張立存 趙繼榮 徐兵 陳祁青 趙寧 馬同 張?zhí)忑?蔡毅 李瑋農(nóng) 楊濤

(1甘肅中醫(yī)藥大學，甘肅 蘭州 700030 ；2甘肅省中醫(yī)院)

伴隨老齡化人口的不斷增加，人們生活質(zhì)量的不斷提升，一些退變性疾患如脊柱、骨關(guān)節(jié)退變的防治成為臨床骨科研究的熱點〔1〕。椎間盤退行性變(IDD)是多種因素綜合影響的結(jié)果，其發(fā)病機制極其復雜，現(xiàn)有相關(guān)研究認為椎間盤組織脫水、細胞外基質(zhì)降解、蛋白多糖含量下降、膠原類型轉(zhuǎn)變及纖維環(huán)外層破裂等為IDD發(fā)生發(fā)展的主要原因〔2〕。臨床上IDD是造成頸肩腰腿痛主要因素之一，有研究指出全球約80%的人一生經(jīng)受腰腿痛折磨，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，給家庭和社會造成了極大的負擔〔3，4〕。早期觀點認為IDD是由于隨著年齡增大椎間盤衰老引發(fā)，然而近年來IDD的發(fā)病多呈現(xiàn)年輕化的趨勢〔5〕。因此，明確IDD的發(fā)病機制并尋求科學有效的治療手段是當前的主要研究方向?；诨蚨鄳B(tài)性研究基礎(chǔ)發(fā)現(xiàn)，大量IDD的椎間盤組織中存在著眾多基因的表達異?！?〕。因此，IDD的發(fā)生發(fā)展可能與多種基因異常表達關(guān)系密切，且IDD的發(fā)生發(fā)展可能通過基因表達異常而誘導椎間盤細胞內(nèi)信號通路和靶點發(fā)生特異性改變。中醫(yī)藥可直接或間接參與IDD的部分相關(guān)基因水平表達，抑制或激活相關(guān)基因表達從而達到延緩或加速IDD的發(fā)生發(fā)展。故從相關(guān)基因表達入手研究IDD的發(fā)病機制并利用中醫(yī)藥進行早期干預。

1 退變纖維環(huán)差異基因表達相關(guān)研究

纖維環(huán)是構(gòu)成椎間盤的重要結(jié)構(gòu)之一，在維持脊柱生物力學穩(wěn)定、負重等方面具有重要作用。Gruber等〔7〕利用激光捕獲顯微切割術(shù)對椎間盤突出癥受試患者纖維環(huán)細胞進行了獲取并對相關(guān)基因表達做了研究，結(jié)果顯示有47個差異性表達基因，與正常組相比，有 13個上調(diào)基因，19個下調(diào)基因，變性過程中受到顯著調(diào)節(jié)的基因包括細胞衰老、缺氧等相關(guān)基因。其中生長停滯特異(GAS)1基因和賴氨酰氧化酶樣(LOXL)2基因兩種基因的表達上調(diào)最顯著。GAS-1是一種主要參與細胞融合和生長抑制過程的多效性膜蛋白，能夠誘導細胞增殖、停滯和凋亡，在年齡較大的小鼠骨骼肌干細胞中呈現(xiàn)高表達〔8，9〕。LOXL2是賴氨酰氧化酶(LOX)基因家族的成員，是一種能夠通過催化肽基賴氨酸氧化為氨基己二酸半醛來啟動膠原蛋白和彈性蛋白交聯(lián)反應的細胞外銅依賴性酶，在衰老退化的鼠膽管上皮細胞中呈現(xiàn)高表達〔10，11〕。由此表明GAS1和LOXL2可能是椎間盤纖維環(huán)細胞退變的特異表達基因。Kazezian等〔12〕分析人體退化纖維環(huán)細胞，發(fā)現(xiàn)238個差異表達基因中有17種表達顯著，其中10個上調(diào)基因，7個下調(diào)基因，差異表達基因涉及細胞增殖和炎癥應答相關(guān)基因，四肽重復蛋白(IFIT)3和胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白(IGFBP)3是明顯上調(diào)的兩種基因。 IGFBP3和IFIT3可以促進細胞凋亡和抑制細胞增殖，參與炎性細胞因子干擾素α信號傳導途徑從而使得纖維環(huán)發(fā)生退化〔13〕。葉冬平等〔14〕通過逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)技術(shù)檢測人正常和退變纖維環(huán)細胞相關(guān)基因表達，結(jié)果顯示退變纖維環(huán)細胞中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β、白細胞介素(IL)-1、血小板源性生長因子(PDGF)和IGF-1mRNA表達量降低，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-14和膠原Ⅰ型(COL1)A1 mRNA表達升量高，表皮生長因子(EGF)mRNA在正常纖維環(huán)細胞表達陰性，而在退變纖維環(huán)細胞中有表達。上述研究表明纖維環(huán)退變涉及多種基因的參與，因此針對纖維環(huán)退變相關(guān)性基因逐個擊破，有的放矢，才能從根本上防止纖維環(huán)退變。

2 退變髓核差異基因表達相關(guān)研究

髓核組織處于椎間盤的中心位置，其細胞變性及活性下降是IDD發(fā)生的主要原因，髓核組織的退變往往是IDD的開端〔15〕。在相關(guān)動物模型試驗研究中，Hideki等〔16〕通過建立大鼠髓核細胞饑餓模型，檢測發(fā)現(xiàn)差異表達的基因高達2 922個，其中表達顯著的有影響細胞周期進程的生長阻滯和DNA損傷基因(Gadd)45和Tp53相關(guān)基因，p27Kip1，p21Cip1蛋白表達也有所上調(diào)。p27Kip1和p21Cip1屬于細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(CKIs)家族成員，主要在養(yǎng)分受限的細胞中高表達，其上調(diào)可以妨礙細胞周期，使細胞DNA更容易受到損傷〔17〕。Minogue等〔18〕通過定量實時聚合酶鏈反應(qRT-PCR)在分離的牛髓核細胞上發(fā)現(xiàn)了許多差異表達基因單元并和正常人髓核細胞及退化的髓核細胞進行比較，發(fā)現(xiàn)11個基因〔突觸小體相關(guān)蛋白25 kD(SNAP-25)、細胞角蛋白(KRT)8、 KRT18、 KRT19、鈣黏著蛋白(CDH)-2、骨涎蛋白(IBSP)、多功能蛋白聚糖基因(VCAN)、腱調(diào)蛋白 (TNMD)、腦富含膜附著信號蛋白(BASP)1、叉頭框F1基因(FOXF1)、腓骨蛋白(FBLN)1〕在人正常髓核細胞中也存在差異表達，但不顯著，4個基因(SNAP25，KRT8，KRT18和CDH2)的表達在人退變髓核細胞顯著下調(diào)。盡管該實驗存在種間差異，但是這種基因表達特征將有益于組織工程研究。Shao等〔19〕使用qRT-PCR技術(shù)檢測鈣化髓核的差異表達基因，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)了132個差異表達基因，其中上調(diào)基因129個，下調(diào)基因3個。顯著上調(diào)基因中前6個為硬化蛋白(SOST)，多聚IgA和IgM的連接鏈，防御素α4(DEFA4)，人分泌型卷曲蛋白(SFRP)4，蛋白酶(PRTN)3和組織蛋白酶(CTS)G，其中SOST和SFRP4的上調(diào)與Wnt信號通路的抑制相關(guān)。該研究證明了椎間盤鈣化可能與Wnt通路異常和炎癥相關(guān)因子高表達相關(guān)。Leung等〔20〕通過研究BMP在人體髓核細胞中的作用并比較BMP-7與BMP-2對髓核細胞表型和功能活性的影響，發(fā)現(xiàn)在退化的髓核細胞中BMP表達比非退化細胞中整體弱，相比于BMP-2、BMP-7可以誘發(fā)絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和環(huán)磷腺苷效應元件結(jié)合蛋白(CREB)1使得退變髓核細胞中高表達的EP300基因發(fā)生變化，另外還可以抑制纖維化基因的表達進而延緩髓核退變。這一發(fā)現(xiàn)表明BMP在分子層面防治IDD意義重大。Wan等〔21〕采用基因芯片分析技術(shù)研究人髓核中長鏈非編碼RNA(lncRNA)的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)116個差異表達lncRNA，其中上調(diào)67個，下調(diào)49個，該研究還發(fā)現(xiàn)參與細胞凋亡調(diào)控的Fas相關(guān)蛋白因子(FAF)1在退變的髓核組織中高表達。

3 退變軟骨終板差異基因表達相關(guān)研究

椎間盤作為人體最大無血管組織，其營養(yǎng)來源主要依靠上下軟骨終板擴散相鄰椎骨血管內(nèi)物質(zhì)，有研究發(fā)現(xiàn)封閉終板營養(yǎng)途徑會導致IDD的發(fā)生〔22〕。因此軟骨終板的退變會使椎間盤唯一的營養(yǎng)通道被阻斷同時代謝物質(zhì)在椎間盤內(nèi)積聚從而加速IDD的發(fā)生發(fā)展。低氧狀態(tài)是造成軟骨終板退變的重要因素，Yao等〔23〕在生理缺氧的微環(huán)境中培養(yǎng)并分析了人體軟骨終板間充質(zhì)干細胞，發(fā)現(xiàn)448個差異表達基因，其中上調(diào)330個，下調(diào)118個，與正常氧組相比，低氧組IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)3和補體因子(CF)D顯著上調(diào)。相反，3個基因(轉(zhuǎn)鐵蛋白受體，磷酸甘油酸突變酶2和鈣蛋白酶6)的表達顯著低于正常氧組。表明缺氧狀態(tài)炎癥相關(guān)因子基因高表達是軟骨終板退變的主要原因。Xiao等〔24〕在人體退變的軟骨終板細胞中發(fā)現(xiàn)環(huán)狀RNA-0058097(circRNA-0058097)高表達，進一步研究其機制得出 circRNA-0058097是一種對機械張力敏感的非編碼RNA，其可以靶向miR365a5p來上調(diào)組蛋白脫乙?；?HDAC)4基因表達，從而促進終板軟骨細胞變性。HDAC4是組蛋白脫乙?；讣易宓某蓡T，它可以通過調(diào)節(jié)核小體的結(jié)構(gòu)和抑制轉(zhuǎn)錄因子的活性來控制細胞增殖和分化，是軟骨細胞分化和變性的重要調(diào)節(jié)劑〔25〕。這項研究表明circRNA-0058097-miR365a5p-HDAC4調(diào)節(jié)途徑在機械張力誘導的終板軟骨細胞變性中起重要作用。Zhang等〔26〕證實了變性軟骨終板中細胞數(shù)量和蛋白聚糖減少，退變軟骨終板中基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-3、MMP-9、TIMP-3、IL-1α和IL-1β的mRNA表達顯著升高。軟骨終板的主要成分是Ⅱ型膠原和蛋白聚糖，有研究表明MMP的過表達會促使軟骨終板中Ⅱ型膠原和蛋白聚糖的降解，IL-1又可以刺激MMP表達〔27〕。由此可以認為MMP-3、MMP-9、TIMP-3、IL-1α和IL-1β可能在軟骨終板變性過程中發(fā)揮作用。此外，Marfia 等〔28〕發(fā)現(xiàn)在退變軟骨終板細胞中骨橋蛋白(OPN)的基因表達顯著增加(超過400倍)。OPN涉及骨基質(zhì)鈣化和細胞外基質(zhì)破壞，該研究證明了OPN的異常表達在IDD的病理生理過程中起關(guān)鍵作用。以上相關(guān)研究的結(jié)論及成果對明確軟骨終板退變差異表達基因意義重大，對揭示IDD的機制同樣具有重要的作用。

4 中醫(yī)藥干預對IDD相關(guān)基因表達的影響研究

整體審查和辨證論治是中醫(yī)藥治療退變性疾患最根本特征。中醫(yī)學認為IDD的發(fā)病主要以肝腎虧虛為內(nèi)因，風寒濕痹為外因，氣滯血瘀為病理基礎(chǔ)，故治療指導思想以補益肝腎、祛風除濕、行氣活血為主〔29〕。Trinh等〔30〕認為中醫(yī)藥治療IDD疾患療效確切。中醫(yī)藥治療IDD疾患相關(guān)分子研究已取得了一定成就。

4.1中藥藥物對IDD相關(guān)基因表達的影響 防治IDD的中藥及復方大都以補肝腎，強筋骨類為主。董晤訊〔31〕研究發(fā)現(xiàn)，淫羊藿苷可以明顯降低髓核細胞中炎性因子IL-1β、IL-6的表達，同時上調(diào)細胞外基質(zhì)Aggrecan和Ⅱ型膠原蛋白(CoL-Ⅱ)表達水平從而減輕IDD。杜仲為骨傷科常用藥，常用于脊柱疾患的治療。Yang等〔32〕研究發(fā)現(xiàn)杜仲可以改善人體椎間盤髓核細胞中IL-1和腫瘤壞死因子(TNF)誘導的細胞外基質(zhì)降解。進一步研究其作用機制后發(fā)現(xiàn)杜仲通過調(diào)節(jié)miR140-CREB1軸改變MMP-3，血小板反應蛋白解整合素金屬肽酶(ADAMTS)5和CoL-Ⅱ的表達，IL-1和TNF刺激可抑制miR140的表達，而杜仲可激活miR140的表達同時抑制IL-1和TNF等炎性因子相關(guān)基因的表達，miR140的高表達使得MMP-3和ADAMTS5蛋白表達下調(diào)同時增加CoL-Ⅱ含量來保護髓核細胞。Zhou等〔33〕發(fā)現(xiàn)烏頭有效成分Karacoline可通過抑制NF-κB途徑降低IDD中MMP-14的表達，同時增加CoL-Ⅱ和蛋白聚糖的表達。何堅等〔34〕發(fā)現(xiàn)葛根素可以上調(diào)IL-1β誘導的椎間盤纖維環(huán)細胞中抗凋亡因子B細胞淋巴瘤(Bcl)-2，下調(diào)促凋亡因子半胱氨酸蛋白酶(caspase)-3蛋白的表達來抑制纖維環(huán)細胞的凋亡。川芎嗪可通過降低終板軟骨細胞中CoL-Ⅰ，堿性磷酸酶(ALP)，Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子(Runx)2和TGF-β1 mRNA的表達來減輕軟骨終板退變〔35〕。除了單味中藥，中藥復方對IDD療效亦佳，Zhu等〔36〕發(fā)現(xiàn)補腎活血方可以通過Wnt/β-catenin通路上調(diào)miR-483-3p和GSK3B的表達，抑制miR-23c和CTNNB1表達，從而調(diào)節(jié)退變椎間盤中髓核細胞增殖、細胞外基質(zhì)重塑和調(diào)控終板軟骨細胞來延緩IDD。另外，白榮飛〔37〕的研究表明補腎壯督方可上調(diào)Bcl-2的表達，下調(diào)caspase-3的表達，從而延緩IDD。六味地黃丸治療IDD的相關(guān)分子研究中表明其能上調(diào)IDD模型中糖胺多糖含量、透明質(zhì)酸含量、硫酸軟骨素/硫酸角質(zhì)素比例，增加IDD模型中CoL-Ⅱ mRNA的表達，降低CoL-Ⅰ mRNA的表達，從而在一定程度上減緩IDD〔38〕。

4.2中醫(yī)非藥物療法對IDD相關(guān)基因表達的影響 除中草藥外，針灸、推拿按摩、針刀等均是中醫(yī)治療疾病的特色手段。楊宗保等〔39〕研究發(fā)現(xiàn)通過電針I(yè)DD模型兔環(huán)跳穴可降低其髓核細胞中炎性因子前列腺素(PG)E2、磷脂酶(PL)A2和IL-1α的表達。林元杰〔40〕通過針刺IDD大鼠模型腎俞、大腸俞、環(huán)跳、陽陵泉發(fā)現(xiàn)其可通過脊髓Janus激酶(JAK)2-信號傳導及轉(zhuǎn)錄激活因子(STAT)3信號通路下調(diào)p-JAK2、p-STAT3蛋白含量的表達來延緩IDD。佟思琪等〔41〕探討電針夾脊穴對IDD兔模型椎間盤組織中終板軟骨細胞水通道蛋白(AQP)1和3基因表達的影響發(fā)現(xiàn)其通過上調(diào)蛋白激酶(PK)A-環(huán)磷腺苷反應元件結(jié)合蛋白(CREB)通路的表達水平，繼而增加AQP1、3 mRNA的轉(zhuǎn)錄，促進椎間盤 AQP1、3 蛋白的表達來延緩IDD。王偉軍〔42〕通過手法按摩與MMPs抑制劑治療IDD進行了比對研究，結(jié)果表明中醫(yī)手法在抑制IDD相關(guān)基因Col-1a、MMP-3表達，增加椎間盤保護性基因Col-2a、TIMP-1的表達與MMPs抑制劑四環(huán)素作用相當，而中醫(yī)手法按摩在上調(diào)穩(wěn)定細胞外基質(zhì)延緩IDD相關(guān)基因Aggrecan、轉(zhuǎn)化生長因了(TGF)-β1、VDR的表達量較四環(huán)素更明顯。可見中醫(yī)按摩手法對調(diào)節(jié)IDD相關(guān)基因的表達延緩IDD的治療效果比四環(huán)素更顯著。此外，有研究表明痛點揉撥推拿手法可使IDD患者的IL-1β表達水平顯著降低達到抑制炎癥反應的作用〔43〕。Sun等〔44〕研究結(jié)果表明針刀治療通過調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)的膠原蛋白含量，增加CoL-Ⅰ的產(chǎn)生和減少CoL-Ⅱ生成，同時改進椎間盤超微結(jié)構(gòu)來抑制IDD。

綜上，中醫(yī)藥防治脊柱退變性疾患經(jīng)過上千年的傳承與發(fā)展，在認識和治療脊柱退變性疾患方面有著豐富的理論基礎(chǔ)和實踐經(jīng)驗，隨著中醫(yī)藥基礎(chǔ)研究、基因蛋白組學、基因芯片等現(xiàn)代科技的蓬勃發(fā)展，對IDD的發(fā)病機制研究從生物分子學、基因表達水平相關(guān)方面創(chuàng)造了新的研究平臺，也為中醫(yī)藥精準靶向防治IDD的研究提供了理論依據(jù)，支撐中醫(yī)藥防治IDD相關(guān)疾病不斷取得突破，造福廣大患者。但中醫(yī)藥治療IDD疾患的分子生物學研究大都局限于基礎(chǔ)實驗研究，具體試驗方法設(shè)計或多或少存在缺陷、調(diào)控過程和級聯(lián)方式仍未具體有效闡明、相關(guān)信號通路研究不夠深入。目前仍需要大樣本，多中心的隨機對照實驗提供更科學、更準確、更客觀的依據(jù)進行佐證。因此，借助現(xiàn)代科學技術(shù)深入研究中醫(yī)藥靶向治療IDD及相關(guān)疾患的相關(guān)研究將是今后努力方向之一。