趙 忠 葉河楊 申小年

（安徽中醫(yī)藥高等專科學(xué)校，安徽 蕪湖 241000）

0 引言

神經(jīng)性病理性疼痛（Neuropathic Pain，NP）是一種常見的由體感神經(jīng)系統(tǒng)損傷或疾病引起的慢性頑固性疼痛，導(dǎo)致患者出現(xiàn)睡眠障礙甚至抑郁，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1]。最近基于聚類分析研究表明，大多數(shù)神經(jīng)性疼痛患者可分為三種感覺表型之一：感覺喪失、機(jī)械痛覺過敏和熱痛覺過敏[2]。傷害性疼痛涉及在不損害神經(jīng)系統(tǒng)的情況下激活傷害感受器，而神經(jīng)性疼痛與中樞或外周神經(jīng)系統(tǒng)的改變有關(guān)。慢性疼痛本身以及從急性疼痛到慢性疼痛的轉(zhuǎn)變可能是由表觀遺傳控制的[3]。感覺表型與神經(jīng)性疼痛狀況對幸福感、日常功能和生活質(zhì)量的影響有關(guān)，但與疼痛強(qiáng)度的相關(guān)性較小。NP 即直接由影響體感系統(tǒng)的病變或疾病引起的疼痛，是一種常見的臨床問題，通常表現(xiàn)為持續(xù)疼痛（灼燒、擠壓）或陣發(fā)性疼痛（電擊樣感覺、刺痛）、誘發(fā)（觸誘發(fā)、壓力誘發(fā)、冷誘發(fā)）或麻木和感覺異常[4]。

花椒因其獨(dú)特的香氣和味道而在中國是一種非常珍貴的香料[5]。不同的成分引起的芳香感覺是不同的，這歸因于與瞬時受體電位通道蛋白V1(TRPV1)、瞬時受體電位通道蛋白A1(TRPA1)的相互作用機(jī)制不同[6]。花椒所含的生物堿類成分主要有茵芋堿（Skimmianine）、青椒堿（Schinifoline）、香草木寧和帕洛平等。羥基α 山椒素（Hydroxy-α-sanshool，HAS）是不飽和脂肪酸酰胺從花椒中提取出來，具有降血脂、降血糖、抗炎、神經(jīng)營養(yǎng)等作用[7]。HAS 通過降低AD 小鼠海馬Cyt-c、Bax 和Caspase 3 的mRNA 和蛋白表達(dá)，增加Bcl-2 的表達(dá)，顯著抑制神經(jīng)元凋亡。因而花椒及其所含生物成分，在NP 疾病的治療中有潛力，但其作用機(jī)理仍然不清楚。基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，本研究的重點(diǎn)是調(diào)控效應(yīng)的機(jī)理，闡明花椒在分子水平上對神經(jīng)性疼痛特異性靶點(diǎn)和分子信號通路的作用，并設(shè)計新的藥物開發(fā)及臨床應(yīng)用。

1 材料和方法

1.1 藥物和疾病相關(guān)效應(yīng)的目標(biāo)獲取

利用數(shù)據(jù)庫TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php）檢索了花椒的化學(xué)成分信息。在UniProt 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/uniprot/）中獲得人類基因靶點(diǎn)。

為了獲得NP 相關(guān)的靶基因，將搜索詞“神經(jīng)病理性疼痛”輸入GeneCard（http: // www.genecards.org）、DrugBank（https://go.drugbank.com/）、OMIM（https://www.omim.org）、PharmGkb（https://www.pharmgkb.org）和TTD（http://db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫。數(shù)據(jù)庫搜索結(jié)果被合并，刪除重復(fù)的目標(biāo)器以獲取所有的目標(biāo)的靶點(diǎn)。

1.2 獲取藥物靶點(diǎn)基因和疾病基因交集圖

利用Venn2.1 軟件，將篩選出的花椒的活性成分對應(yīng)的靶點(diǎn)與NP 靶點(diǎn)對應(yīng)的疾病靶點(diǎn)進(jìn)行交叉，并通過Venn 圖獲得共同的靶點(diǎn)。將預(yù)測目標(biāo)導(dǎo)入String 數(shù)據(jù)庫（https://string-db.org/）以進(jìn)行進(jìn)一步的預(yù)測。

1.3 藥物活性成分的構(gòu)建與疾病

使用Cytoscape3.8.0 軟件生成了活性組件與目標(biāo)之間的相互作用以及靶標(biāo)之間的相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖。用網(wǎng)絡(luò)將藥物名稱、藥物活性成分、藥物與疾病交叉基因靶點(diǎn)及其之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 軟件，構(gòu)建“藥物—化合物—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化分析。

1.4 核心基因篩選

PPI（Protein-Protein Interaction）是指兩個或兩個以上的蛋白質(zhì)分子通過非共價鍵形成蛋白質(zhì)復(fù)合體（Protein complex）的過程。STRING 數(shù)據(jù)庫收集了一個大量的蛋白質(zhì)相互作用，并含有一個數(shù)據(jù)置信范圍低置信值：＜0.4；最低置信度：0.15；中度置信度：0.4；高置信：0.7；最高置信度：0.9。

1.5 GO 和KEGG 富集分析

各種生物信息分析和可視化結(jié)果可以通過軟件R 項目來實(shí)現(xiàn)。首先，獲得核心靶點(diǎn)的Entrez 基因ID 通過RGUI 和組織。然后是GO 函數(shù)富集（分子功能，MF；生物過程，BP；細(xì)胞組分，CC）和KEGG 通路豐富的RGUI，劑量和集群分析器。再設(shè)置pvalue ≤0.05，分析的結(jié)果是選擇了前8 個條目的富集和以條形圖的形式顯示。

2 結(jié)果

2.1 獲取藥物靶點(diǎn)基因和疾病基因交集圖

從數(shù)據(jù)庫中共鑒定出101 個化合物相關(guān)靶點(diǎn)（注：OB≥0）和藥用類（DL≥0）。共獲得1 593 個神經(jīng)病理性疼痛靶基因和花椒336 個成分靶點(diǎn)的112 疾病相關(guān)基因。圖1、圖2 所示。

圖1 神經(jīng)病理性疼痛疾病基因交集Venn 圖

圖2 花椒成分靶點(diǎn)與神經(jīng)性疼痛疾病基因交集的Venn 圖

2.2 花椒活性成分基因靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

為了明確中藥、活性成分和花椒的潛在靶點(diǎn)之間的關(guān)系，用網(wǎng)絡(luò)將藥物名稱、藥物活性成分、藥物與疾病交叉基因靶點(diǎn)及其之間的關(guān)系網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape3.8.0 軟件，構(gòu)建“藥物化合物—靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)行可視化分析，如圖3 所示。

圖3 花椒藥物分子與神經(jīng)性疼痛疾病基因相關(guān)性交接圖

2.3 PPI 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)和核心蛋白網(wǎng)絡(luò)

通過蛋白互作網(wǎng)，發(fā)現(xiàn)NP 的主要靶點(diǎn)為SRC、HSP90AA1、JUN、MAPK3、RELA、AKT1 和ESR1。GO項目數(shù)為2009 項（P＜0.05），其中BP∶1 745 項，CC∶87 項，MF∶177 項。MF 與轉(zhuǎn)錄因子以及一種特異性蛋白相互作用，并表現(xiàn)出良好的抗氧化活性，如圖4 所示。

圖4 蛋白質(zhì)間的相互作用網(wǎng)絡(luò)；潛在治療靶點(diǎn)的核心基因

2.4 GO 和KEGG 富集

為了通過調(diào)節(jié)特定途徑來研究藥物治療中靶點(diǎn)的生物學(xué)效應(yīng)。根據(jù)富集程度篩選前30 繪制柱狀圖。同樣，選擇（P＜0.05）為聚類分析的重要路徑，根據(jù)富集程度篩選前30 繪制柱狀圖和氣泡圖。

GO 分析顯示，發(fā)現(xiàn)了大部分潛在的靶點(diǎn)在BP，其中包括：藥物反應(yīng)、循環(huán)系統(tǒng)中的血管突起、調(diào)節(jié)管徑調(diào)節(jié)血管直徑、管徑調(diào)節(jié)、對脂多糖、對細(xì)菌來源分子的反應(yīng)、血管直徑負(fù)調(diào)節(jié)、多細(xì)胞有機(jī)過程、血管縮小。圖5 是GO 富集分析的前30 十個主要影響通路。

KEGG 富集分析顯示，影響了171 條通路（P＜0.05）。對神經(jīng)病理性疼痛作用顯著的有5 個富集通路，包括：IL-17 信號通路、MAPK（絲裂原活化蛋白激酶）信號通路、ErbB（表皮生長因子受體）信號通路、cGMP-PKG 信號通路、含血清素的神經(jīng)突觸。

IL-17 信號通路： 上調(diào) Casp、NF-κB、AP-1、Hsp90、IKKα、IKKβ、IκBα、MAPKs、ERK、CXCL1、CXCL2、CXCL8、CXCL10、CCL2、COX2、MMP1、MMP3、MMP9、IL-1β、IFN-γ；

MAPK 信號通路：上調(diào)GF、RTK、PKA、PKC、NFκB、Rafl、EKR、E1K-1、c-fos、AP1、CASP、AKT、AP1、HSP27；

ErbB 信號通路：上調(diào)PKC、Src、ErbB-3、Jun、Raf、ERK、Elk、PKB/Akt、GSK-3、E1K、PKB/AKt、GSK-3；

cGMP-PKG 信號通路：上調(diào)GPCR、βAR、Akt、RhoA、Raf-1、ERK；

含血清素的神經(jīng)突觸：上調(diào)SEART、MAO-A、SERT、PKC、ERK、Cox、PKA、PKC、Casp3、ERK、Raf。

3 討論

病理性疼痛包括炎癥性疼痛和神經(jīng)病理性疼痛，這是神經(jīng)元可塑性變化的表現(xiàn)過程。主要關(guān)注疼痛管理藥物在臨床應(yīng)用中的有效性和安全性[8]。由于軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷或疾病，NP 發(fā)展成如此復(fù)雜的疾病，其發(fā)病的全部機(jī)制尚不清楚。神經(jīng)免疫系統(tǒng)的激活有助于神經(jīng)損傷后神經(jīng)性疼痛的誘導(dǎo)和持續(xù)存在。TNF-α/IL-1β介導(dǎo)的NF-κB 活性的激活釋放了多種炎癥介質(zhì)，這可能會導(dǎo)致疼痛加重[9]。外周性和中樞敏感性是疼痛產(chǎn)生的病理基礎(chǔ)，其中細(xì)胞內(nèi)信號通路的激活在其潛在機(jī)制中起著關(guān)鍵作用。外周傷害性感受信號通過傳入神經(jīng)纖維導(dǎo)入脊髓背角，導(dǎo)致興奮性氨基酸和應(yīng)激蛋白的上調(diào)。它導(dǎo)致傷害性神經(jīng)元持續(xù)去極化，并有大量的鈣離子流入。一般來說，MAPK 信號通路涉及多種改變和改變的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。MAPK 是真核細(xì)胞中的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，它不僅參與炎癥和細(xì)胞凋亡，而且在介導(dǎo)神經(jīng)可塑性和神經(jīng)功能方面也至關(guān)重要。這是一個促進(jìn)周圍神經(jīng)和中樞神經(jīng)痛覺過敏形成的過程，這有助于疼痛感覺[10]。MAPK 級聯(lián)包括ERK、JNK/SAPK、p38MAPK 和ERK5。這種平行信號通路與疼痛的形成、維持和增強(qiáng)顯著相關(guān)。p38MAPK 與炎癥密切相關(guān)，是中樞膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生促炎因子的重要途徑，也是干預(yù)疼痛的關(guān)鍵靶點(diǎn)。

4 結(jié)語

花椒是一種常見的中草藥，具有化學(xué)復(fù)雜性和生物功能多樣性的特點(diǎn)，筆者采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的生物信息學(xué)方法來闡明其生物活性成分發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用，并探討其潛在機(jī)制。本研究結(jié)果表明，花椒更適合于血管痙攣、炎癥因子和神經(jīng)交互影響等因素引起的疼痛?；ń返纳锘钚曰瘜W(xué)物質(zhì)及其潛在靶點(diǎn)作為其鎮(zhèn)痛作用的潛在機(jī)制，有利于臨床藥物的開發(fā)和潛在機(jī)制的闡明。