鄭 凱，任華亮，張望德，李春民

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院 血管外科，北京 100020)

主動(dòng)脈擴(kuò)張性疾病是主動(dòng)脈的一種病理性擴(kuò)張狀態(tài)，主要包括主動(dòng)脈真性動(dòng)脈瘤、假性動(dòng)脈瘤和主動(dòng)脈夾層，其代表疾病為主動(dòng)脈夾層(aortic dissection，AD)和腹主動(dòng)脈瘤(abdominal aortic aneurysm，AAA)[1]。Stanford B型 AD年發(fā)病率約為 3/10萬(wàn)例，20%患者未入院即死亡，Stanford A型 AD的發(fā)病率和病死率則更高[2]。40歲以上高危人群AAA的患病率為0.33%，破裂性 AAA病死率高達(dá)50%～70%，加上未及時(shí)手術(shù)的破裂性AAA，其總死亡率可高達(dá)90%[3]。

目前，主動(dòng)脈擴(kuò)張性疾病的治療方式主要包括手術(shù)和介入治療，手術(shù)過(guò)程復(fù)雜、風(fēng)險(xiǎn)大，對(duì)患者創(chuàng)傷大且費(fèi)用較高，并無(wú)有效的藥物預(yù)防和治療措施，以至于其發(fā)生、發(fā)展機(jī)制成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。以往的研究基本都是反映疾病發(fā)展過(guò)程中某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的靜態(tài)特征，并未從根本上揭示主動(dòng)脈擴(kuò)張疾病的發(fā)病機(jī)制。隨著新興技術(shù)手段的突破與應(yīng)用，特別是單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)的出現(xiàn)，為鑒定癌變細(xì)胞及其發(fā)展過(guò)程[4]、繪制組織器官發(fā)育轉(zhuǎn)錄圖譜[5]、加深對(duì)病原微生物活動(dòng)過(guò)程的認(rèn)知[6]提供了重要的研究途徑和方法，同樣也推動(dòng)了對(duì)主動(dòng)脈疾病發(fā)生發(fā)展機(jī)制更為全面而深刻的理解。

1 單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)技術(shù)概述

普通轉(zhuǎn)錄組(Bulk RNA)是生物組織樣品在某個(gè)時(shí)間對(duì)應(yīng)的所有mRNA轉(zhuǎn)錄情況，是樣品或組織中所有細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組表達(dá)量的平均值，即是這些細(xì)胞“整體”的表征。然而，由于細(xì)胞異質(zhì)性，相同表型細(xì)胞的遺傳信息也可能存在顯著差異，很多低豐度的信息會(huì)在“整體”表征中丟失，并不能反映樣品中所有細(xì)胞或者某一群細(xì)胞的狀態(tài)，因此需要對(duì)單個(gè)細(xì)胞的或者某一群細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)進(jìn)行深入的研究。 單細(xì)胞RNA測(cè)序(single-cell RNA sequencing,scRNA-seq)技術(shù)的出現(xiàn)解決了這一問(wèn)題，通過(guò)細(xì)胞懸液制備、mRNA反轉(zhuǎn)錄、文庫(kù)構(gòu)建和高通量測(cè)序4個(gè)步驟，以高分辨率和準(zhǔn)確性分析給定樣本中的每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組，識(shí)別新的細(xì)胞狀態(tài)和群體，來(lái)尋找同類(lèi)細(xì)胞間的表型和功能差異。

目前常用的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組平臺(tái)有10xGenomics、BD Rhapsody、Fluidigm C1、Bio-Rad等，其中10xGenomics是目前最為常用的單細(xì)胞捕獲平臺(tái)，不僅能夠一次性分離并標(biāo)記500～10 000個(gè)單細(xì)胞，并在單細(xì)胞水平進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)新的細(xì)胞類(lèi)型，還能基于大量的單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)，提供細(xì)胞表達(dá)特征聚類(lèi)、標(biāo)志物篩選、亞群表達(dá)特征分析等，是一種高效的單細(xì)胞基因表達(dá)水平檢測(cè)技術(shù)[7]。

單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)技術(shù)在心血管研究中的應(yīng)用已較為廣泛，除了識(shí)別罕見(jiàn)的細(xì)胞亞群外，還可以基于每個(gè)細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行細(xì)胞軌跡分析，這在闡明祖細(xì)胞或干細(xì)胞分化過(guò)程中的細(xì)胞狀態(tài)轉(zhuǎn)變方面有重要作用。此外，scRNA-seq能夠描繪小鼠和人的重要組織的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳圖譜，包括心臟和冠狀動(dòng)脈組織，利用這些數(shù)據(jù)集，可以評(píng)估常見(jiàn)心血管細(xì)胞類(lèi)型的器官特異性或組織特異性，例如內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)和成纖維細(xì)胞等。

2 單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)在主動(dòng)脈疾病中的研究進(jìn)展

主動(dòng)脈的管壁由細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)組成，在生理情況下，這些組分能提供合適的管壁順應(yīng)性和彈性強(qiáng)度，以適應(yīng)血流動(dòng)力學(xué)等外部環(huán)境的改變。然而，在疾病狀態(tài)下，各組分的失衡會(huì)導(dǎo)致動(dòng)脈壁擴(kuò)張、彈性減弱，從而引起主動(dòng)脈瘤、夾層或破裂。

2.1 內(nèi)皮細(xì)胞

血管內(nèi)皮細(xì)胞完整的結(jié)構(gòu)和功能可防止膠原纖維的降解以及彈性纖維和血管平滑肌細(xì)胞的破壞，對(duì)預(yù)防主動(dòng)脈擴(kuò)張有重要作用[8]。不同器官和組織的內(nèi)皮細(xì)胞存在異質(zhì)性，可能包含多種內(nèi)皮細(xì)胞亞群，但異質(zhì)性?xún)?nèi)皮細(xì)胞的種類(lèi)和分子特征尚未闡明，并且血管再生或周轉(zhuǎn)的復(fù)雜性使得人們需要更好地了解內(nèi)皮細(xì)胞亞群之間的相互作用，并確定控制這些過(guò)程的特定基因。單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)技術(shù)鑒別出3種內(nèi)皮細(xì)胞亞群，證明了過(guò)渡過(guò)程中基因表達(dá)的顯著變化，并驗(yàn)證了主動(dòng)脈內(nèi)皮的異質(zhì)性以及先前提出的祖細(xì)胞與分化細(xì)胞之間的層次關(guān)系[9]。單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)還識(shí)別出內(nèi)皮細(xì)胞中動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)的全套轉(zhuǎn)錄圖譜，同樣區(qū)分出小鼠主動(dòng)脈中3種不同內(nèi)皮細(xì)胞亞群，并發(fā)現(xiàn)不同亞群在細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生、脂質(zhì)處理和血管生成或淋巴功能方面的功能專(zhuān)門(mén)化[10]。

2.2 平滑肌細(xì)胞

血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)是主動(dòng)脈中膜內(nèi)的主要細(xì)胞成分，在維持主動(dòng)脈收縮功能和穩(wěn)態(tài)中具有重要作用。VSMCs具有調(diào)節(jié)自身表型的特性，目前有大量研究聚焦于VSMCs表型轉(zhuǎn)化的潛在分子機(jī)制。利用scRNA-seq技術(shù)分析彈性蛋白酶誘導(dǎo)的小鼠AAA樣本，鑒定出4種SMC亞群，并發(fā)現(xiàn)在AAA進(jìn)展過(guò)程中，3個(gè)主要的SMC亞群的比例減少，而占比較少的SMC亞群增加，并伴有SMC收縮標(biāo)志物的下調(diào)和促炎基因的上調(diào)，該實(shí)驗(yàn)首次確定了AAA的主要血管細(xì)胞與動(dòng)脈瘤相關(guān)的轉(zhuǎn)錄信號(hào)，這對(duì)于理解異質(zhì)細(xì)胞在AAA中的作用具有重要意義[11]。利用scRNA-seq技術(shù)還發(fā)現(xiàn)了人升主動(dòng)脈壁平滑肌細(xì)胞群體的異質(zhì)性，鑒定出5種SMC相關(guān)亞群，包括收縮平滑肌細(xì)胞、應(yīng)激平滑肌細(xì)胞，纖維肌細(xì)胞和兩種增殖平滑肌細(xì)胞[12]，兩實(shí)驗(yàn)鑒定出不同種類(lèi)的平滑肌細(xì)胞，可能是上述兩種模型在病理生理方面的內(nèi)在差異的結(jié)果，其次可能與采用不同的數(shù)據(jù)分析和可視化的方法有關(guān)。以往小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)TGF-β 和Klf4是平滑肌細(xì)胞調(diào)制的潛在驅(qū)動(dòng)因素，對(duì)馬凡綜合征(Marfan syndrome,MFS)患者主動(dòng)脈根部標(biāo)本進(jìn)行scRNAseq，證實(shí)了人類(lèi)具有類(lèi)似的SMC表型調(diào)節(jié)模式，這是首次報(bào)道的來(lái)自人類(lèi)MFS患者主動(dòng)脈瘤組織的scRNA-seq數(shù)據(jù)[13]，未來(lái)需要更多的人類(lèi)MFS樣本和非動(dòng)脈瘤對(duì)照來(lái)確定主動(dòng)脈瘤中最一致的調(diào)控基因。

2.3 免疫細(xì)胞

以往的研究證實(shí)，正常主動(dòng)脈向病變狀態(tài)轉(zhuǎn)變的組織學(xué)環(huán)境以T、B淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞(Mφs)和肥大細(xì)胞等單核細(xì)胞浸潤(rùn)為特征，其中一種最突出、最主要的細(xì)胞是巨噬細(xì)胞[14]。

最新研究發(fā)現(xiàn)了3種主要巨噬細(xì)胞亞群，包括駐留型巨噬細(xì)胞群(resident-like macrophages，RES-like macrophages)、 高表達(dá)IL-1b的炎性巨噬群和新發(fā)現(xiàn)的高表達(dá)髓系觸發(fā)受體2(Trem2)的巨噬細(xì)胞群(triggered receptor expressed on myeloid cells 2,TREM2hi)。主動(dòng)脈TREM2hi是首次發(fā)現(xiàn)的一種巨噬細(xì)胞亞群，其不僅在脂質(zhì)處理和分解代謝過(guò)程中具有高度專(zhuān)門(mén)化的功能特征，而且參與破骨細(xì)胞的形成和破骨細(xì)胞功能執(zhí)行過(guò)程，預(yù)示著該細(xì)胞群可能在動(dòng)脈粥樣硬化鈣化過(guò)程中起著特殊的作用[15]。

動(dòng)脈粥樣硬化是在高脂血癥的背景下發(fā)展起來(lái)的一種慢性炎性反應(yīng)，先前已經(jīng)證明積極降脂可以促進(jìn)斑塊的消退，且以巨噬細(xì)胞減少為特征。炎性反應(yīng)過(guò)程的動(dòng)態(tài)本質(zhì)和Ly6chi單核細(xì)胞在斑塊中的作用有關(guān)，這些細(xì)胞以前只被認(rèn)為對(duì)斑塊和炎性反應(yīng)進(jìn)展起作用，但現(xiàn)在卻顯示出抑制炎性反應(yīng)的相反作用，未來(lái)可能是促進(jìn)斑塊消退的一種潛在方法[16]。

研究表明泡沫巨噬細(xì)胞比內(nèi)膜非泡沫巨噬細(xì)胞表達(dá)更少的炎性反應(yīng)相關(guān)基因，而高表達(dá)與脂質(zhì)代謝和運(yùn)輸途徑相關(guān)的基因，包括膽固醇代謝和PPAR信號(hào)通路基因。相反，內(nèi)膜非泡沫巨噬細(xì)胞富含參與炎性反應(yīng)過(guò)程的基因，包括細(xì)胞因子-細(xì)胞因子相互作用受體、NF-κB、IL-17、TLR和TNF-α[17]。

利用scRNA-seq技術(shù)發(fā)現(xiàn)AAA中含有血源性單核細(xì)胞亞群(Mo/MU-2)、單核細(xì)胞來(lái)源的修復(fù)性巨噬細(xì)胞亞群(Mo/MU-3)、單核細(xì)胞源性炎性巨噬細(xì)胞(Mo/MU-4)和2種不同的主動(dòng)脈駐留巨噬細(xì)胞(AR-Mac)亞群(Mo/MU-1和Mo/MU-5)，這5種亞群表現(xiàn)出促炎基因和抗炎基因的雙重表達(dá)[18]。通過(guò)對(duì)11例研究對(duì)象的升主動(dòng)脈組織進(jìn)行了scRNA-seq分析之后也分辨出5種巨噬細(xì)胞亞群，即M1-like1、M1-like2、M1-like3、M2-like1和M2-like2，因此，來(lái)自體外研究的傳統(tǒng)M1和M2二分法在闡述體內(nèi)活化巨噬細(xì)胞動(dòng)態(tài)程序的分子基礎(chǔ)方面是不夠的[12]。

流式細(xì)胞測(cè)量術(shù)不能完全闡明實(shí)際細(xì)胞亞群的復(fù)雜性，盡管特殊的白細(xì)胞亞群表達(dá)相同的主要譜系標(biāo)記，但其在功能上可能是不同的。有研究應(yīng)用scRNA-seq和質(zhì)譜流式細(xì)胞測(cè)量技術(shù)(mass cytometry)，檢測(cè)到3個(gè)主要的B細(xì)胞亞群，闡釋了不同亞群在疾病中存在差異調(diào)節(jié)，并發(fā)現(xiàn)了預(yù)測(cè)人類(lèi)的心血管事件可能性[19]。

T淋巴細(xì)胞是升主動(dòng)脈組織中發(fā)現(xiàn)的最大細(xì)胞群，活化的CD4 T淋巴細(xì)胞(CD4-Active)、靜息CD4 T、調(diào)節(jié)性CD4 T淋巴細(xì)胞(CD4-Treg)表達(dá)不同的標(biāo)記基因。研究發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈粥樣硬化促進(jìn)Treg細(xì)胞的可塑性，造成功能失調(diào)的干擾素IFNγ+Th1/Tregs的積聚，從而可能導(dǎo)致進(jìn)一步的動(dòng)脈炎性反應(yīng)和動(dòng)脈粥樣硬化[20]。

2.4 細(xì)胞外基質(zhì)

血管壁細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)是主動(dòng)脈壁內(nèi)的主要非細(xì)胞成分，在維持主動(dòng)脈壁的結(jié)構(gòu)、彈性和應(yīng)力中具有重要作用。血管細(xì)胞外基質(zhì)由膠原、彈性蛋白和其他細(xì)胞外基質(zhì)成分組成，如糖蛋白、無(wú)定形或可溶性蛋白多糖、生長(zhǎng)因子和隔離在基質(zhì)中的蛋白酶。細(xì)胞外基質(zhì)的組分隨血管壁膜(內(nèi)膜、中膜和外膜)以及整個(gè)血管樹(shù)的不同而存在差異[21]。在正常血管組織中，蛋白多糖的豐度很低，但在胸主動(dòng)脈瘤和主動(dòng)脈夾層組織的退行性主動(dòng)脈中經(jīng)常檢測(cè)到蛋白多糖的異常積聚[22]。有研究報(bào)告：通過(guò)病變主動(dòng)脈的scRNA-seq，確定netrin-1是AAA中介導(dǎo)炎性反應(yīng)和慢性細(xì)胞外基質(zhì)侵蝕之間的主要信號(hào)，巨噬細(xì)胞中netrin-1的靶向缺失可以保護(hù)小鼠免受AAA的侵襲[23]。

2.5 分子調(diào)控及信號(hào)通路

在AAA的形成與進(jìn)展中，存在多種細(xì)胞因子的調(diào)控機(jī)制及信號(hào)通路。先前的研究表明AKT/mTOR信號(hào)通路在內(nèi)皮細(xì)胞分化血管生成以及調(diào)節(jié)細(xì)胞新陳代謝中起關(guān)鍵作用[24]。血管干細(xì)胞/祖細(xì)胞在細(xì)胞分化過(guò)程中經(jīng)歷代謝重編程，AKT/mTOR依賴(lài)的糖酵解是內(nèi)皮基因表達(dá)的關(guān)鍵，這些發(fā)現(xiàn)證明了c-Kit系細(xì)胞在主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞更新和替換中的關(guān)鍵作用，并可能為血管疾病的治療策略提供見(jiàn)解[25]。

Lck/yes新型酪氨酸激酶(Lck/yes novel tyrosine kinase,LYN)是酪氨酸激酶Src家族(Src family of tyrosine kinases,SFK) 的成員，除T細(xì)胞和一些天然淋巴樣細(xì)胞外，在整個(gè)造血系統(tǒng)以及非造血細(xì)胞中均有表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)Lyn在調(diào)節(jié)特定的單核細(xì)胞亞群穩(wěn)態(tài)中的作用，證實(shí)LYN是控制單核細(xì)胞數(shù)量和壽命的信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，也是炎性疾病的潛在治療靶點(diǎn)[26]。

3 問(wèn)題與展望

單細(xì)胞RNA測(cè)序(scRNA-seq)技術(shù)對(duì)細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展起到了積極的推動(dòng)作用，該技術(shù)鑒定了主動(dòng)脈壁的細(xì)胞亞群、揭示罕見(jiàn)細(xì)胞類(lèi)型、全面描述細(xì)胞表型和基因型，為主動(dòng)脈疾病的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了更深入的理解。但目前研究多為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，人體標(biāo)本較難獲取，且本身還存在對(duì)細(xì)胞存活率要求高、測(cè)序成本昂貴、缺少?gòu)?qiáng)大可靠的數(shù)據(jù)分析工具等限制，期待該技術(shù)未來(lái)能不斷成熟和完善，提升血管外科醫(yī)生對(duì)主動(dòng)脈疾病等血管外科疾病的認(rèn)識(shí)，從而實(shí)現(xiàn)該領(lǐng)域的精準(zhǔn)治療。