酶的降解能力最強(qiáng)。劉萍等［90］從巨大芽胞桿菌中分離純化得到亞硝酸鹽還原酶，在肉制品加工過程中加入后亞硝酸鹽的殘留量降低了70%以上。飼料中亞硝酸鹽的生物法降解是一種高效、安全的方法，但目前對微生物亞硝酸鹽還原酶作用機(jī)理的研究相對較少［91］。

5亞硝酸鹽調(diào)控方式

5.1原料調(diào)控亞硝酸鹽含量

降低青貯中的亞硝酸鹽含量應(yīng)先從原料入手，青貯前降低青貯原料中硝酸鹽和亞硝酸鹽含量是最佳的方法。通過選擇硝酸鹽、亞硝酸鹽含量低的品種，或者將亞硝酸鹽含量高的品種與含量低的品種進(jìn)行混貯都可有效降低亞硝酸鹽的含量［61］。在保證植株正常生長的情況下，適量施用氮肥，以減少土壤中硝酸鹽含量，也可有效降低植株體內(nèi)硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量［92］?？刂坪线m的留茬高度，過低的留茬高度可能將植物根部泥土帶入青貯中，且會(huì)增加硝酸鹽含量［93］。干旱條件下，盡量補(bǔ)充水源灌溉，避免植株大量積累亞硝酸鹽，合理的施灌控制將對緩解農(nóng)業(yè)硝酸鹽污染起到積極作用［94-95］。

5.2青貯方式調(diào)控亞硝酸鹽含量

青貯適宜的含水量、切碎長度、壓實(shí)密度、貯藏溫度與時(shí)間等不僅可以提高其營養(yǎng)品質(zhì)，同時(shí)也增強(qiáng)了青貯的安全性，并減少了青貯中亞硝酸鹽等有害物質(zhì)的產(chǎn)生［96］。在發(fā)酵過程中含水量越高，亞硝酸鹽含量越低，因此青貯時(shí)可適當(dāng)提高其含水量［97］。壓實(shí)密度、溫度和含水量的增加，pH值呈先減小后增大的趨勢［98］，較低的pH值可促進(jìn)發(fā)酵過程中的酸降解亞硝酸鹽。

5.3青貯添加劑調(diào)控亞硝酸鹽含量

在青貯中添加菌劑、酶制劑、化學(xué)添加劑、營養(yǎng)添加劑等添加劑也是降低青貯中亞硝酸鹽含量的有效途徑之一，同時(shí)添加添加劑還可以提高青貯的風(fēng)味、營養(yǎng)品質(zhì)與發(fā)酵品質(zhì)［89-99］。如鹽、糖、生姜和大蒜等可能通過直接或間接的方式影響發(fā)酵過程硝酸鹽和亞硝酸鹽的含量［100］。目前，針對降解亞硝酸鹽的細(xì)菌研究較多，如通過從廢水、泡菜等篩選降解亞硝酸鹽菌、乳酸菌等［101-103］，但對酶的研究較少。通過添加降解亞硝酸鹽菌劑和酶制劑可直接或間接降解亞硝酸鹽含量，利用生物法降解青貯中亞硝酸鹽是未來的研究的方向。

6展望

亞硝酸鹽不僅僅是青貯飼料中的有害物質(zhì)，同時(shí)也是氮素生物地球化學(xué)循環(huán)的中心，以亞硝酸鹽為中心的生物地球化學(xué)循環(huán)均有可能發(fā)生在青貯發(fā)酵過程中?？刂魄噘A中有毒有害物質(zhì)，確保飼料品質(zhì)安全，有利于我國飼草產(chǎn)業(yè)更加健康長遠(yuǎn)的發(fā)展。青貯中亞硝酸鹽含量受原料、加工方式、微生物等因素影響，并隨著青貯貯藏時(shí)間的變化，營養(yǎng)物質(zhì)、微生物群落結(jié)構(gòu)也在時(shí)刻變化，使青貯發(fā)酵過程中代謝物、關(guān)鍵酶豐富多樣。因此，明確青貯各時(shí)期微生物群落結(jié)構(gòu)、有機(jī)酸、關(guān)鍵酶等是研究降解亞硝酸鹽的有效措施，并且應(yīng)從多方面多角度出發(fā)。

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（責(zé)任編輯閔芝智）