李洲強 白媛媛 魯世金 馬 潔 朱其鳳 張雅靖 侯恩存 吳發(fā)勝

(1 柳州市中醫(yī)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，廣西柳州市 545001； 2 廣西中醫(yī)藥大學研究生院，南寧市 530001；廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院 3 中西醫(yī)結(jié)合轉(zhuǎn)化醫(yī)學中心，4 腫瘤科，南寧市 530011)

蟾酥是我國名貴中藥，具有解毒消腫、開竅醒神、止痛的功效，較早就被應用于惡性腫瘤的治療中，《本草綱目》中記載蟾酥可“治發(fā)背疔瘡,一切惡腫”[1]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，蟾酥具有良好的抗惡性腫瘤作用,可抑制惡性腫瘤細胞增殖、誘導惡性腫瘤細胞凋亡和分化。蟾酥的化學成分主要有蟾蜍二烯羥酸內(nèi)酯類、蟾毒色胺類及甾醇類化合物等。近年來，越來越多的研究證實蟾酥中抗惡性腫瘤的主要活性成分是蟾蜍二烯內(nèi)酯類化合物，后者可被分離出百余種蟾蜍二烯內(nèi)酯,其中最主要的是7種蟾毒配基類化合物，分別是蟾毒靈、蟾毒它靈、華蟾酥毒基、遠華蟾蜍精、華蟾毒它靈、日蟾蜍他靈和酯蟾毒配基[2-4]。這7種蟾毒配基類化合物的含量占蟾蜍二烯內(nèi)酯總量的85%以上,并且這些成分具有高活性和高毒性的特點，故認為是蟾酥中最主要的抗惡性腫瘤成分[5]。然而，蟾酥抗惡性腫瘤作用的藥效物質(zhì)及其作用途徑尚不清楚。目前，利用網(wǎng)絡藥理學探索藥物作用機制的研究方法已成熟。故本文采用網(wǎng)絡藥理學方法及分子對接技術(shù)，探討蟾酥中抗惡性腫瘤的主要蟾毒配基類化合物及其作用機制，為臨床應用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物-成分-靶點的篩選

1.1.1 蟾酥抗惡性腫瘤主要活性成分的獲?。嚎紤]到從蟾酥中分離出的單體結(jié)構(gòu)的龐雜性及藥理作用的復雜性，我們先通過檢索PubMed、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)知識服務平臺、百度學術(shù)、谷歌學術(shù)等常用文獻數(shù)據(jù)庫，對既往蟾酥抗惡性腫瘤的研究進行回顧分析，搜集蟾酥抗惡性腫瘤的主要活性成分，將這些成分英文名分別導入PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)，得到成分的分子式、標準化學式、CAS號等信息。

1.1.2 蟾酥抗惡性腫瘤主要活性成分的相關(guān)靶點及基因名的規(guī)范：利用SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)得到主要活性成分的相關(guān)蛋白靶點，然后在UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)選定物種為人類，將篩選出的蛋白靶點轉(zhuǎn)換為標準基因名[6]，刪除無法轉(zhuǎn)化為標準基因名的靶點(表示其可能屬于其他物種)。

1.1.3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡的構(gòu)建：將上述篩選所得主要活性成分(去除沒有靶點的成分)及其靶點導入CytoScape 3.7.1軟件，構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖。

1.2 蟾酥抗惡性腫瘤關(guān)鍵靶點的篩選及靶點蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡的構(gòu)建

1.2.1 惡性腫瘤相關(guān)靶點的檢索：在GeneCards?數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)以“malignant tumor”為檢索詞獲得惡性腫瘤全部相關(guān)基因，時間設置為建庫至2021年3月，并通過相關(guān)性評分進行降序排列，選出前500位最為核心、相關(guān)性最強的基因。

1.2.2 交集靶點的獲?。簩盒阅[瘤全部靶點與蟾酥抗惡性腫瘤主要活性成分的相關(guān)靶點導入到VENNY 2.1網(wǎng)站(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)制作韋恩圖,獲得相互交集的靶點，即蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點。

1.2.3 蛋白-蛋白互相作用網(wǎng)絡的構(gòu)建與核心靶點的篩選：將上述蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org)，設置篩選條件時選擇物種為“Homo sapiens”，針對蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點進行蛋白-蛋白相互作用(protien-protein interaction,PPI)網(wǎng)絡分析。以“可信度高”為PPI網(wǎng)絡的建立標準，得到PPI網(wǎng)絡數(shù)據(jù)，將數(shù)據(jù)導入到CytoScape 3.7.1軟件構(gòu)建關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡圖，根據(jù)度值(Degree值)從大到小排序，篩選出蟾酥抗惡性腫瘤的核心靶點。

1.3 蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點的生物功能和通路富集分析 將蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點導入到DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncifcrf.gov/tools.jsp)，設定閾值P<0.01，進行基因本體論(Gene Ontology，GO)富集分析,包括生物過程、分子功能和細胞組分3個基因功能的注釋[7]。將3個基因功能的關(guān)鍵分析結(jié)果導入微生信在線作圖工具(http://www.bioinformatics.com.cn/)制作柱狀圖。將蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點導入DAVID數(shù)據(jù)庫進行京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析，設定閾值P<0.01，獲得關(guān)鍵信號通路數(shù)據(jù)并制作KEGG氣泡圖。

1.4 分子對接與可視化

1.4.1 分子對接：使用AutoDock 3.7軟件將上述獲得的10個核心靶點(受體)與7個存在靶點的主要活性成分(配體)進行半柔性分子對接。(1)通過PubChem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取活性成分的3D結(jié)構(gòu),全部保存為mol2格式。從RCSB PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(www.rcsb.org/)中下載核心靶點的X射線三維晶體結(jié)構(gòu)，用PyMOL 1.7軟件去除受體蛋白中的多余配體和溶劑得到純凈受體蛋白結(jié)構(gòu)。(2)利用AutoDock 3.7軟件為受體和配體加氫、計算電荷并賦予原子類型，再運用AutoDock 3.7軟件在Windows 10系統(tǒng)下逐個進行半柔性對接，得到結(jié)合能。

1.4.2 對接結(jié)果的可視化：將對接之后結(jié)合能最低的對接分子模型導入PyMOL 1.7軟件，進行分子模型可視化處理，以棍棒模型及表面口袋模型展示；并且標記出配體與受體的對接位點，測量出兩者氫鍵的距離。

2 結(jié) 果

2.1 蟾酥抗惡性腫瘤的主要活性成分及其靶點 納入蟾酥中最主要的抗惡性腫瘤成分，即7種蟾毒配基類化合物,分別是蟾毒靈、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、華蟾酥毒基、遠華蟾蜍精、日蟾蜍他靈和酯蟾毒配基；另外，根據(jù)文獻查閱結(jié)果，沙蟾毒精是一種具有良好抗惡性腫瘤作用的蟾蜍二烯內(nèi)酯化合物，可以抗惡性腫瘤血管生成、促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[8-11]，故將其列入。將上述8種活性成分導入PubChem數(shù)據(jù)庫得到標準分子化學式，見表1。通過SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫預測得到活性成分的蛋白靶點，其中蟾毒靈31個、蟾毒它靈19個、華蟾毒它靈117個、華蟾酥毒基113個、遠華蟾蜍精15個、日蟾蜍他靈0個、酯蟾毒配基28個和沙蟾毒精40個，去除重復后總共得到194個靶點，同時去除沒有靶點的成分——日蟾蜍他靈，在Uniprot數(shù)據(jù)庫將篩選出的蛋白靶點轉(zhuǎn)換為標準基因名，利用CytoScape構(gòu)建藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖(見圖1)。

表1 蟾酥抗惡性腫瘤的主要活性成分信息

圖1 藥物-成分-靶點圖注：粉色圓形代表蟾酥，與其用實線連接的深藍色六邊形分別是7個存在靶點的主要抗惡性腫瘤有效成分，淺藍色菱形為靶點，不同成分與其靶點用不同虛線連接。

2.2 蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點及其PPI網(wǎng)絡 共得到惡性腫瘤相關(guān)靶點12 632個，取相關(guān)性排名前500個靶點，將其與2.1中獲得的蟾酥主要活性成分相關(guān)靶點取交集，得到41個靶點，即蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點，見圖2。將上述關(guān)鍵靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫后得到41個節(jié)點和350條邊，在CytoScape軟件中作圖，得到PPI網(wǎng)絡圖(見圖3)。根據(jù)Degree值從大到小排序，位列前10的核心靶點分別是細胞周期蛋白(cyclin)D1、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)1、磷脂酰肌醇3-激酶催化亞基α(phosphoinositide-3-kinase catalytic subunit alpha,PIK3CA)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)1、表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、Janus激酶2(Janus kinase 2,JAK2)、 MDM2、雄激素受體(androgen receptor，AR)、MAPK8、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，MTOR)。

圖2 韋恩圖注：左邊藍色圓為最主要的500個惡性腫瘤相關(guān)靶點，右邊為194個主要活性成分相關(guān)靶點，中間為41個交集靶點。

圖3 蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點的PPI網(wǎng)絡注：圖中節(jié)點大小及顏色深淺隨Degree值大小變化，節(jié)點越大、顏色越深(藍-黃-紅)Degree值越大，關(guān)聯(lián)線段越粗顏色越深表示Combine score越大。

2.3 生物功能和信號通路分析

2.3.1 GO富集分析結(jié)果：蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點涉及的生物過程主要有蛋白質(zhì)自我磷酸化、酪氨酸肽基磷酸化、蛋白質(zhì)磷酸化等，富集的細胞組分主要有核質(zhì)、細胞質(zhì)基質(zhì)、細胞核等，涉及的分子功能主要有ATP結(jié)合、蛋白激酶活性、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性等。將上述3種GO分析結(jié)果排名前十(根據(jù)靶點參與數(shù)目)的生物進程進行條形圖展示，見圖4。

圖4 GO分析結(jié)果排名前十的生物進程注：圖中綠色區(qū)域為生物過程分析、橙色為細胞組分分析、藍色為分子功能分析；橫軸為生物進程名稱，縱軸為參與的靶點個數(shù)，不同顏色類別內(nèi)部從左到右對應的P值由小到大。

2.3.2 KEGG通路富集分析結(jié)果：共富集到88條信號通路，根據(jù)P值排序，篩選出前20條主要信號通路，包括癌癥信號通路、癌癥中心碳代謝、磷酸肌醇-3-激酶(phosphoinositide-3-kinase,PI3K)/AKT信號通路、Ras信號通路等，制作成氣泡圖，見圖5。

圖5 主要信號通路氣泡圖注：橫坐標為富集分數(shù)，縱坐標為信號通路名稱；圓點越大表示參與的靶點越多，顏色越深表示P值越小。

2.4 分子對接結(jié)果 使用AutoDock 3.7軟件進行逐個半柔性分子對接，記錄每個組合的最低結(jié)合能，繪制成熱圖(如圖6)，分別計算橫縱坐標的總數(shù)，可以看出與10個受體大分子結(jié)合時，結(jié)合能最低的活性成分是酯蟾毒配基、沙蟾毒精、遠華蟾毒精；與7個配體小分子結(jié)合時，結(jié)合能最低的核心靶點是MAPK1、EGFR、cyclin D1。結(jié)合能為負值說明受體配體可以自動結(jié)合，負值越大，結(jié)合能力及穩(wěn)定性越好。將對接之后結(jié)合能力較高的配對分子模型導入PyMOL 1.7軟件后，選擇部分結(jié)合能力較高且有代表性的子模型進行可視化處理，如圖7、圖8、圖9。

圖6 對接結(jié)果熱圖注：圖中結(jié)合能數(shù)據(jù)單位為Kcal/mol；綠色、黃色、紅色代表結(jié)合能，綠色-黃色-紅色由淺到深對應的結(jié)合能由高到低，總計中數(shù)值越低對應的紅色條形越高，根據(jù)結(jié)合能越低其結(jié)合能力越強的原則，單體成分結(jié)合能力由強到弱依次是酯蟾毒配基、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、華蟾酥毒基、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈。靶點蛋白結(jié)合能力由強到弱依次是MAPK1、EGFR、cyclin D1、PIK3CA、AR、MDM2、JAK2、MAPK8、AKT1、MTOR。

圖7 酯蟾毒配基與EGFR結(jié)合的棍棒模型和表面模型注：左圖為棍棒模型，其中紅色結(jié)構(gòu)為配體小分子(酯蟾毒配基)，綠色結(jié)構(gòu)為受體大分子(EGFR蛋白)，黑色ARG-932、PRO-937為EGFR上的結(jié)合位點氨基酸殘基(藍色結(jié)構(gòu))編號，2.1為二者之間氫鍵(黃色虛線)兩頭的距離；右圖為表面模型，其中紅色結(jié)構(gòu)為配體小分子(酯蟾毒配基)、灰色結(jié)構(gòu)為受體大分子(EGFR蛋白)。

圖8 酯蟾毒配基與MAPK1結(jié)合的棍棒模型和表面模型注：左圖為棍棒模型，其中藍色結(jié)構(gòu)為配體小分子(酯蟾毒配基)，綠色結(jié)構(gòu)為受體大分子(MAPK1蛋白)，黑色LYS-97、ASP-98為MAPK1上的結(jié)合位點氨基酸殘基(棕色結(jié)構(gòu))編號，2.1、2.6、2.3為二者之間氫鍵(黃色虛線)兩頭的距離；右圖為棍棒模型，其中藍色結(jié)構(gòu)為配體小分子(酯蟾毒配基)、灰色為受體大分子(MAPK1蛋白)。

圖9 沙蟾毒精與MAPK1結(jié)合的棍棒模型和表面模型注：左圖為棍棒模型，其中藍色結(jié)構(gòu)為配體小分子(沙蟾毒精)，綠色結(jié)構(gòu)為受體大分子(MAPK1蛋白)，黑色GLY-20為MAPK1上的結(jié)合位點氨基酸殘基(黃色結(jié)構(gòu))編號，2.2為二者之間氫鍵(黃色虛線)兩頭的距離；右圖為棍棒模型，其中藍色結(jié)構(gòu)為配體小分子(沙蟾毒精)、灰色結(jié)構(gòu)為受體大分子(MAPK1蛋白)。

3 討 論

中藥具有多成分、多靶點、多通路的特點，應用現(xiàn)代化學提取技術(shù)從天然中藥中分離出具有生物活性、針對性較強、性能較好的單體成分是目前的研究熱點。蟾酥中含有眾多的化合物，各自具有豐富的藥理作用。本研究通過文獻檢索結(jié)合生物信息分析的方法，共篩選出7個蟾酥抗惡性腫瘤作用的主要單體活性成分，通過與前10位關(guān)鍵靶點的分子進行對接后發(fā)現(xiàn)，單體成分結(jié)合能力由強到弱依次是酯蟾毒配基、沙蟾毒精、遠華蟾毒精、華蟾酥毒基、蟾毒它靈、華蟾毒它靈、蟾毒靈。相關(guān)研究報告，酯蟾毒配基能作用于不同類型的惡性腫瘤，包括肝癌[12]、結(jié)腸癌[13-14]等。最近也有學者發(fā)現(xiàn)酯蟾毒配基在其他惡性腫瘤中的作用：Zhou等[15]對172種中草藥進行了篩選，發(fā)現(xiàn)酯蟾毒配基是一種重要的抗惡性腫瘤有效成分，可以通過PI3K/AKT和肌動蛋白細胞骨架信號通路體外抑制卵巢透明細胞癌細胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導細胞凋亡；Lu等[16]證實酯蟾毒配基能有效提高人胃癌細胞中B淋巴細胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)/Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated protein X,Bax)的表達，抑制cyclin D1、cyclin E、PI3K、磷酸化AKT、磷酸化糖原合成酶激酶-3β和β-連環(huán)蛋白的表達；高波等[17]從華蟾素注射液中分離的酯蟾毒配基在體外對胰腺癌細胞和胃癌細胞具有良好的抑制作用,該研究還證實其在體內(nèi)對胰腺癌荷瘤裸鼠有顯著的治療效果。有學者對60余種蟾毒內(nèi)酯類化合物進行抗惡性腫瘤作用篩選,發(fā)現(xiàn)沙蟾毒精對惡性腫瘤細胞生長的抑制能力最顯著,在肝癌、肺癌、前列腺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中均具有很好的抗惡性腫瘤活性的作用，其還能促進惡性腫瘤細胞凋亡、抑制惡性腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移[8]。血管生成是惡性腫瘤細胞增殖和存活的重要過程，研究顯示，沙蟾毒精可能通過誘導血管內(nèi)皮細胞周期阻滯及凋亡，在體內(nèi)外發(fā)揮抑制血管生成的作用[9]。后續(xù)研究表明，沙蟾毒精可以通過抑制血管內(nèi)皮生長因子誘導的血管內(nèi)皮生長因子受體2磷酸化，從而抑制血管內(nèi)皮生長因子受體2介導的信號通路，進而干擾血管內(nèi)皮生長因子介導的血管生成，以此證實了沙蟾毒精可能是血管內(nèi)皮生長因子介導的血管生成的特異性抑制劑[10]。研究表明，遠華蟾毒精可能通過阻斷凋亡抑制蛋白通路、活化p53介導的Bax通路誘導結(jié)直腸癌細胞凋亡，并影響到癌細胞的活力[18]。上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換是正常胚胎生長的一個基本過程，但在惡性腫瘤中其可能引起癌細胞的遷移和侵襲。體外細胞實驗和體內(nèi)動物實驗表明，遠華蟾毒精通過PI3K/AKT/ERK/Snail信號通路抑制乳腺癌上皮細胞上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)換的發(fā)生，從而減少癌細胞的遷移和侵襲[19-20]。

本研究對7種蟾毒配基類化合物主要活性成分的作用靶點進行預測，得到相關(guān)靶點194個，其中有41個是抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點。PPI網(wǎng)絡提示Degree值前十的靶點分別是cyclin D1、AKT1、PIK3CA、MAPK1、EGFR、JAK2、MDM2、AR、MAPK8、MTOR；與配體進行分子對接后得到結(jié)合能力最強的受體蛋白是MAPK1、EGFR、cyclin D1。MAPK1屬于MAPK家族，參與細胞增殖、分化、凋亡和癌變等多種生物學功能的調(diào)控，在多種類型的人類惡性腫瘤中表達明顯上調(diào)，例如卵巢癌、非小細胞肺癌、骨髓瘤和胃癌[21]。研究表明，華蟾酥毒基可能通過激活活性氧簇介導的MAPK通路而激活人多發(fā)性骨髓瘤細胞中的Caspase-3，從而發(fā)揮抗惡性腫瘤作用[22]。此外，華蟾素可在一定程度上通過激活Caspase-3活性和抑制淋巴瘤細胞中的MAPK表達來誘導細胞死亡和凋亡[23]。另有學者發(fā)現(xiàn)，蟾蜍靈和華蟾酥毒基通過促進MAPK家族蛋白磷酸化來抑制人腎上腺皮質(zhì)癌細胞分泌醛固酮和皮質(zhì)醇，從而降低類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白的表達，減少類固醇生成因子1與類固醇合成急性調(diào)節(jié)啟動子的結(jié)合，表明蟾蜍靈和華蟾酥毒基可以調(diào)控腎上腺皮質(zhì)激素，這可能有助于減少與腎癌及腎癌合并腎上腺轉(zhuǎn)移相關(guān)的內(nèi)分泌紊亂引起的一系列全身不良反應[24]。蟾毒靈可以激活MAPK蛋白活性以抑制乳腺癌細胞的生長[25]。EGFR及其酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitors，TKIs)的研究為晚期肺癌患者帶來了新的希望。沙蟾毒精通過抑制EGFR及其下游的Raf/MEK/ERK信號通路而增加Bax/Bcl-2的比值,進而導致非小細胞肺癌細胞系PC-9發(fā)生凋亡[26]。此外，蟾毒靈也可以通過EGFR等相關(guān)信號通路抑制人肺癌細胞增殖[27]。然而，耐藥性問題是EGFR靶向治療的重大瓶頸，其中抗凋亡蛋白髓細胞白血病因子-1(myeloid cell leukemia 1,MCL-1)是耐藥細胞對EGFR抑制劑產(chǎn)生耐藥的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。最近的研究表明，MCL-1過表達在EGFR突變型肺癌中介導了奧希替尼(第三代EGFR-TKIs)的耐藥[28]。而蟾毒靈可通過抑制MCL-1的過度表達，消除非小細胞肺癌細胞對奧希替尼的耐藥性[29-30]。與吉非替尼聯(lián)合應用時，蟾毒靈還可以通過抑制原癌基因MET的活性,以此阻斷PI3K/AKT信號通路，起到逆轉(zhuǎn)非小細胞肺癌細胞對EGFR-TKIs耐藥的作用[31]。這表明，聯(lián)合應用蟾毒靈可能是克服非小細胞肺癌細胞對EGFR-TKIs獲得性耐藥的一種有效的補充治療方法。cyclin D1基因已被確立為癌基因，其過度表達可加速多種惡性腫瘤細胞的增殖。研究表明,蟾毒靈能顯著下調(diào)cyclin D1 mRNA表達，誘導膀胱癌細胞發(fā)生G0/G1期阻滯,從而抑制人膀胱癌細胞的增殖[32]。此外，華蟾素可通過降低cyclin D1的表達將胃癌MKN-45細胞的細胞周期阻滯于S期，并且在體外通過降低cyclin D1 mRNA和蛋白表達水平來誘導胃癌MKN-45細胞凋亡[33]。

KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，蟾酥抗惡性腫瘤的關(guān)鍵靶點主要涉及88條信號通路，前20條信號通路包括癌癥信號通路、癌癥中心碳代謝通路、PI3K/AKT信號通路、Ras信號通路等。中心碳代謝是生物體所需能量的主要來源。細胞由分解代謝和合成代謝提供能量，這種分解和合成反應的平衡受到嚴格的調(diào)控，調(diào)控失衡將導致細胞的惡性轉(zhuǎn)化和腫瘤的進展。癌細胞有著獨特的新陳代謝，其中有氧糖酵解(Warburg效應)為最具特征的代謝途徑。李海營[34]發(fā)現(xiàn)華蟾毒它靈可以通過抑制缺氧誘導因子1α介導的Warburg效應，改變肝癌細胞的中心代謝，誘導其凋亡。在生理和病理條件下PI3K/AKT信號通路對細胞的生長和存活都有重要意義,它在人類多種惡性腫瘤中被激活，被認為是很有潛力的治療靶點。盛杰霞等[35]發(fā)現(xiàn)華蟾酥毒基通過誘導PTEN表達,下調(diào)FAK/PI3K/AKT信號通路,可以抑制食管癌細胞的遷移和侵襲。在上文中也提及，遠華蟾毒精[15]、酯蟾毒配基[19-20]在不同惡性腫瘤中可對PI3K/AKT信號通路發(fā)揮作用。Ras相關(guān)信號通路是一個具有多種激活因子和效應因子的復雜信號網(wǎng)絡，能夠調(diào)節(jié)多種細胞功能，如細胞增殖、分化、凋亡和衰老等[36]。蟾毒靈可以降低Ras蛋白表達，抑制相關(guān)信號通路從而抑制耐吉非替尼肺癌細胞的轉(zhuǎn)移[36]。

對接分析的目的是在大分子的背景下說明對接結(jié)果，用整體能量景觀來解釋對接。配體與大分子之間的相互作用是由范德華力、靜電、氫鍵和去溶組分能組成的能量驅(qū)動的。通過對接結(jié)果的可視化，可以更加直觀地將微觀分子狀態(tài)展現(xiàn)出來，并且看到結(jié)合位點、結(jié)合關(guān)系及氫鍵的距離等。最終，通過分子對接和可視化，我們發(fā)現(xiàn)蟾酥主要抗惡性腫瘤單體成分都與MAPK1、EGFR、cyclin D1有較好的結(jié)合能力。

綜上所述，蟾酥中發(fā)揮抗惡性腫瘤作用的主要蟾毒配基類化合物有酯蟾毒配基、沙蟾毒精、遠華蟾毒精等，它們作用于MAPK1、EGFR、cyclin D1等關(guān)鍵蛋白，主要在核質(zhì)、細胞質(zhì)基質(zhì)、細胞核中參與蛋白質(zhì)自我磷酸化、酪氨酸肽基磷酸化等進程作用于癌癥通路、癌癥中心碳代謝、PI3K/AKT信號通路、Ras信號通路等關(guān)鍵信號通路，從而共同發(fā)揮抗惡性腫瘤的作用。這一結(jié)論或可為進一步實驗研究其物質(zhì)基礎和作用機制提供理論依據(jù)。