陳子合 黃健 黃春鑫 劉慧臨

乳腺癌(breast cancer)是女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤,全球乳腺癌新發(fā)病例約230 萬,在全部新發(fā)惡性腫瘤中占比11.7%,乳腺癌發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌,成為最常見的癌癥［1］。目前國內(nèi)常用的治療方式是聯(lián)合治療［2］,但預(yù)后仍然不盡人意,部分患者死于腫瘤復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。雷公藤內(nèi)酯醇(triptolide,TPL)是一種天然成分,來源于中藥雷公藤的根［3］,其具有多種作用,包括抗炎、抗氧化、抗癌等。對于癌癥治療,雷公藤內(nèi)酯醇已經(jīng)被證實(shí)可以顯著抑制乳腺癌的生長,治療乳腺癌效果良好［4］。由于雷公藤內(nèi)酯醇在水中溶解性低以及對人體胃腸道、造血系統(tǒng)等毒性較大［5］,使其在臨床應(yīng)用上受到了較大的限制。而超聲分子影像技術(shù)的出現(xiàn),則為臨床提供了更高效診斷、治療的新技術(shù)和方向。超聲微泡能夠協(xié)載輸送藥物,克服了藥物的低水溶性,并且還能夠減少藥物對于正常組織器官的毒副作用［6］。既往研究發(fā)現(xiàn),乳腺癌MCF-7 細(xì)胞表面有大量的葉酸受體表達(dá)［7］,而葉酸能夠特異性地與葉酸受體結(jié)合,因此利用超聲微泡協(xié)載成像物質(zhì)與其連接,可以在分子和細(xì)胞水平上靶向監(jiān)測乳腺癌的分布范圍和位置,通過超聲靶向擊碎技術(shù),能夠定點(diǎn)釋放協(xié)載藥物,做到精準(zhǔn)治療。因此本研究旨在制備一款協(xié)載雷公藤內(nèi)酯醇靶向于人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的超聲微泡(FA-TLLM),評價(jià)其表征并對乳腺癌細(xì)胞增殖抑制作用進(jìn)行初步研究。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料與主要儀器

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料 1,2-二棕櫚酰-sn-甘油-3-磷酰膽堿(DPPC,上海麥克林生化科技有限公司)、二硬脂酰磷脂酰乙酰胺-聚乙二醇2000-葉酸(DSPEPEG2000-Folate,重慶渝偲醫(yī)藥科技有限公司)、雷公藤內(nèi)酯醇(上海源葉生物科技有限公司)、全氟丙烷(C3F8,天津核工業(yè)理化工程研究院)、葉酸單克隆抗體、FITC 標(biāo)記的兔抗鼠免疫球蛋白G(IgG)(上海艾比瑪特生物醫(yī)藥有限公司)、人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)、Cell Counting Kit-8(上海陶術(shù)生物科技有限公司)

1.1.2主要儀器 真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(瑞士BUCHI)、銀汞調(diào)和機(jī)(上海醫(yī)療器械公司)、倒置熒光顯微鏡(德國Zeiss)、流式細(xì)胞儀(美國BD)、激光粒徑測定儀(美國PSS)、酶標(biāo)儀(澳大利亞Tecan)、便攜式超聲診斷儀(荷蘭Philips)

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1FA-TLUM 的合成 采用薄膜水化法將DPPC 5 mg、DSPE-PEG-FA 2 mg、雷公藤內(nèi)酯醇1 mg 完全溶解于10 ml 三氯甲烷中,通過旋蒸形成脂質(zhì)薄膜。加入4 ml PBS 水化后通入全氟丙烷氣體,置于銀汞調(diào)和機(jī)上機(jī)械震蕩 40 s,靜置后棄去上層泡沫得到FATLUM。

1.2.2FA-TLUM 的表征檢測 通過倒置顯微鏡觀察FA-TLUM 的一般形態(tài),激光粒徑測定儀檢測FATLUM 水合粒徑、Zeta 電位。

1.2.3載藥量及包封率的測定 通過紫外分光光度法測定FA-TLUM 中雷公藤內(nèi)酯醇的載藥量及包封率,用甲醇溶解雷公藤內(nèi)酯醇并分別配置成不同濃度梯度的樣品溶液,測量各濃度溶液在218 nm 的OD 值,根據(jù)濃度和OD 值,利用Origin 軟件繪制擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。低速離心FA-TLUM,甲醇溶解上層泡沫和底部沉淀,測定OD 值,結(jié)合擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算載藥量和包封率。載藥量=(總投放量-游離量/微泡總質(zhì)量)×100%；包封率=(總投放量-游離量/總投放量)×100%。

1.2.4FA-TLUM 表面葉酸連接情況的鑒定 分別量取0.5 ml 載雷公藤內(nèi)酯醇非靶向超聲微泡(TLUM)及FA-TLUM 于Ependoff 管中,加入2 μl 葉酸單克隆抗體,置于冰箱4℃孵育過夜。低速離心(800 r/min,3 min),PBS 清洗3 次以去除過量的一抗。加入1 μl FITC 標(biāo)記的兔抗鼠IgG 二抗,室溫避光孵育1 h。低速離心,PBS清洗3 次去除過量的二抗。取出稀釋后置于倒置熒光顯微鏡觀察,并于流式細(xì)胞儀檢測FA-TLUM 加入一抗前后的熒光強(qiáng)度。

1.2.5FA-TLUM 體外針對人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞尋靶能力的檢測 取對數(shù)生長期的MCF-7 細(xì)胞,按1×105個(gè)/孔接種于六孔板內(nèi),繼續(xù)培養(yǎng)24 h,制備MCF-7 細(xì)胞爬片。分別量取100 μl TLUM 及FA-TLUM加入到六孔板內(nèi),每孔加入2 ml 培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)30 min。取出爬片,PBS 反復(fù)沖洗3 次。最后將細(xì)胞爬片浸泡于新的培養(yǎng)液內(nèi),倒置顯微鏡觀察結(jié)合情況。

1.2.6CCK-8 法檢測MCF-7 細(xì)胞毒性作用 實(shí)驗(yàn)分為7 組,每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔：空白對照組(Con 組)、雷公藤內(nèi)酯醇組(TPL 組)、雷公藤內(nèi)酯醇聯(lián)合超聲組(TPL+US 組)、載藥微泡組(TLUM 組)、載藥微泡聯(lián)合超聲組(TLUM+US 組)、葉酸修飾的靶向載藥微泡組(FA-TLUM 組)、葉酸修飾的靶向載藥微泡聯(lián)合超聲組(FA-TLUM+US 組)。取對數(shù)生長期的MCF-7 細(xì)胞,按8000 個(gè)/孔接種于96 孔培養(yǎng)板,每孔接種體積100 μl?？瞻讓φ战M給予常規(guī)培養(yǎng)液處理,給藥組以TPL IC50［8］的藥物濃度(20 nmol/L)給藥,超聲輻射機(jī)械指數(shù)MI=1,輻照時(shí)間1 min。繼續(xù)培養(yǎng)48 h,每孔加入10 μl CCK-8試劑,37 ℃培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm 測定A 值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,t 檢驗(yàn)或單因素方差分析進(jìn)行兩組或多組間比較。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1FA-TLUM 的表征檢測結(jié)果 倒置顯微鏡下觀察微泡大小均一,分布均勻,彼此無明顯聚集。FA-TLUM 平均水動(dòng)力尺寸為(1.36±0.03)μm,Zeta 電位為(-16.55±0.36)mV。見圖1,圖2。

圖1 FA-TLUM 水合粒徑圖

圖2 FA-TLUM Zeta 電位圖

2.2FA-TLUM 載藥量和包封率的測定結(jié)果 實(shí)驗(yàn)測定不同雷公藤內(nèi)酯醇濃度的吸光度,用Origin 進(jìn)行線性擬合后,相關(guān)性R2=0.99873,呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。通過計(jì)算得出FA-TLUM 載藥量為(10.85±0.48)%,包封率為(75.94±3.36)%。見圖3,圖4。

圖3 不同波長下TPL 吸光度曲線

圖4 微泡數(shù)據(jù)經(jīng)線性擬合函數(shù)圖像

2.3FA-TLUM 表面葉酸連接情況的鑒定結(jié)果 在倒置熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)TLUM 周圍未見綠色熒光,而FA-TLUM 周圍可見明顯綠色熒光分布。說明FATLUM 表面有葉酸連接,通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行半定量分析,加入一抗、二抗孵育后較孵育前熒光強(qiáng)度增加,可進(jìn)一步驗(yàn)證微泡表面有大量葉酸連接。見圖5,圖6。

圖5 倒置熒光顯微鏡下觀察 TLUM 和 FA-TLUM 表面葉酸連接情況TLUM(圖 a、b)、FA-TLUM(圖 c、d)

圖6 流式細(xì)胞儀檢測FITC 標(biāo)記FA-TLUM

2.4FA-TLUM 體外針對MCF-7 細(xì)胞的尋靶能力檢測結(jié)果 通過倒置熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)FA-TLUM 與MCF-7 細(xì)胞連接牢固,主要分布于細(xì)胞周圍,而TLUM未見或僅見極少量與MCF-7 細(xì)胞粘附。見圖7。

圖7 倒置熒光顯微鏡下觀察 TLUM 和 FA-TLUM 體外尋靶能力TLUM(圖 a)、FA-TLUM(圖 b)

2.5CCK-8 法檢測MCF-7 細(xì)胞毒性作用結(jié)果 檢測結(jié)果表明,TPL 組、TPL+US 組、TLUM+US 組、FATLUM+US 組對MCF-7 細(xì)胞增殖具有明顯的細(xì)胞毒性作用,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05),四組中可以明顯看到FA-TLUM+US 組的細(xì)胞毒性作用強(qiáng)于其他3 組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P＜0.05)；TLUM 組、FA-TLUM 組和Con 組間比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見圖8。

圖8 CCK-8 法檢測各處理組對MCF-7 細(xì)胞的毒性作用

3 討論

癌癥已經(jīng)嚴(yán)重危害人類生命健康和社會(huì)發(fā)展進(jìn)步,乳腺癌正是全球發(fā)病率最高的惡性腫瘤,死亡率居世界第5 位［9］,提升乳腺癌的治療效果是亟待解決的問題。

近年來,中藥抗腫瘤受到極大關(guān)注,因其治療效果良好且副作用小,逐漸成為抗腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。既往已有研究表明,雷公藤內(nèi)酯醇具有廣譜、高效的抗腫瘤特點(diǎn),對多種乳腺癌細(xì)胞增殖抑制作用明顯,對人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞尤其敏感［10］。但是雷公藤內(nèi)酯醇水溶性差,毒性作用大亟待解決。Zheng 等［11］將陽離子脂質(zhì)體作為載體包裹雷公藤內(nèi)酯醇,通過修飾HA介導(dǎo)脂質(zhì)體靶向乳腺癌細(xì)胞高表達(dá)的CD44 受體,避免雷公藤內(nèi)酯醇與體液直接接觸,降低對人體的刺激性以及生物毒性。Luo 等［12］將雷公藤內(nèi)酯醇包裹在新型溫度響應(yīng)型聚(N-異丙基丙烯酰胺-丙烯酸)-泊洛沙姆F68 水凝膠,顯著降低雷公藤內(nèi)酯醇毒性作用。目前還鮮有研究將雷公藤內(nèi)酯醇與超聲微泡相結(jié)合,本實(shí)驗(yàn)利用脂質(zhì)體為載體,雷公藤內(nèi)酯醇負(fù)載在磷脂雙分子層內(nèi),改善雷公藤內(nèi)酯醇低水溶性,全氟丙烷作為承載物,能夠通過超聲設(shè)備進(jìn)行二次諧波成像,實(shí)時(shí)監(jiān)測微泡分布范圍和位置且微泡具有較低細(xì)胞毒性。本實(shí)驗(yàn)制備的微泡大部分在1～2 μm 之間,分布均勻,電位-16.55 mV 左右,穩(wěn)定性較好,載藥量和包封率符合預(yù)期要求。

近年來,藥物靶向輸送逐漸成為研究領(lǐng)域熱點(diǎn),葉酸受體在乳腺惡性腫瘤過表達(dá),在正常組織表達(dá)高度保守,并且其過表達(dá)與預(yù)后不良相關(guān)［13］。葉酸是一種天然小分子物質(zhì),相比于大分子物質(zhì),到達(dá)靶點(diǎn)時(shí)間短,穿透能力極強(qiáng),免疫反應(yīng)小,易于修飾,葉酸與葉酸受體結(jié)合具有高度親和力,因此葉酸和葉酸受體在靶向輸送中有著巨大的潛力［14］。免疫熒光實(shí)驗(yàn)顯示,葉酸被成功連接到微泡表面,流式半定量進(jìn)一步分析,相比加入一抗之前微泡熒光強(qiáng)度顯著提高,說明大量的葉酸被成功偶聯(lián)。體外尋靶實(shí)驗(yàn)顯示,微泡可以主動(dòng)結(jié)合到人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞,并且在經(jīng)過PBS 3 次反復(fù)沖洗下還能夠結(jié)合到細(xì)胞表面,說明尋靶能力較好。CCK-8 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,相比于僅使用雷公藤內(nèi)酯醇或TLUM+US,FA-TLUM+US 對于MCF-7 細(xì)胞的增殖抑制作用更強(qiáng),抗腫瘤能力更強(qiáng),因此FA-TLUM 聯(lián)合超聲靶向破碎技術(shù)有望為臨床治療乳腺癌提供新的研究思路。而沒有超聲靶向破碎技術(shù)參與的組別,與CON 組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),這說明FATLUM 發(fā)揮作用與超聲靶向破碎技術(shù)密不可分,分析原因可能與微泡被超聲擊碎時(shí)內(nèi)部氣體瞬間產(chǎn)生空化效應(yīng)有關(guān)［15］。本研究目前在細(xì)胞水平對MCF-7 細(xì)胞毒性作用進(jìn)行初步探討,為后續(xù)研究MCF-7 細(xì)胞凋亡機(jī)制以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ),以期將來能夠應(yīng)用于臨床診斷與治療。

綜上所述,本研究成功制備載FA-TLUM,且FATLUM 與超聲靶向破碎技術(shù)聯(lián)合能夠增強(qiáng)對人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞的增殖抑制作用。